專利名稱：用于基因擴增法快速檢測遲緩愛德華氏菌的引物的制作方法
用于基因擴增法快速檢測遲緩愛德華氏菌的引物技術領域
本發明屬于微生物檢測技術領域，具體涉及用于基因擴增法快速檢測遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的引物及其應用。
背景技術：
E. tarda是革蘭氏陰性短桿菌，愛德華氏菌屬，由Hoshina在1962年首次報道， 是當前水產養殖業中的有著極大危害的病原菌之一。該菌的宿主范圍非常廣泛，除可以感染多種魚類外，也有感染兩棲類、爬行類和哺乳類(包括人在內)的報道。因此，為了對 E. tarda進行及時診斷、監控和防治，建立一種快速、準確、簡便的E. tarda檢測技術就具有重要意義。
常規細菌鑒定方法包括對病原形態、生理生化水平及蛋白質水平等的鑒定，但由于檢測靈敏度不高，測試項目較多和費時費力等缺點，不能滿足快速檢測的要求。近年來隨著分子生物學、生化技術的快速發展，新的E. tarda的檢測方法得到了應用。Chen等 (1998)、Sakai 等 Q007)、Lan 等 Q008)分別建立了基于 hemolysin、fimbrial, gyrB 基因的polymerase chain reaction(PCR)檢測技術，白方方等O009)建立了 E. tarda的間接 ELISA檢測方法，Castro等Q010)對以上已報道的PCR方法檢測E. tarda特異性進行了比較，結果發現針對fimbriall型基因簇中的etfD基因設計的引物具有較好的特異性，對所檢測的53株E. tarda結果均為陽性。以上方法較傳統的細菌常規鑒定具有快速、特異等優點，但以上方法在應用中受到諸如制備抗原及抗體、需要PCR儀和凝膠電泳等專用設備的制約，在生產中不能得到普及應用。
環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術是 Notomi等O000)發明的一種基因等溫擴增技術，該技術針對靶基因序列的6個特異部位設計4條引物(F3、B3、FIP和BIP)并利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在等溫條件下實現高效擴增，具有高特異性、高靈敏和快速反應的特點，已成為病原快速檢測的重要工具。 Nagamine等^00 進一步發展了基因等溫擴增技術，在原來4條引物的基礎上，另添加一對也可啟動鏈置換DNA合成的LOOP環引物LF和LB，從而有效提高反應速度。在E. tarda 檢測領域，Savan等Q004)首次報道了用LAMP技術檢測E. tarda的方法，該方法中根據溶血素基因設計了 4條引物，對反應溫度和時間的優化結果分別為65°C和45min，應用結果表明可有效檢測日本鰻鱺等4種水產動物及養殖水體中分離出的5株E. tarda。但目前尚沒有利用6條引物，進行基因等溫擴增技術檢測E. tarda的相關研究報道，國內也沒有用該技術檢測E. tarda的報道。發明內容
本發明的目的是提供用于基因擴增法快速檢測E. tarda的引物及其應用。首先通過生物信息學手段，針對E. tarda核苷酸序列具有種間保守及科、屬間特異的區域作為引物組的設計區間。所述的核苷酸序列為該菌的hrB基因區間(964658-965302bp)和溶血素激活因子HlyB域蛋白基因HlyB核苷酸上游序列(991096_991785bp)。引物設計中采用 GenBank登記號為CP001135. 1的核苷酸序列為基礎設計出6套引物組，其中三套引物組設計于hrB核苷酸序列，另三套設計于HlyB核苷酸上游序列。每套引物組包含有6條引物， 記為引物1、2、3、4、5和6。
設計于hrB基因區間的引物記為第一、二和三套
第一套引物設計如下
引物1 設計區間為964658-96469^3ρ，引物長度為；
引物2 設計區間為964841-964897bp，引物長度為；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為964672-96472^p，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 964713-964769bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為964750-964807bp，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 964814-964867bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為964694-96474^ρ，引物長度為；
引物6 設計區間為964790-96484^ρ，引物長度為20±^ρ。
第二套引物設計如下
引物1 設計區間為964687-964740bp，引物長度為；
引物2 設計區間為964865-964918bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964704-964759bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 964748-9648(^bp，引物長度為 20 士 5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964788-964844bp，引物長度為20士^p ；序列2的設計區間為 964839-964895bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為9647M-964780bp，引物長度為；
引物6 設計區間為964807-96486;3bp，引物長度為20±^p。
第三套引物設計如下
引物1 設計區間為965001_965054bp，引物長度為；
引物2 設計區間為965159-965212bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為965018-96507;3bp，引物長度為；序列2的設計區間為 965058-965115bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為965088-965144bp，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 965134-965190bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為965036_965091bp，引物長度為；
引物6 設計區間為965107-96516^3ρ，引物長度為20±^ρ。
設計于HlyB基因的上游序列區間的引物記為第四、五和六套
第四套引物設計如下
