一種尾葉紫薇微衛星dna分子標記及應用的制作方法

專利名稱：一種尾葉紫薇微衛星dna分子標記及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及DNA分子標記技術，具體地說，涉及一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記及其應用。
背景技術：
尾葉紫薇(Lagerstroemia caudata),屬千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬落葉大喬木，高18 30米，胸徑約40厘米；樹皮光滑，褐色，成片狀剝落；全株無毛；花期4-5月，果期7-10月。尾葉紫薇開花繁密，香味濃郁，是培育芳香紫薇品種的優良親本。其在石灰巖石山稍蔭蔽的山坡上生長良好，萌蘗力較強，是石灰巖石山優良綠化樹種之一。同時，尾葉紫薇木材堅硬、紋理細致，淡黃色，適于作上等家俱、室內裝修、細工或雕刻等用材。尾葉紫薇原產于我國，已被列為瀕危植物(《中國物種紅色名錄》第一卷，高等教育出版社，2004)。目前僅有關于尾葉紫薇單一種群結構的研究(黃晨暉等，2008，尾葉紫薇種群結構和動態的初步研究，熱帶林業，36 (4)，24 26)，而關于尾葉紫薇資源分布、種群遺傳多樣性和種質資源保護等方面的研究尚未見報道。簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)，也稱微衛星DNA (microsatellite)，是一種由2 5個核苷酸為單位多次串聯重復的長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上，每個座位重復單位的數量可能不完全相同，因而形成多態性。由于其具有多態性豐富、重復性高、共顯性遺傳等優點，被廣泛應用于植物的群體和進化遺傳研究、種質資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等領域。因此，開發尾葉紫薇微衛星標記，利用其研究尾葉紫薇資源遺傳多樣性和種群結構，對尾葉紫薇種質資源的保護和利用具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記。本發明的另一目的是提供上述DNA分子標記的篩選方法。本發明更進一步的目的是提供上述DNA分子標記在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其中擴增所述分子標記的引物為如下引物對12HF : 5' -AAAGACGCAGAAGGATGG-3'I2HR:5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'前述的DNA分子標記，其編號為I2H的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。本發明的一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法，其包括以下步驟
(I)提取尾葉紫薇基因組DNA，用內切酶Rsa I進行酶切，得到大小為300 IOOObp 的 DNA 片段;(2)將寡核苷酸 SuperSNX24F (5 ’ -GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3 ’)和末端磷酸化的 SuperSNX24R(5’ -pGAITCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’ )等摩爾混合，形成接頭；(3)將步驟(2)的接頭與步驟(I)的酶切產物連接；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產物為模板，進行PCR反應，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3’ Biotin標記的探針20種，將其按照要求[Group2 = (AG)12, (TG)12,(AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6,(ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8]等體積混合(所有探針濃度均為100 u M)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)三組探針進行雜交；(7)向雜交后的溶液中加入磁珠，洗滌磁珠；(8)向洗滌后的磁珠中加入TE，得到含有微衛星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F為引物，步驟(7)的上清液為模板，進行PCR反應，得到目的片段；(10)將步驟⑶的擴增產物轉化至大腸桿菌中，篩選轉化子，進行PCR擴增，對產物大小為500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛星序列，其中包含微衛星位點60個；(11)根據微衛星位點兩端的側翼序列設計引物并以8株尾葉紫薇個體基因組DNA為模板進行SSR-PCR擴增，得到尾葉紫薇微衛星標記15個，其編號分別為I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQID No. I 至 SEQ ID No. 15 所示。利用本發明的尾葉紫薇微衛星DNA分子標記分析尾葉紫薇個體間的遺傳學差異，具體分析方法為(I)分別對 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取尾葉紫薇不同個體的基因組DNA ；(3)分別用標記后的 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20株尾葉紫薇的基因組DNA。所述特異性引物的序列分別為IlGF :5' -joeGTCACAGGTTACCGAATC-3'IlGR :5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3'I2BF =5' -6_famTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 '
12BR : 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3'12GF : 5' -J0ETTCTTCCACTTCCTCCTT-3'
12GR : 5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3'12HF : 5' -6_famAAAGACGCAGAAGGATGG-3 '12HR : 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'
13GF : 5' -6_famATGTGGTGAATGGGAACT_3 '13GR : 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3'I9HF:5' -6_famGGACCAGATTGTAAATGC-3 '19HR : 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3'IlOHF :5' -joeATTCGATCTGCCCTCTTG-3'IlOHR :5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3'112HF : 5'-讓TCCCTTTAACGAGGAATG-3'
112HR : 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3'IIlCF :5' -joeGTGCTGGAGGAACTGCTA-3'IIlCR :5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3'II2CF :5'-讓TTTGGTGGTAGTGGGAGT-3'II2CR :5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3'II3AF :5' -6-famCCTAACAAGAAAGGAACAG_3'II3AR :5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3'II3HF :5' -joeCCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3'II3HR :5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3'II6AF :5' -6_famAGTTACTTATCTCCGCATTC_3'II6AR :5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3'II8AF :5' -J0EAAGATATGCTGTTGAGTTT-3'II8AR :5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3'II12AF:5,-讓 CAACAGTAAAATTGGAGC-3'II12AR :5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3'(4)分析PCR產物以及尾葉紫薇DNA多態位點的特征。本發明的優點在于，提供了 15個尾葉紫薇的微衛星位點及擴增該15個微衛星位點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛星DNA分子標記技術體系，并利用這些標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種，重復性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。


