專利名稱：喉癌自發性頸部淋巴結轉移動物模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥動物模型領域；具體地，本發明涉及喉癌自發性頸部淋巴結轉移動物模型。
背景技術：
喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，以鱗狀細胞癌最常見，占95%以上，近年來發病率有上升趨勢，喉癌容易發生局部侵襲和頸部淋巴結轉移，同其他惡性腫瘤患者一樣，喉癌患者多數死于腫瘤復發和轉移，但喉癌侵襲、轉移機制目前尚不清楚，本發明通過建立喉癌自發頸部淋巴結轉移模型，篩選出高侵襲性喉癌細胞，為研究喉癌侵襲、轉移機制奠定基礎。
發明內容
本發明涉及一種喉癌自發性頸部淋巴結轉移動物模型，該動物模型的建立方法以及獲得高轉移性喉癌細胞的方法。在一個實施方案中，本發明涉及一種喉癌細胞系在制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型中的用途。在一個實施方案中，本發明涉及一種喉癌細胞系在制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型中的用途，其中所述喉癌細胞系是喉鱗癌細胞系。在一個實施方案中，本發明涉及一種喉癌細胞系在制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型中的用途，其中所述喉癌細胞系是人喉鱗癌細胞系HEP-2。在一個實施方案中，本發明涉及一種喉癌細胞系在制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型中的用途，其中所述喉癌細胞系是人喉鱗癌細胞系HEP-2，其中所述非人動物是小鼠。在一個實施方案中，本發明涉及一種喉癌細胞系在制備產生高轉移性喉癌細胞的試劑盒中的用途，其中所述高轉移性喉癌細胞比所述喉癌細胞系具有更高的轉移性，所述試劑盒中還包含培養基、麻醉劑等。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物非人動物舌部成瘤、消瘦漸臨死亡時,處死非人動物,取非人動物頸部腫大淋巴結；
(C)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物非人動物 舌部成瘤、消瘦漸臨死亡時,處死非人動物,取非人動物頸部腫大淋巴結；
(C)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤；
其中所述喉癌細胞系是喉鱗癌細胞系。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物非人動物舌部成瘤、消瘦漸臨死亡時,處死非人動物,取非人動物頸部腫大淋巴結；
(C)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤；
其中所述喉鱗癌細胞系是是人喉鱗癌細胞系HEP-2。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于裸小鼠舌緣粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死裸小鼠，取裸小鼠頸部腫大淋巴結；
(c)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于裸小鼠舌緣粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死裸小鼠，取裸小鼠頸部腫大淋巴結；
(c)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤；
其中所述喉癌細胞系是是人喉鱗癌細胞系HEP-2。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備高轉移性喉癌細胞的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死非人動物，無菌取非人動物頸部腫大淋巴結，分離并培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
(C)將所述轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞重復接種到非人動物舌部，如步驟(b)中所述分離、培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
Cd)任選地重復(C)步驟一次或多次；
Ce)篩選出高轉移性喉癌細胞，驗證所獲喉癌細胞源于親本細胞系；
其中所述高轉移性喉癌細胞比(a)中所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備高轉移性喉癌細胞的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死非人動物，無菌取非人動物頸部腫大淋巴結，分離并培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
(C)將所述轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞重復接種到非人動物舌部，如步驟(b)中所述分離、培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞； Cd)任選地重復(C)步驟一次或多次；(e)篩選出高轉移性喉癌細胞，用PCR檢測來驗證所獲喉癌細胞源于親本細胞系；
其中所述高轉移性喉癌細胞比(a)中所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備高轉移性喉癌細胞的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下；
(b)待非人動物舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死非人動物，無菌取非人動物頸部腫大淋巴結，分離并培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
(C)將所述轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞重復接種到非人動物舌部，如步驟(b)中所述分離、培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
Cd)任選地重復(C)步驟一次或多次；
(e)篩選出高轉移性喉癌細胞，通過PCT檢測人特異性Alu序列來驗證所獲喉癌細胞源于親本細胞系；
其中所述高轉移性喉癌細胞比(a)中所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。在一個實施方案中，本發明涉及一種制備高轉移性喉癌細胞的方法，其包括如下步驟:
(a)將喉癌細胞系接種于裸小鼠舌緣粘膜下；