引物1 設計區間為991116-991171bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為991136-991194bp，引物長度為20 士 5bp ；序列2的設計區間為 991176-991233bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991223-99U80bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991265-991320bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為991157_991213bp，引物長度為20士5bp ；
引物6 設計區間為991243_9913(^bp，引物長度為20±^p。
第五套引物設計如下
引物1 設計區間為991096_991152bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為991116-99117Ibp，引物長度為20 士 5bp ；序列2的設計區間為 991176-991233bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991223-99U80bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991265-991320bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為991136-991198bp，引物長度為20士5bp ；
引物6 設計區間為991243-991^^ρ，引物長度為20±^ρ。
第六套引物設計如下
引物1 設計區間為991531_991586bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991729-991785bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991561-99161^ρ，引物長度為；序列2的設計區間為 991601-991660bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991661-991719bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 991712-991766bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為991579-99163^ρ，引物長度為；
引物6 設計區間為991686_991744bp，引物長度為20±^p。
上述的一套引物，其引物序列分別為SEQ ID NO 1 6。
作為第1套引物的替代，第2套引物的序列分別為SEQ ID NO :7 12 ；
第3套引物的序列分別為SEQ ID NO :13 18 ；第4套引物的序列分別為SEQ ID NO 19 24 ；第5套引物的序列分別為SEQ ID NO 25 30 ；第6套引物的序列分別為SEQ ID NO 31 36。
與本發明的引物設計區間所涵蓋的序列的相似性不低于90%的其他來源的序列與本發明的引物序列相符，可用于基因擴增法快速檢測E. tarda。
本發明的引物用于非疾病的診斷和治療目的中的E. tarda的檢測，包括用于制作檢測試劑或試劑盒產品，用于開展E. tarda及其成分存在狀況的分析、檢疫和流行病學監測，用于進行環境、水體、飼料、工具的檢測，用于對非患病動物受精卵、苗種、幼體、成體、親本中可能存在的E. tarda進行檢測，用于在飼料銷售、藥品銷售、苗種銷售、疫苗接種等非疾病診斷目的的服務中附帶進行樣品檢測。
本發明引物在檢測E. tarda中的體系包括有如下兩種
體系1 包含引物1和引物2各0. 1-0. 3μΜ、引物3和引物4各1.2-2. 0yM、dNTP 每種1. 1-1. 7mM、Mg2+4-12mM、具有鏈替代活性的DNA聚合酶1-16U和經95°C變性后的待檢樣品DNA模板IO1-IO7拷貝的1-100 μ L反應體系中。該體系中還可以包含引物5和引物6 各0.6-1.(^] ，甜菜堿1.0-1.4]\1、111^8-!1(1 5_50mM、KCl 2_20mM、(NH4) 2S04 6-15mM 和曲拉通 X-1000. 02-2%，pH 值為 7-10。
體系2 1 對引物各 0. 1-0. 6 μ M、dNTP 每種 0. 1-0. 3mM、Mg2+l_4mM、耐熱 DNA 聚合酶1-8U和待檢DNA模板IO1-IO7拷貝的1-100 μ L反應體系，體系中通常還含有1Tris-HCl 5-20mM、KCl 30_70mM，pH值為7_10。上述的1對引物為引物1和引物2，或者引物5和引物6。
上述的體系1的基因擴增反應為55-67 V保溫40min-lh，再經80 V保溫 5-10mino
上述的體系2的基因擴增反應為94°C保溫4-lOmin，1個循環；94°C保溫20_30s， 50-60°C保溫 20-30s，70_73°C保溫 20_30s，25-40 個循環；70_73°C保溫 3-lOmin，1 個循環。
上述的dNTP為dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等量混合物。
本發明所提供的用于基因擴增法快速檢測E. tarda的引物具有如下的優點
1)檢測時間短、靈敏度高所提供引物可在40min的反應時間即可檢測出10拷貝的目的基因；
2)特異性強引物設計于具有種間保守及科、屬間特異的hrB基因區間和HlyB 核苷酸上游序列，其中以4或6條特異引物組的檢測是分別根據核苷酸序列中的6或8個不同區域設計，提高了檢測特異性；
3)操作簡單，儀器設備要求低所提供引物在檢測過程中也可僅需提供恒溫條件即可完成，并能通過在反應產物中加入核酸熒光染料STOR Green或GeneFinderTM或金屬離子指示染料鈣黃綠素等，即可對檢測結果進行判斷。
總之，本發明所提供的引物為可對E. tarda進行簡便、快速、特異和靈敏的檢測， 其應用方法也具有很強的實用性，適用于基層現場快速診斷。
具體實施方式
根據NCBI登記號為CP001135. 1中的兩段具有種間保守及科、屬間特異的的不同核苷酸區域序列，采用在線軟件(httpV/primerexplorer. jp/e/)設計得到用于檢測 E. tarda的引物，其中三套引物來自hrB核苷酸序列，另三套引物來自溶血素激活因子 HlyB域蛋白基因HlyB核苷酸上游序列，每套引物包括有6條引物，分別計為引物1、2、3、4、 5和6。各套引物的寡聚核苷酸序列設計區間要求如下8
設計于hrB基因區間的三套引物設計區間為
第一套引物
引物1 設計區間為964658-96469^3ρ，引物長度為；
