專利名稱：基于封閉反應器的dna片段擴增和定量檢測系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子 生物學檢測技術領域，具體涉及一種廣泛應用于醫院臨床、檢驗防疫、科研教學、農林生化、刑偵等領域的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統。
背景技術：
聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR),簡稱PCR技術,是一種體外擴增特異DNA片段的技術，其工作原理是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。這一過程的不斷重復，可以使得DNA的合成量呈現指數增長，短時間內可達數百萬倍。聚合酶鏈反應裝置(又稱PCR儀、基因擴增儀、聚合酶鏈反應分析儀)是利用聚合酶鏈反應原理，使反應物在指定的變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間自動循環的儀器。目前主流聚合酶鏈反應裝置包括自上而下依次裝配的可插放若干試管的變溫金屬模塊，半導體制冷器，散熱器件和風機。采用半導體制冷器控溫，是為了使變溫金屬模塊的溫度按程序升溫和降溫，從而使放置于金屬模塊試管內的反應物按聚合酶鏈反應所需溫度循環變化。Real-time PCR (又稱實時熒光定量PCR檢測系統、核酸擴增實時定量檢測系統) 是在聚合酶鏈反應基礎上增加熒光檢測和分析功能的裝置。此技術采用對DNA片段進行熒光標記的方法，跟蹤顯示DNA片段數量及其變化過程，并與已知DNA片段標準品對比，依據熒光信號變化特性可以迅速確定未知樣品原始DNA片段的數量。從而為診斷疾病或分子生物學研究提供準確、定量的參考。Real-time PCR通過使用不同波長的激發光照射試管，當試管中的試劑被激發出熒光時，光學傳感器(PMT、PD、CCD等)采集到熒光強度信號并及時傳送到計算機進行實時數據顯示和分析。目前主流Real-time PCR的工作模式有
(a)頂部檢測模式大多數系統都采用此模式，其特征是變溫金屬模塊底部是封閉的， 激發光源都位于模塊上方，光學檢測器件也位于模塊上方，一般通過透鏡聚焦或以掃描方式采集數據。此模式下，可以使用通用的半導體制冷器、散熱器。但缺點是由于塑料試管上側環境溫度偏冷，常有蒸發和結露水汽停留和滴落，造成熒光信號突變和檢測重復性變差。同時從頂部檢測時，距離較遠，造成激發光變弱和信號變弱。(b)底部檢測模式此模式國內有多家企業采用。其特征是變溫金屬模塊底部是帶有小孔，采用LED光源，利用光纖或二向分色鏡傳遞到試管底部，同時將試劑熒光向下經濾光片等光學零件直接或用光纖傳導到光學傳感器進行檢測。此模式下，孔中基本沒有積灰問題，試管液體蒸發對檢測幾乎沒有影響，但也會造成熒光信號中含有強烈的激發光背景成份，會造成多波長試劑檢測時串擾(cross-talk)無法準確修正。另外，光學元件傳導路徑較長，中間損耗極大，使得光傳感器利用效率較低，并導致背景和噪聲較大。
(C)側面檢測模式個別系統采用此模式，其特征是變溫金屬模塊底部是封閉的， 激發光源從頂部入射或與熒光信號共用光纖，熒光信號通過模塊孔側面引出的光纖導光束來傳導。此模式下，塑料試管的影響可以降低，但光纖位于模塊側壁易被殘留物污染、磨損、 斷裂，且難以清潔，使用受限且壽命縮短。此模式下信號相對較弱，系統穩定性差。并且光纖埋設和維修十分困難。
目前Real-time PCR反應所用的耗材，其基本特征是一種帶錐底和蓋的塑料PP試管，標稱為O. 2ml。由于材料和形狀結構的限制，其熱傳導較差，液體達到所需溫度的平衡時間較長；并且其所作為載放的工作介質模塊通常為金屬材料，溫度均勻性和升降溫速率的要求成為一對矛盾。Real-time PCR通常選用半導體制冷器件(帕爾貼器件)作為溫度控制的主要元件，工作時需要變換目標溫度，其升降溫變化過程時間約占總實驗時間的30-75%。
由于擴增實驗總時間需要1-2小時，因反應體系中的DNA聚合酶具有高溫下快速降解的特性，使得傳統PCR實驗對于低濃度DNA片段(IO-2拷貝數以下)的實驗效果不佳，其 Ct值檢測變異系數通常為CV=L 5以上，在臨床上對于早期疾病診斷存在不利影響。客觀上，耗材的因素已影響到PCR技術在臨床和科研上的進一步發展。