(b)待裸小鼠舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死裸小鼠，無菌取裸小鼠頸部腫大淋巴結，分離并培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
(c)將所述轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞重復接種到裸小鼠舌部，如步驟(b)中所述分離、培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞；
Cd)任選地重復(C)步驟一次或多次；
(e )篩選出高轉移性喉癌細胞，通過PCT檢測人特異性Alu序列來驗證所獲喉癌細胞源于親本細胞系；
其中所述高轉移性喉癌細胞比(a)中所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。除非本文另有定義，本發明相關使用的科學和技術術語具有本領域普通技術人員通常理解的含義。而且，除非上下文有其它規定，單數形式的術語應當包括復數，而復數形式的術語應當包括單數。通常，與本文所述的細胞和組織培養、分子生物學及免疫學相關使用的命名以及技術，是本領域眾所周知且普遍使用的那些。除非另有說明，下面的術語應當理解為具有下述含義:
術語“非人動物”是指除智人iHomo sapiens)物種以外的其他任何模式動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗、大猩猩、黑猩猩等。術語“高轉移性喉癌細胞”是指通過本發明獲得的比接種于非人動物舌緣粘膜下所用的喉癌細胞系具有更高的轉移性的喉癌細胞。
圖1是裸小鼠舌部成瘤和頸部腫大淋巴結示意圖。圖2圖示了裸 小鼠舌部和頸部淋巴結病理切片結果。圖3圖示了裸小鼠喉癌淋巴結轉移模型獲得的高轉移性喉癌細胞。實施例在以下實施例中進一步描述本發明，所述實施例示出了實施本發明的簡要方法，但不限定其所有可能變型。縮寫含義如下:“min”表示分鐘，“U”表示單位，Mg”表示微克，“g”表示克，“μ ”表示微升，“ml”表示毫升，“bp”表示堿基對。實施例1
喉鱗狀細胞癌自發性頸部淋巴結轉移動物模型的建立
本實施例所用實驗動物如下:Bal/Bc裸小鼠，約4周齡，12-14g，雌雄不限(解放軍軍事醫學科學院動物所提供)，其實驗和飼養均在無特異性病原菌(specific pathogen free，SPF)、恒溫(20-26°C )、恒濕(45%-50%)條件下的超凈層流架中進行，滅菌水和滅菌飼料供動物自由攝入。本實施例所用喉鱗癌細胞如下:人喉鱗癌細胞HEP-2細胞系由北京協和醫科大學基礎醫學細胞中心提供。HEP-2細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于370C，5%C02恒溫培養箱中培養，穩定傳代3-4代后，取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，無菌生理鹽水調整細胞密度為1.5 XlOVml備用，臺盼藍染色確定活細胞數在95%以上。按35mg/kg體重腹腔注射1.25%戊巴比妥鈉麻醉裸小鼠，成功麻醉后，應用50ul微量注射器，于每只裸小鼠舌緣粘膜下注射IOul細胞懸液，每次接種20只。隨機選出兩只裸小鼠不做任何處理作為對照。密切觀察裸小鼠生長狀態。待裸小鼠舌部成瘤，消瘦、瀕臨死亡時，處死裸小鼠，取舌部腫物及腫大的頸部淋巴結，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，常規HE染色，光鏡下觀察裸小鼠舌部成瘤和頸部淋巴結腫瘤轉移情況。舌部成瘤和頸部腫大淋巴結的肉眼觀察結果如下:裸小鼠舌緣粘膜下注射腫瘤細胞后約4周后，裸小鼠舌部明顯成瘤，進食困難，身體消瘦、瀕臨死亡，處死裸小鼠，無菌條件下解剖頸部，可見一至數枚腫大淋巴結。舌部成瘤和頸部腫大淋巴結的病理結果如下:將實驗組裸小鼠舌部腫物和腫大的淋巴結及對照組裸小鼠正常舌部和正常淋巴結全部收集，進行常規HE染色，普通光學顯微鏡下觀察舌部成瘤和淋巴結腫瘤轉移情況。結果顯示，實驗組裸小鼠舌緣粘膜下形成實體腫瘤，呈球形，喉癌細胞彌漫排列，體積較大，形態多樣，核分裂異常。腫大淋巴結經染色后鏡下觀察，可見腫瘤細胞彌漫性浸潤，正常淋巴結內部結構破壞(見圖1 )。實施例2
轉移到淋巴結的喉癌細胞的培養一高轉移性喉鱗癌細胞的獲得如實施例1中所述將人喉鱗癌細胞HEP-2細胞系注射于每只裸小鼠舌緣粘膜下，待裸小鼠消瘦瀕臨死亡時，處死裸小鼠，超凈工作臺內無菌取頸部淋巴結，150目篩網上剪碎淋巴結，PBS收集細胞，離心，含10%胎牛血清DMEM (青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml)培養液重懸細胞，常規培養于37°C、5% CO2培養箱內。將所得的轉移到淋巴結的喉癌細胞培養物重復接種，同樣方法獲得易轉移到淋巴結的喉癌細胞。兩次接種成瘤情況及淋巴結轉移比例見圖2和表1。表權利要求
1.一種喉癌細胞系在制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中所述喉癌細胞系是喉鱗癌細胞系。
3.根據權利要求2的用途，其中所述喉鱗癌細胞系是人喉鱗癌細胞系HEP-2。
4.根據權利要求1的用途，其中所述非人動物是小鼠。
5.一種喉癌細胞系在制備產生高轉移性喉癌細胞的試劑盒中的用途，其中所述高轉移性喉癌細胞比所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。
6.一種制備喉癌自發性淋巴結轉移非人動物模型的方法，其包括如下步驟: (a)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下； (b)待非人動物舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死非人動物，取非人動物頸部腫大淋巴結； (C)應用病理學方法鑒定舌部腫物及頸部腫大淋巴結是否為腫瘤細胞浸潤。
7.一種制備高轉移性喉癌細胞的方法，其包括如下步驟: Ca)將喉癌細胞系接種于非人動物舌緣粘膜下； (b)待非人動物舌部成瘤、消瘦瀕臨死亡時，處死非人動物，無菌取非人動物頸部腫大淋巴結，分離并培養轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞； (C)將所述轉移到頸部淋巴結的喉癌細胞重復接種到非人動物舌部，如步驟(b)中所述，分離、培養轉移 到頸部淋巴結的喉癌細胞； Cd)任選地重復(C)步驟一次或多次； Ce)篩選出高轉移性喉癌細胞，驗證所獲喉癌細胞源于親本細胞系； 其中所述高轉移性喉癌細胞比(a)中所述喉癌細胞系具有更高的轉移性。
8.根據權利要求7的方法，其中所述步驟(e)中驗證所獲喉癌細胞的方法是PCR檢測。
9.根據權利要求8的方法，其中所述PCR檢測是PCT檢測人特異性Alu序列。
全文摘要
本發明涉及一種喉癌自發性頸部淋巴結轉移動物模型，該動物模型的建立方法以及獲得高轉移性喉癌細胞的方法。
文檔編號C12N5/09GK103215224SQ20121001706
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者劉明波, 陳立偉, 王嘉陵 申請人:中國人民解放軍總醫院