引物2 設計區間為964841-964897bp，引物長度為；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為964672-96472^p，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 964713-964769bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為964750-964807bp，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 964814-964867bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為964694-96474^ρ，引物長度為；
引物6 設計區間為964790-96484^ρ，引物長度為20±^ρ。
第二套引物
引物1 設計區間為964687_964740bp，引物長度為；
引物2 設計區間為964865-96491^ρ，引物長度為；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40 士 IObp ；序列1的設計區間為964704-964759bp，引物長度為20 士 ^p ；序列2的設計區間為 964748-9648(^bp，引物長度為 20 士 5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964788-964844bp，引物長度為20士^p ；序列2的設計區間為 964839-964895bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為9647M-964780bp，引物長度為；
引物6 設計區間為964807-96486;3bp，引物長度為20±^p。
第三套引物
引物1 設計區間為965001_965054bp，引物長度為；
引物2 設計區間為965159-965212bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為965018-96507;3bp，引物長度為；序列2的設計區間為 965058-965115bp，引物長度為 20士5bp ；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為965088-965144bp，引物長度為；序列2的設計區間為 965134-965190bp，引物長度為 20士5bp ；
引物5 設計區間為965036_965091bp，引物長度為；
引物6 設計區間為965107-96516^3ρ，引物長度為20±^ρ。
設計于HlyB基因的上游序列區間的三套引物設計區間為
第四套引物
設計于HlyB基因的上游序列區間的引物信息如下
引物1 設計區間為991116_991171bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991136-991194bp相符的序列，引物長度為20士5bp ；序列2為與區間991176-991233bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991223-991280bp相符的序列，引物長度為20士5bp ；區間2為與區間99U65-991320bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物5 設計區間為991157_991213bp，引物長度為20士5bp ；
引物6 設計區間為991243_9913(^bp，引物長度為20±^p。
第五套引物
設計于HlyB基因的上游序列區間的引物信息如下
引物1 設計區間為991096-991152bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991116-991171bp相符的序列，引物長度為；序列2為與區間991176-991233bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991223-991280bp相符的序列，引物長度為20士5bp ；區間2為與區間99U65-991320bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物5 設計區間為991136-991198bp，引物長度為20士5bp ；
引物6 設計區間為991243-991^^ρ，引物長度為20±^ρ。
第六套引物
引物1 設計區間為991531-991586bp，引物長度為20士5bp ；
引物2 設計區間為991729-991785bp，引物長度為20士5bp ；
引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991561-991616bp相符的序列，引物長度為20士5bp ；序列2為與區間991601-991660bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1為與區間991661-991719bp相符的序列，引物長度為20士5bp ；區間2為與區間991712-991766bp相符的序列的反向互補序列，引物長度為；
引物5 設計區間為991579-991638bp，引物長度為20士5bp ；
引物6 設計區間為991686-991744bp，引物長度為20±^p。
根據以上要求設計得到六套引物，再對所設計的引物進行合成(商業的生物公司即可進行引物的合成)。六套引物序列如下
第1套引物
引物 1 (964663-964679bp) :5，-ACT CCA GAA CCC CCA GG-3，，SEQID NO 1 ；
引物 2(964860-964878bp) :5，-CCT CGT CCG ATA TGG CTC A_3，，SEQ ID NO 2 ；
引物3(964732-964750bp和964691-964706bp) 5'-ACC CAC CGGCTC AAC CTG ATT TTG TTG CTC AGC TCC GCC-3，，SEQ ID NO 3 ；