發明內容
針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于提供一種環保、操作方便、檢測靈敏度高的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于包括擴增單元，所述的擴增單元內配合設置一組封閉反應器，所述的封閉反應器一側配合設置激發光裝置和熒光檢測裝置，所述的擴增單元底部配合設置給封閉反應器提供動力的傳動裝置， 所述的傳動裝置與電機連接，所述的擴增單元內配合設置兩個或兩個以上獨立不同溫度的定溫恒溫區域。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的封閉反應器為一次性耗材反應器，包括透明導熱管及分別配合設置在透明導熱管兩端的試劑進樣口和定量取樣按鈕，所述的試劑進樣口與蠕動氣囊連接，試劑進樣口、透明導熱管、定量取樣按鈕與蠕動氣囊為密封體，構成封閉反應器，試劑進樣口內用于吸取放置待測樣品，所述的定量取樣按鈕上配合設有氣囊，所述的蠕動氣囊上帶有防試劑進樣口松脫的維持機構。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的擴增單元配合設置兩個或兩個以上不同溫度的定溫恒溫控制區域。以四個區域為例，分別為定溫恒溫控制區域I、定溫恒溫控制區域II、定溫恒溫控制區域III和定溫恒溫控制區域IV。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的激發光裝置包括依次設置的光源、濾光片及透鏡。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的熒光檢測裝置包括依次設置的濾光片、透鏡或光學收集器、檢測傳感器及濾波器。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的透明導熱管為薄壁毛細管狀結構，為薄壁透明導熱柔性彎管或薄壁透明導熱直管。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的定溫恒溫區域內設有工作介質，所述的工作介質為金屬、導熱流體、液體或空氣中的任意一種， 每個定溫恒溫區域的工作介質由加熱膜、加熱絲或半導體制冷器進行控溫。
所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的擴增單元為長方體形結構或圓錐形轉臺形結構，其外圍配合設置用于區域溫度隔離的隔熱材料。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的定溫恒溫區域內配合設置由電機驅動的往復式蠕動，通過蠕動使透明導熱管內的待測樣品得到充分混勻和反應。蠕動頻率和幅度應保證不引起DNA鏈的脫落。所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的激發光裝置和熒光檢測裝置配合設置透明導熱管一側，并緊貼的透明導熱管，激發光裝置光路和熒光檢測裝置的光路之間形成30° -150°的夾角。通過采用上述技術，與現有技術相比，本發明的有益效果如下
1)本發明的封閉反應器，是一次性使用的耗材，無需使用昂貴的移液槍和TIP頭耗材， 而且為封閉式，有效實現了試樣的吸取、封閉和受控移動，直至整體封閉廢棄，完全避免了移液槍反復使用造成的潛在污染風險，而且使用方便，提高了檢測的準確性；
2)本發明的封閉反應器的中部采用光學透明的可彎曲柔性導熱塑膠高分子材料管，以便留出熒光檢測所需的窗口，通常制作成毛細管狀，采用薄壁結構，以增大樣品與外部溫度環境的熱接觸面積，縮短熱平衡時間，完全無需使用熱蓋，大大簡化了 DNA片段擴增裝置的設計，消除了反應過程中蒸汽冷凝所造成的熒光信號波動；
3)本發明的封閉反應器的頭部是較硬的進樣口，其材料可以為金屬針頭、導熱塑膠或導熱玻璃材料，當刺破、插入一次性使用的蠕動氣囊時，構成一個完整的封閉反應器，蠕動氣囊上帶有防進樣口松脫的維持機構，提高整個反應器的穩定性和密封性；
4)本發明的擴增單元中設立兩個或兩個以上獨立的定溫恒溫控制區域，當取樣器采取緊貼接觸措施后，大大增加了有效熱接觸面積和熱傳導效率，同時封閉反應器透明管既細又長，熱負載小，試劑樣品的熱滯后效應也大大減小，可滿足PCR擴增所需的溫度循環反應條件，避免了通常情況下模塊變溫的升降溫過程，能有效加快反應過程，大大節省實驗時間，提聞了檢測分析效率；