圖I為本發明IlG位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖2為本發明I2B位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖3為本發明I2G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖4為本發明I2H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖5為本發明I3G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖6為本發明I9H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖7為本發明IlOH位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖8為本發明I12H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖9為本發明IIlC位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖10為本發明II2C位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖11為本發明II3A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖12為本發明II3H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖13為本發明II6A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖14為本發明II8A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖15為本發明II12A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；其中，圖I 圖15中1 20分別表示20個不同的尾葉紫薇單株，橫坐標代表擴增產物大小，縱坐標代表擴增強度。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I尾葉紫薇微衛星文庫的構建包括如下步驟(I)提取尾葉紫薇基因組DNA (DNA secure Plant Kit,購自天根生物)，用內切酶Rsa I和Xmn I進行酶切，酶切體系為2. 5 y L連接緩沖液(NEB)，0. 25 y L 100 XBSA (NEB),0. 25u L NaCl (5M)，I u LRsa I (NEB)，I u LXmn I (NEB), 20 u L DNA (100ng/L)，于 37。。，酶切40小時，得到大小為300 IOOObp的DNA片段； (2)將 10 ii M 寡核苷酸 SuperSNX24F (5 ’ -GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3 ’)和末端磷酸化的 SuperSNX24R(5’ -pGAITCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’ )等體積混合，95°C變性10分鐘，緩慢冷卻至室溫，形成接頭；(3)將步驟⑵的接頭7 U L、T4DNA連接酶(NEB) 2 ii L和10 X連接緩沖液I U L混合后，加入到(I)的酶切產物中，22°C連接2小時后，置于4°C連接40小時以上；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產物為模板，進行PCR反應，體系為 2.5iiL 10 X PCR 緩沖液，2. 5 ii L BSA, I. 3u L SuperSNX24F (10 u M), I. 5 u L dNTPs (各2. 5mM)，2 ii L MgCl2 (25mM), 13u L dH20,0. 2 u L Taq 酶(5U/ u L), 2 u L 連接產物，反應程序為 95°C 2min ；95°C 20sec,60°C 20sec，72°C I. 5min，35 個循環反應；15°C保溫。用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，分為三組,分別按照[Group2 = (AG)12,(TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6,(AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8,(AGAT)8]等體積混合(所有探針濃度均為100 PM)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)的三組探針進行雜交；雜交過程為將25 u L 2 X雜交溶液(12XSSC，0.2% SDS)，10 y L生物素標記的一組探針，10 y L步驟(4)的DNA片段，5 u L dH20混合，在PCR儀中進行雜交；雜交程序為95°C 5min,然后迅速降溫到70°C，再以0. 040C /sec的速率降溫到50°C，然后在50°C保溫lOmin，再以0. 1°C /sec的速率降溫到40°C，最后迅速降溫到15°C保溫；(7)加入 5O ii L 平衡后的磁珠(10mg/mL, Dynabeads M-280, Invitrogen),室溫輕搖30分鐘，使磁架分離，去除溶液；(8)用 400 ii L Wl 洗液(2 X SSC, 0. I % SDS)的清洗磁珠 2 次，棄溶液；用 400 u LW2洗液(I X SSC, 0. I % SDS)清洗磁珠2次，棄溶液；加入400 u LW2洗液，40。。輕搖2分鐘，棄溶液；加入400 ii L W2洗液，50°C輕搖2分鐘，棄溶液；加入400 u LW2洗液，45°C輕搖2分
鐘，棄溶液；(9)重復步驟⑶一次；(10)加入200iiL TE，95°C保溫5分鐘，磁架分離后，得到含有微衛星DNA片段的
上清液；(11)以SuperSNX24F為引物，步驟(10)的上清液為模板，按照步驟⑷的反應體系和反應程序進行PCR反應，得到目的片段；
(12)將步驟(11)的擴增產物連接到 pCR2. l-T0P0(Invitrogen TOPO CloningKit)載體上，然后將連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，將轉化菌液涂布在含有50 V- g/mL氨節青霉素和40mg/mL X-gal的LB固體培養基平板上進行藍白斑篩選。實施例2含尾葉紫薇微衛星序列的陽性克隆的篩選、測序以及尾葉紫薇微衛星引物的設計包括如下步驟(I)用牙簽挑取72個白色菌落并接種到含50 U g/mL氨芐青霉素的LB培養基中，370C，150rmp培養40小時。以菌液為模板，進行PCR反應；PCR 反應體系為2. 5 ii L 250 u g/mL BSA,2. 5u L 10 X PCR 緩沖液，I y L IOmM 引物 M13F :5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’，I u L IOmM 引物 M13R : 5 ’-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ’，2u L25mM MgCl2,1. 5 u L 2. 5mM dNTP，0. 2 u LTaqDNA 聚合酶，I. 5u L 菌液，12. 