引物4(964769-964788bp和964833-964848bp) 5'-GAT GGA CAG CAGCTC CGC GATTTT TGA CCC TGC GCG AAC G_3，，SEQ ID NO 4 ；引物 5(964713-964729bp) :5，-CGC AAG CTG GAT GCC CA-3，，SEQID NO 5 ；引物 6(964809-964826bp) :5，-TCG GCG ACC AGC TTG AGA-3，，SEQID NO :6。第2套引物引物 1(964706-96472Ibp) :5，-CGC GTT GTG GGC ATC C_3，，SEQ IDNO 7 ；引物 2(964884-964899bp) :5，-TCC GGC TGG ACT CCC T_3，，SEQ IDNO 8 ；引物3(964767-964787bp和964723-964740bp) 5'-CGC GGA GCT GCTGTC CAT CAG TTT TGC TTG CGC ATC AGG TTG A_3，，SEQ ID NO 9 ；引物4(964807-964825bp和964858-964876bp) 5'-CCT CGG CGACCA GCT TGA GTT TTT CGT CCG ATA TGG CTC AGG-3，，SEQ ID NO 10 ；引物 5(964743-964761bp) :5，-AAA CCG TGG AGA CCC ACC G_3，，SEQID NO :11 ；引物 6(964^6-964844bp) :5，-AAT TTG CCG TTC GCG CAG G_3，，SEQID N0:12。第3套引物引物 1 (965020-965035bp) :5，-GCC GTG CCT CAG AGG A_3，，SEQ IDNO 13 ；引物 2(965178-965193bp) :5，-GCG CCG TCT CGA ATG G_3，，SEQ IDNO 14 ；引物3(965077-965096bp和965037-965054bp) 5'-TGA CGT GAT CCGTCA GCT GCT TTT GCG GTG ACG ACG ACG ATA—3，，SEQ ID NO 15 ；引物4(965107-965125bp和965153-965171bp) 5'-TGC CCG GCA GACCCA GAT CTT TTC GTT TAT GAG GCC TGC CAG-3，，SEQ ID NO 16 ；引物 5(965055-965072bp) :5，-TCG CTG GAG CGA TAT GCG-3，，SEQID NO 17 ；引物 6(965126-965147bp) :5，-GAG TAA GAC CAG ATC GGG CGAG-3，，SEQ ID NO 18。第4套引物引物 l(991135-991152bp) :5，-GTA GGG TTA CCC GTC GTC-3，，SEQID NO 19 ；引物 2(991302-991320bp) :5，-CAT CAA AAG AAG GCT GGT G_3，，SEQ ID NO :20 ；引物3(991195-991214bp_991155-991175bp) 5'-AGA AAT MG CGTCCG CGG TGT TTT ATC ACA CTG ACA TAA GGG AAT-3，，SEQ ID NO :21 ；引物4(991242-991261bp和991284-991301bp) 5'-CGG GCT AGT GCCCCA AAA TAT TTT CGC TAT TTG TCG TGC TCG-3，，SEQ ID NO :22 ；引物 5(991176-991194bp) :5，-CGG GAG ACG CTC TCC GCT T_3，，SEQ ID NO :23 ；引物 6(99U62-99U8;3bp) :5，-TCC CCG TAT TTC AGG GCG CAAG-3，，SEQ ID NO 24。第5套引物引物 1(991115-991133bp) :5，-TCA AGA TTA GCG CAT CCT T_3，，SEQ ID NO :25 ；引物 2(991302-991320bp) :5，-CAT CAA AAG AAG GCT GGT G_3，，SEQ ID NO :26 ；引物3(991195-991214bp和991135-991152bp) 5'-AGA AAT MGCGT CCG CGG TGT TTT GTA GGG TTA CCC GTC GTC-3', SEQ ID NO :27 ；引物4(991242-991261bp和991284-991301bp) 5'-CGG GCT AGTGCC CCA AAA TAT TTT CGC TAT TTG TCG TGC TCG-3', SEQ ID NO :28 ;
引物 5(991155-991179bp) :5，-GCT TAT TCC CTT ATG TCA GTG TGAT_3，，SEQ ID NO 29 ；
引物 6(991262-991279bp) :5，-TCC CCG TAT TTC AGG GCG-3，，SEQID NO :30。
第6套引物
引物 l(991550-991567bp) :5，-CGT TCC ATG CAG GGA AGA-3，，SEQID NO 31 ；
引物 2(991748-991766bp) :5，-GCT CCA GCA GTG AAT TGA C_3，，SEQ ID NO :32 ；
引物 3(991620-991641bp 和 991580-991597bp) :5，-AGC AGG CAG AAA GGC GTT TTT TTTTTC ACC GAC AGT TTG CCG TC-3，，SEQ ID NO :33 ；
引物4(991680-991700bp和991731-991747bp) 5'-CCG CGC CGT TCTGGG ACA ATA TTT TTTCGC GTG CGC TGT TCT-3，，SEQ ID NO 34 ；
引物 5(991598-991619bp) :5，-TAT TCA TAT TAT TCC CCC GGGC_3，，SEQ ID NO: 35 ；
引物 6(991705-991725bp) :5，-GAC CGA TGA GTC GCG GCG CGC-3，，SEQ ID NO:36。
檢測。
實施例1 用E. tarda的基因擴增引物進行細菌特異性檢測首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行E. tarda的特異性(1)細菌DNA的制備細菌樣品DNA的制備采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)進行DNA提取，所提取的DNA 用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Zymo，美國)進行純化。DNA樣品制備后置于95°C中5min， 再冰浴5min進行變性處理后作為模板。
配制反應體系第1套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， 引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 每種 1. 4mM, MgCl2 6mM，甜菜堿 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000. 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L0上述反應體系配制完成后，混勻后分裝到無菌的Eppendorf管中 (規格為200 μ L)。