5)本發明在定溫恒溫控制區域采用由電機驅動的往復式蠕動攪拌裝置，使得試樣在同一溫度區域內來回移動，使得試樣得到充分混勻，也能進一步克服了溫度場不均勻問題。6)本發明在DNA片段擴增裝置基礎上可形成定量檢測系統，在所需恒溫區域設有激發光裝置和熒光檢測裝置，利用封閉反應器的透明窗口進行高效熒光激發和熒光接收， 由于光學裝置能最大程度接近樣品，其過程損耗最小，激發的能量利用率大大提高并且熒光接收的信號強度損失降到最低，實現高靈敏度檢測，有利于低濃度檢測，激發光裝置和熒光檢測裝置在空間上形成一定法線夾角，通常取30° -150°時可以有效降低信號中的光源背景，從而獲得一般系統中無法得到的強信號和低背景；
7)本發明的擴增單元內溫度分區恒定控制，只需通過擠壓封閉反應器的蠕動氣囊，通過推動試樣移動實現變溫，完全消除了變溫金屬模塊升降溫所需的時間，實驗過程總時間縮短至少30min以上，有利于保持DNA酶的活性，使得低濃度樣品的檢測更為準確可靠，檢測靈敏度提高；同時大大提高了工作效率和儀器可利用率，由于溫度系統恒定，大大提高了實驗的可再現性，而且對于常用的PCR試劑所需的常用工作溫度是55、72、95°C附近，都在室溫以上，無需使用半導體制冷器，從而降低了控制電路的成本，降低了系統電源功率，使得系統應用更為可靠；
8)本發明實現了近距離光學檢測，最大程度提高了激發光強度，也使得最大程度獲得有效的熒光信號成為可能，由于試樣是在毛細管中推進，流過檢測器的波形接近梯形，其平穩的信號頂部有利于數據采集和處理；同時樣本的體積差異對檢測的影響也大大降低。9)利用本發明的原理和裝置平臺，可以方便地實現多通道試劑的并行PCR反應和多波長熒光檢測，并且稍加變化，可以實現試劑熔解度檢測。
圖I為本發明的結構示意圖2為本發明的另一實施例結構示意圖； 圖3為本發明的封閉反應器的結構示意圖4為本發明的封閉反應器另一實施例的結構示意圖5為基于本發明封閉反應器的Real-time PCR儀的激發裝置與熒光檢測裝置結構示意圖6為本發明圖5的俯視圖結構不意圖。圖中1-封閉反應器，101-定量取樣按鈕，102-透明導熱管，103-試劑進樣口， 104-蠕動氣囊，2-擴增單元，3-定溫恒溫控制區域I，4_定溫恒溫控制區域II，5-定溫恒溫控制區域III，6-定溫恒溫控制區域IV，7-電機，8-傳動裝置，9-待測樣品，10-激發光裝置，
11-熒光檢測裝置，12-圓錐形轉臺。
具體實施例方式以下結合說明書附圖對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不僅限于此。如圖1-6所示，基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，包括箱形結構或圓錐形轉臺形結構的擴增單元2，所述的擴增單元2內配合設置一組封閉反應器1，所述的封閉反應器I 一側配合設置激發光裝置10和熒光檢測裝置11，所述的擴增單元2底部配合設置給封閉反應器I提供動力的傳動裝置8與電機7連接，所述的擴增單元2內配合設置兩個或兩個以上獨立不同溫度的定溫恒溫區域，本發明的實施例中擴增單元2配合設置四個不同溫度的定溫恒溫控制區域，分別為定溫恒溫控制區域I 3、定溫恒溫控制區域II 4、定溫恒溫控制區域III 5和定溫恒溫控制區域IV 6，每個區域的溫度不同，每個定溫恒溫區域內設有工作介質，工作介質為金屬、導熱流體、液體或空氣或其他類似的物質，每個定溫恒溫區域的工作介質由加熱膜、加熱絲或半導體制冷器進行控溫，本發明為了使透明導熱管102 內的待測樣品9得到充分混勻和反應，在定溫恒溫區域上配合設置由電機驅動的往復式蠕動裝置。圖2所示是一種更實用的多樣品檢測的拓撲形式的截面圖，采用了圓錐形轉臺12 結構。封閉反應器I置放于圓錐形轉臺12的臺表面凹槽中，可按放射狀排列，形成多樣品同時實驗，實際系統還帶有外圈的保溫和夾持機構，區域隔離的保溫腔用于保溫，上下分層的多個恒溫區域及由電機7上下擠壓協助試劑樣品完成PCR擴增過程，而電機7帶動的旋轉更方便于光學檢測，檢測時激發光裝置10和熒光檢測裝置11可以不動，直接通過旋轉圓錐形轉臺12，依次檢測每個封閉反應器和不同區域的待測樣品9，而且這樣的結構可以使待測樣品9得到一定程度的可程序控制的離心式拋甩和攪拌作用，充分保證樣品中的PCR擴增高效率反應。