8u L dH20 ;反應程序95°C 3min ；95°C 20sec,50°C 20sec,72°C I. 5min，35 個循環反應；15°C保溫；(2)用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，選取PCR條帶單一，產物大小為500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛星序列，其中包含微衛星位點60個；(3)根據微衛星位點兩端的側翼序列設計引物并以8株尾葉紫薇個體基因組DNA為模板進行SSR-PCR擴增，10 ii L反應體系為包括IOng基因組DNA，I X PCR緩沖液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 y M)，MgCl2 (I. 5禮)，正、反向引物(各0.5iiM)，Taq酶(0. 5U)，反應程序為95 °C 3min ；95 °C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30個循環反應；72°C 5min，15°C保溫。將各PCR產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測各引物多態性，篩選出非特異性條帶擴增少、結果穩定、多態性豐富的微衛星標記 15 個，分別為 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. I 至 SEQ ID No. 15 所示。實施例3利用尾葉紫薇微衛星DNA分子標記分析尾葉紫薇不同個體間的遺傳學差
巳
升具體分析方法為(I)分別對 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；⑵提取尾葉紫薇不同單株的基因組DNA (DNA secure Plant Kit,購自天根生物)；(3)分別用 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、118A、II12A位點的特異性引物，擴增20個尾葉紫薇個體的基因組DNA。10 y L反應體系為包括 IOng 基因組 DNA，I XPCR 緩沖液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各250 u M)，MgCl2 (I. 5mM)，正、反向引物(各 0. 5 ii M)，Taq 酶(0. 5U)，反應程序為 95°C 3min ；95°C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30 個循環反應；72°C 5min，15°C保溫；
所述特異性引物的序列分別為IlGF :5' -joeGTCACAGGTTACCGAATC-3'IlGR :5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3'12BF : 5' -6_famTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 '12BR : 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3'12GF : 5' -joeTTCTTCCACTTCCTCCTT-3 'I2GR :5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3'12HF : 5' -6_famAAAGACGCAGAAGGATGG-3 '12HR : 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'13GF : 5' -6_famATGTGGTGAATGGGAACT-3 '13GR : 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3'I9HF : 5' -6_famGGACCAGATTGTAAATGC-3 '19HR : 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3'IlOHF :5' -joeATTCGATCTGCCCTCTTG-3'IlOHR :5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3'112HF : 5' -6_famTCCCTTTAACGAGGAATG-3 '112HR : 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3'IIlCF :5' -joeGTGCTGGAGGAACTGCTA-3'IIlCR :5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3'II2CF :5' -6-famTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3'II2CR :5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3'II3AF :5' -6-famCCTAACAAGAAAGGAACAG-3'II3AR :5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3'II3HF :5' -joeCCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3'II3HR :5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3'II6AF :5' -6-famAGTTACTTATCTCCGCATTC-3'II6AR :5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3'II8AF :5' -joeAAGATATGCTGTTGAGTTT-3'II8AR :5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3'II12AF:5, -6-famCAACAGTAAAATTGGAGC-3 'II12AR :5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3'所述特異性弓丨物的退火溫度分別為50°C、50°C、50 V、50°C、50 V、50°C、50 V、50。。、52。。、54。。、52。。、60。。、48。。、52。。、54。。。(4)將PCR產物用ABI377遺傳分析儀(Applied Biosystem公司)進行STR基因分型，使用GeneMapper 4. 0軟件(Applied Biosystem公司)判讀等位基因的具體數值；(5)使用Popgen I. 32計算期望雜合度、觀察雜合度、多態信息量的值來描述尾葉紫薇DNA多態位點的特征,結果如表I所示表115個尾葉紫薇微衛星多態位點的特征
權利要求
1.一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其特征在于，其為如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
2.擴增權利要求I所述DNA分子標記的引物對，所述引物對為 I2HF:5' -AAAGACGCAGAAGGATGG-3'和I2HR:5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3'。
3.權利要求I所述的DNA分子標記在尾葉紫薇篩選或輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種尾葉紫薇微衛星DNA分子標記，其包括15個尾葉紫薇的微衛星位點。本發明還提供了該尾葉紫薇微衛星DNA分子標記的篩選方法及其在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應用。此外，本發明還提供了擴增該15個尾葉紫薇微衛星位點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛星DNA分子標記技術體系，并利用這些標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助育種，重復性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK102634513SQ20121001990
公開日2012年8月15日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者孫明, 宋平, 張啟翔, 潘會堂, 王學鳳, 田苗, 程堂仁, 蔡明 , 高亦珂 申請人:北京林業大學