(2)按照如下的反應程序進行基因擴增反應61°C保溫40min，再80°C保溫5min。
(3)判斷檢測結果反應結束后，在反應體系中加入核酸染料 GeneFindei^O. 5 μ L，然后在陽光下觀察被測樣品反應產物的顏色，如果是綠色熒光則表示該樣品的Ε. tarda檢測結果為陽性，如果為淺橙色剛表示該樣品的E. tarda檢測結果為陰性。
利用上述方法，對不同來源的9株E. tarda和6種弧菌的基因組DNA，即燦爛弧菌 (Vibrio splendidus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、哈維氏弧菌(V. harveyi)、副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、費氏弧菌(V. fischeri)、鰻弧菌(V. anguillarum)進行了檢測，另設無菌水作為陰性對照，檢測結果表明模板為E. tarda管都顯示為綠色熒光，而模板為6種弧菌和無菌水管均顯示為淺橙色。
用本發明提供的第2套和第3套引物分別對上述樣品進行檢測，結果與第1套引物的檢測結果一致。這一結果反映出利用本發明所提供的引物進行基因擴增檢測結果具有很高的特異性，本發明所選擇的引物設計區間可作為特異檢測E. tarda的引物設計區間。
實施例2 用E. tarda的基因擴增引物進行細菌特異性檢測
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行E. tarda的細菌特異性檢測。
(1)細菌DNA的制備細菌樣品DNA的制備采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)進行DNA提取，所提取的DNA 用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Zymo，美國)進行純化。DNA樣品制備后置于95°C中5min， 再冰浴5min進行變性處理后作為模板。
配制反應體系第4套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， dNTP 每種 1. 4mM，MgCl2 6mM，甜菜堿 1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM,曲拉通X-100 0. 1%, Bst DNA聚合酶8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L。
(2)按照如下的反應程序進行基因擴增反應61°C保溫60min，再80°C保溫5min。
(3)判斷檢測結果反應結束后，對基因擴增的產物進行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳圖譜中有清晰的特異性梯狀條帶產生即為陽性檢測結果，無特異性梯狀條帶產生即為陰性檢測結果。
利用上述方法，采用第4套引物對E. tarda和6種弧菌的基因組DNA，即 V. splendidus、V.alginolyticus、V. harveyi、V.parahaemolyticus、V. fischeri、 V.anguillarum進行了檢測，另設無菌水作為陰性對照。電泳圖譜分析表明，模板為 E. tarda管都有特異性的梯狀條帶產生，而模板為6種弧菌和無菌水管均無任何條帶產生。
同樣，用本發明設計的第1、2、3、5和6套中引物1和引物2，引物3和引物4對上述樣品進行檢測，結果與第4套引物的檢測結果一致。
實施例3 用E. tarda的基因擴增引物進行細菌特異性檢測
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行E. tarda的細菌特異性檢測。
(1)細菌DNA的制備細菌樣品DNA的制備采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)進行DNA提取，所提取的DNA 用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Zymo，美國)進行純化。DNA樣品制備后置于95°C中5min， 再冰浴5min進行變性處理后作為模板。
配制反應體系第5套引物的引物1和引物2各0.2 μ M，引物3和引物4各1.6 μ M， 引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 每種 1. 4mM, MgCl2 8mM，甜菜堿 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-100 0. 1%, Bst DNA 聚合酶 8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L。
(2)按照如下的反應程序進行基因擴增反應65°C保溫45min，再80°C保溫5min。
(3)判斷檢測結果反應結束后，對基因擴增的產物進行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳圖譜中有清晰的特異性梯狀條帶產生即為陽性檢測結果，無特異性梯狀條帶產生即為陰性檢測結果。
利用上述方法，采用第5套引物對E. tarda、鲇魚愛德華氏菌(E. ictaluri)和6種弧菌的基因組 DNA,艮口 V. splendidus、V. alginolyticus、V. harveyi> V. parahaemolyticus、 V. fischeri, V. anguillarum進行了檢測，另設無菌水作為陰性對照。電泳圖譜分析表明， 模板為E. tarda管都有特異性的梯狀條帶產生，而模板為E. ictalUri、6種弧菌和無菌水管均無任何條帶產生。
用本發明提供的第4套和第6套引物分別對上述樣品進行檢測，結果與第5套引物的檢測結果一致。這一結果反映出利用本發明所提供的引物進行基因擴增檢測結果具有很高的特異性，本發明所選擇的引物設計區間可作為特異檢測E. tarda的引物設計區間。
實施例4 基因擴增引物進行魚類組織中E. tarda檢測
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行魚類組織E. tarda 檢測。
(1)組織DNA的制備組織樣品DNA的制備采用常規酚抽提的組織核酸提取方法。 DNA樣品制備后置于95°C中5min，再冰浴5min進行變性處理后作為檢測用模板。
(2)配制反應體系第1套引物的引物1和引物2各0. 2 μ M，引物3和引物4各 1. 6 μ Μ，弓ι物 5 禾口弓ι物 6 各 0. 8 μ Μ，dNTP 每種 1. 4mM, MgCl2 6mM，甜菜堿 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L0
(3)按照如下的反應程序進行基因擴增反應61°C保溫40min，再80°C保溫5min。
(4)判斷檢測結果反應結束后，在反應體系中加入核酸染料 GeneFindei^O. 5 μ L，然后在陽光下觀察被測樣品反應產物的顏色，如果是綠色則表示該樣品的Ε. tarda檢測結果為陽性，如果為淺橙色則表示該樣品的E. tarda檢測結果為陰性。
利用上述方法對取自山東煙臺的4份大菱鲆和牙鲆腸組織高疑似感染E. tarda樣品都檢測出陽性結果，這一結果與E. tarda的PCR檢測結果一致。這一結果說明利用本發明所提供的第1套引物進行基因擴增反應可以有效進行E. tarda的特異檢測。
實施例5 基因擴增引物對養殖水體樣品中的E. tarda的檢測
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行養殖水體中 E. tarda的檢測。
(1)養殖水體的取樣用無菌塑料管取待測的養殖水體10mL，室溫靜置lOmin，取上清液體100 μ L置于95°C中5min，再冰浴5min進行變性處理后作為模板。
(2)配制反應體系待檢水樣0.5 μ L，第1套引物的引物1和引物2各0.2 μ物3和引物4各1. 6 μ Μ，引物5和引物6各0.8 μ M，dNTP每種1. 4mM，MgCl2 6mM，甜菜堿 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl 1 OmM，MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L。
(3)按照如下的反應程序進行基因擴增反應61°C保溫40min，再80°C保溫5min。
(4)判斷檢測結果反應結束后，在反應體系中加入金屬離子指示染料(500μΜ鈣黃綠素1. 25 μ L和10 μ M氯化錳2 μ L)，然后在陽光下觀察被測樣品反應產物的顏色，如果顯綠色熒光則表示該水體樣品的Ε. tarda檢測結果為陽性，如果為鈣黃綠素試劑本身的淺紅橙色則表示該水體樣品的E. tarda檢測結果為陰性。
同樣，用本發明設計的第2、3、4、5和6套引物也可以用于對養殖水體等非活體樣品中的E. tarda的檢測。
實施例6 基因擴增引物對飼料樣品中的E. tarda的檢測
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行飼料中E. tarda的檢測。14
(1)樣品制備取飼料0. lg，研磨后浸泡于ImL無菌水體中，室溫靜置20min，取上清液體20 μ L置于95°C中5min，再冰浴5min進行變性處理后作為模板。
(2)配制反應體系第1套引物的引物1和引物2各0.4μΜ，1μ 水樣，25yL 2 X Premix Ex Taq (Ex Taq 1. 25U,0. 4mM each dNTP，含有 4mM Mg2+的 Ex Taq buffer) (TaKaRa)，加無菌水至50 μ L。
(3)按照如下的反應程序進行基因擴增反應94°C預變性％iin，1個循環；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，;35個循環；72°C延伸5min，l個循環。
(4)判斷檢測結果反應結束后，產物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增效果，如果PCR產物有預期大小(兩引物序列之間核苷酸的堿基數)的電泳條帶出現，則表示該飼料樣品的E. tarda檢測結果為陽性；如果沒有預期大小的電泳條帶出現，則表示該飼料樣品的E. tarda檢測結果為陰性。
同樣，用本發明設計的第1套引物中的引物5和引物6，或第2、3、4、5和6套引物中的引物1和引物2或引物5和引物6也可以用于對樣品中的E. tarda的檢測。
實施例7 兩種基因擴增引物對E. tarda的檢測靈敏度比較
首先對Savan等Q004)報道的基于溶血素基因擴增檢測E. tarda引物進行合成， 引物序列如下
F3 :5，-AGC CAA CGT ACC CAG GTC—3，
B3 5' -TGG ATC TGG GTG GTC TGC-3'
FIP :5’ -GCC TTT CTT CAC CGC CCC TTT TTT GGC GTT AGC GTC GACTAC AG-3’
BIP :5’ -TTG GTA CCA TCG GCA AGC CGT TTT GGT ATC GCT GCTGCT CTG C—3’
同時合成本發明所提供的第1套引物，然后根據以下步驟進行兩種基因擴增檢測 E. tarda的靈敏度比較。
(1)細菌DNA反應模板的制備采用水煮法進行粗步提取，將ImL處于對數生長期的細菌(過夜培養E. tarda菌夜按1 10接種于新配制的北京陸橋技術有限責任公司生產的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，28°C振蕩(150rpm)培養約3h即可)，5000 X g離心3min，棄去培養液，用250 μ L的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ8. 0)重懸菌體后，置于水浴鍋或金屬浴中95°C煮5min后，再5000Xg離心8min，收集上清即為粗提DNA樣品。DNA 樣品制備后置于95°C中5min，再冰浴5min進行變性處理后作為檢測用模板。
(2)配制反應體系取上述制備待檢樣品的DNA模板0. 5μ L，分別加入到如下基因檢測反應體系中。
(a)本發明的基因擴增反應體系第1套引物中的引物1和2各0.2μΜ，引物3和引物 4 各 1. 6 μ Μ，引物 5 和引物 6 各 0. 8 μ M，dNTP 1. 4mM,MgCL2 6mM，甜菜堿 1. 2M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 10mM，曲拉通 X-1000· 1 %，Bst DNA 聚合酶 8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為25 μ L0
(b)已報道的基于溶血素基因擴增反應體系引物FIP和BIP各1.6 μ M，引物F3和 Β3 各 0. 2 μ M，dNTP 1. 4mM, MgCL2 6mM，甜菜堿 0. 8M, Tris-HC120mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM,曲拉通X-1000. 1 %, BstDNA聚合酶8U，加入無菌雙蒸水使各管的終體積為 25 μ L0
上述兩套反應體系中的dNTP為濃度分別為IOmM的dTTP、dATP、dGTP、dCTP的等量混合物。上述反應體系配制完成后，分別混勻后分裝到無菌的Eppendorf管中(規格為 200 μ L)。
(3)按照如下的反應程序進行反應
(a)本發明的基因等溫擴增反應程序反應體系置于6rC保溫，分別于反應后20、 30、40和50min取出不同的反應管，再80°C保溫5min。
(b)已報道的溶血素基因等溫擴增反應程序反應體系置于65°C保溫，分別于反應后20、30、40和50min取出不同的反應管，再80°C保溫5min。
(4)兩套不同基因擴增檢測E. tarda靈敏度比較對上述兩套基因擴增檢測中不同反應時間(20、30、40和50min)的產物進行凝膠電泳分析，結果顯示，本發明提供的引物可在30min擴增反應后即有陽性檢測結果，而已報道的基于溶血素基因擴增檢測中最快有陽性檢測結果的時間為50min。這一結果表明利用本發明第一套引物進行基因擴增檢測 E. tarda方法較Mvan等Q004)報道的基于溶血素基因擴增檢測E. tarda要更加靈敏和快速。
實施例8 基因擴增引物對E. tarda的檢測靈敏度的測定及與常規PCR方法的比較
首先對本發明所提供的引物進行合成，然后根據以下步驟進行基因擴增引物對 E. tarda的檢測靈敏度的測定及與常規PCR方法的比較。
(1)細菌DNA的制備細菌樣品DNA的制備采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)進行DNA提取，所提取的DNA 用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Zymo，美國)進行純化。DNA樣品制備后置于95°C中5min， 再冰浴5min進行變性處理后作為檢測用模板。
(2)構建質粒標準品。根據E. tarda(GenBank :CP001135. 1)的序列，設計用于構建E. tarda EsrB基因質粒標準品DNA片段(380bp)，引物序列如下
EsrB-sense primer5’ -GAT GCC GAT GCC AGA CAA-3’
EsrB-anti-sense primer 5' -AAA GCC CGC AGC AAA CC-3'
該片段的常規PCR方法反應程序94°C預變性％iin，1個循環；94°C變性30s，58°C 退火30s，72°C延伸30s，35個循環；72°C延伸10min，l個循環。所獲DNA片段用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Zymo，美國)進行純化后，按天根生化科技(北京)有限公司的pGM-T 克隆試劑盒使用說明要求與載體PGM-T連接，構建含有hrB基因等溫擴增所涉及序列的重組質粒pGM-EsrB，然后測定質粒濃度并作10倍稀釋。
(3)靈敏度檢測。將上述稀釋后的質粒用作基因擴增反應的模板，用凝膠電泳分析反應產物，結果表明利用本發明提供第1套引物基因擴增方法對E. tarda檢測極限為10 拷貝的目的基因。同時，將上述稀釋后的質粒用作常規PCR反應的模板進行擴增，引物及反應程序同上，凝膠電泳分析PCR的反應產物，結果顯示PCR檢測方法對E. tarda檢測極限為 1000拷貝的目的基因。
這一結果說明利用本發明所提供第1套引物進行基因擴增檢測E. tarda較常規 PCR檢測方法靈敏度可提高100倍。
權利要求
1.用于基因擴增法快速檢測遲緩愛德華氏菌的引物，其特征在于引物的設計針對遲緩愛德華氏菌hrB基因或遲緩愛德華氏菌HlyB基因上游序列。
2.如權利要求1所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物，其特征在于由遲緩愛德華氏菌 hrB基因設計的引物是來自于GenBank序列編號為CP001135. 1的964658_965302bp區間， 設計的引物信息如下第一套引物引物1 設計區間為964658-964698bp，引物長度為； 引物2 設計區間為964841-964897bp，引物長度為； 引物3:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964672-96472^ρ，引物長度為；序列2的設計區間為 964713-964769bp，引物長度為 20士5bp ；引物4:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964750-964807bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 964814-964867bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為964694-964748bp，引物長度為； 引物6 設計區間為964790-964845bp，引物長度為； 第二套引物引物1 設計區間為964687-964740bp，引物長度為； 引物2 設計區間為964865-964918bp，引物長度為； 引物3:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964704-964759bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 964748-9648(^bp，引物長度為 20 士 5bp ；引物4:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為964788-964844bp，引物長度為；序列2的設計區間為 964839-964895bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為964724-964780bp，引物長度為； 引物6 設計區間為964807-964863bp，引物長度為； 第三套引物如下引物1 設計區間為965001-965054bp，引物長度為； 引物2 設計區間為965159-965212bp，引物長度為； 引物3 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為965018-96507;3bp，引物長度為；序列2的設計區間為 965058-965115bp，引物長度為 20士5bp ；引物4:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為965088-965144bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 965134-965190bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為965036-965091bp，引物長度為； 引物6 設計區間為965107-965166bp，引物長度為20±^p。
3.如權利要求2所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物，其特征在于所述的第一套引物、第二套引物、第三套引物的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:1 6、SEQ ID NO :7 12或SEQ ID NO 13 18。
4.如權利要求1所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物，其特征在于由HlyB核苷酸上游序列設計的引物是來自于GenBank編號為CP001135. 1的991096_991785bp的區間，設計的引物信息如下第四套引物引物1 設計區間為991116-991171bp，引物長度為； 引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為； 引物3:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991136-991194bp，引物長度為20士5bp ；序列2的設計區間為 991176-991233bp，引物長度為 20士5bp ；引物4:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991223-99U80bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991265-991320bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為991157-991213bp，引物長度為； 引物6 設計區間為991M3-991302bp，引物長度為； 第五套引物引物1 設計區間為991096-991152bp，引物長度為； 引物2 設計區間為991283-991339bp，引物長度為； 引物3:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991116-991171bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991176-991233bp，引物長度為 20士5bp ；引物4 該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991223-99U80bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991265-991320bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為991136-991198bp，引物長度為； 引物6 設計區間為991M3-991298bp，引物長度為； 第六套引物引物1 設計區間為991531-991586bp，引物長度為； 引物2 設計區間為991729-991785bp，引物長度為； 引物3:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991561-99161^ρ，引物長度為；序列2的設計區間為 991601-991660bp，引物長度為 20士5bp ；引物4:該引物為針對兩段序列分別設計的兩段引物并用TTTT連接而成，長度為 40士 IObp ；序列1的設計區間為991661-991719bp，引物長度為；序列2的設計區間為 991712-991766bp，引物長度為 20士5bp ；引物5 設計區間為991579-991638bp，引物長度為； 引物6 設計區間為991686-991744bp，引物長度為20±^p。
5.如權利要求4所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物，其特征在于所述的第四套引物、第五套引物、第六套引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO 19 M、SEQ ID NO :25 30或 SEQ ID NO 31 36。
6.權利要求1所述的檢測遲緩愛德華氏菌的引物，用于非疾病的診斷和治療目的中的遲緩愛德華氏菌的檢測包括用于制作檢測試劑或試劑盒產品，用于開展遲緩愛德華氏菌及其成分存在狀況的分析、檢疫和流行病學監測，用于進行環境、水體、飼料、工具的檢測， 用于對非患病動物受精卵、苗種、幼體、成體、親本種的遲緩愛德華氏菌進行檢測，用于在飼料銷售、藥品銷售、苗種銷售、疫苗接種的非疾病診斷目的的服務中附帶進行樣品檢測。
7.如權利要求6所述的檢測，是通過基因擴增反應來完成的，一種反應體系如下至少包含有權利要求3或權利要求5所述的任一套引物的引物1和引物2各0. 1-0. 3 μ M、引物3 和引物4各1. 2-2. 0 μ M、dNTP 1. 1-1. 7mM、Mg2+4-12mM、具有鏈替代活性的DNA聚合酶1-16U 和經95°C變性后的待檢樣品DNA模板IO1-IO7拷貝的1-100 μ L反應體系中，經55-67°C保溫 40min-lh，再經 80°C保溫 5_10min。
8.如權利要求7所述的檢測，其特征在于反應體系還包含有對應于引物1和引物 2所在的一套引物中的引物5和引物6各0. 6-1. 0 μ M,以及甜菜堿1.0-1.4Μ、Tris-HCl 5-50mM、KCl 2_20mM、(NH4)2SO4 6-15mM 和曲拉通 X-1000. 02-2%，pH 值為 7-10。
9.如權利要求6所述的檢測，是通過基因擴增反應來完成的，反應體系至少包含有1對引物各 0. 1-0. 6μΜ、(1ΝΤΡ 0. 1-0. 3mM、Mg2+ l_4mM、耐熱 DNA 聚合酶 l-8U、Tris_HCl 5_20mM、 KCl 30-70mM、待檢DNA模板IO1-IO7拷貝，pH為7-10的1-100 μ L反應體系中，經94°C保溫4-lOmin，再經25-40個循環反應，每個循環反應包括94°C保溫20_30s，50-60°C保溫 20-30s，70-73°C保溫20_30s ；最后經70_73°C保溫3-lOmin ；所述的1對引物為權利要求3 或5所述的任一套引物的引物1和引物2，或者引物5和引物6。
全文摘要
本發明公開了用于快速檢測遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的基因擴增引物。該引物以E.tarda的esrB或遲緩愛德華氏菌hlyB上游序列為目標設計出特異性引物，利用上述引物進行基因擴增的檢測方法具有簡便、快速、特異和靈敏的特點，僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在40min檢測出10拷貝目的基因，適用于E.tarda的現場快速檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK102559914SQ20121003854
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者劉莉, 史成銀, 張慶利, 楊冰, 王秀華, 謝國駟, 黃倢 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所