如圖3和圖4所示，封閉反應器I為一次性耗材反應器，包括透明導熱管102及分別配合設置在透明導熱管102兩端的試劑進樣口 103和定量取樣按鈕101，所述的試劑進樣口 103與蠕動氣囊104連接，試劑進樣口 103、透明導熱管102、定量取樣按鈕101與蠕動氣囊104為密封體，構成封閉反應器，試劑進樣口 103內用于放置待測樣品9，所述的定量取樣按鈕101上配合設有氣囊，所述的蠕動氣囊104上帶有防試劑進樣口 103拔出的維持機構，所述的透明導熱管102為薄壁毛細管狀結構，為薄壁透明導熱柔性彎管(見圖4)或薄壁透明導熱直管(見圖3)。如圖5和圖6所示，所述的激發光裝置10包括依次設置的光源、濾光片及透鏡，熒光檢測裝置11包括依次設置的濾光片、透鏡或光學收集器、檢測傳感器及濾波器，激發光裝置10和熒光檢測裝置11配合設置在透明導熱管102周圍，并緊貼的透明導熱管102，激發光裝置10光路和熒光檢測裝置11的光路之間形成30° -150°的夾角。如圖1-6所示，本發明的使用過程為
1)捏帶氣囊的定量取樣按鈕101，將待測樣品9從試劑進樣口103吸入，提取待測樣品9后，迅速將試劑進樣口 103刺穿連通蠕動氣囊104組成封閉反應器I，待測，實驗完成后，封閉反應I器作為一次性使用的耗材可以整體取出廢棄，其一直保持封閉狀態，不影響后續實驗；
2)擴增單元的使用，將擴增單元2的定溫恒溫控制區域I3、定溫恒溫控制區域II 4、定溫恒溫控制區域III 5和定溫恒溫控制區域IV 6加熱至設置溫度，再將步驟I)中的封閉反應器I置入擴增單元2內，通過適當的夾緊裝置與每個恒溫區域保持良好的熱接觸，封閉反應器I的蠕動氣囊104與傳動裝置8觸接，根據實際需要，使待測樣品9進入指定的定溫恒溫控制區域，開啟電機7，控制傳動裝置8的力度，擠壓蠕動氣囊104，使待測樣品9上移，當移至指定位置中，關閉電機7，由于定溫恒溫控制區域的溫度是穩定的，所以待測樣品9進入該區域后，不需要加熱很長時間，即可進行測量，縮短了實驗的時間，開啟激發光裝置10和熒光檢測裝置11，通過封閉反應器I的透明導熱管102的透明窗口進行檢測。通過電機7及其傳動裝置8同步給多個蠕動氣囊104施加壓力，按所需程序調控，使得所有樣本在同等反應環境和過程下完成聚合酶鏈反應擴增實驗，保證實驗結果的可對比性和可靠性。本發明通過溫度分區恒定控制，只需通過試樣移動實現變溫，完全消除了變溫金屬模塊升降溫所需的時間，實驗總時間縮短至少30min以上，有利于保持DNA酶的活性，使得低濃度樣品的檢測更為準確可靠，檢測靈敏度提高；同時大大提高了工作效率和儀器可利用率。由于溫度系統恒定，大大提高了實驗的可再現性。對于常用的PCR試劑所需的常用工作溫度是55°C、72°C、95°C附近，都在室溫以上，無需使用半導體制冷器，從而降低了控制電路的成本，降低了系統電源功率，使得系統應用更為可靠。如圖3的直形的透明導熱管102，可以一排間隔放在擴增單元2內，由設置在透明導熱管102 —側的激發光裝置10和熒光檢測裝置11進行測量，激發光裝置10和熒光檢測裝置11可以移動，根據需要移至需要測量的待測樣品9所在的區域；如圖4明導熱管102 為薄壁透明導熱柔性彎管，它可以是單圈或多圈盤旋方式或直通方式布置于定溫恒溫區域內，通過擠壓蠕動氣囊104，使得封閉反應器I中的待測樣品9因氣壓差產生移動，在程序控制下完成樣品在不同恒溫區內的移動和檢測。以上裝置，可以包含一個或一個以上恒溫區域，一個或一個以上封閉反應器I (樣本)，一個或一個以上光學檢測通道，并且可以是組合或拓撲形式，也可以是簡化形式。圖5和圖6所示的激發光裝置10和熒光檢測裝置11，緊貼封閉反應器I的透明導熱直管或透明導熱柔性彎管，兩者的光路在空間上形成一定法線夾角，通常取30°-150° 時可以有效降低信號中的光源背景，從而獲得一般系統中無法得到的強信號和低背景，光學裝置中集成必要的特定光源選擇、特定濾光片選擇、特定透鏡選擇，并具有傳導、聚焦、準直、消反等功能，并能根據需要配置成可移動掃描或攝像的工作模式，實現了近距離光學檢測，最大程度提高了激發光強度，也使得最大程度獲得有效的熒光信號成為可能。由于試樣是在毛細管中推進，流過檢測器的波形接近梯形，其平穩的信號頂部有利于數據采集和處理；同時樣本的體積差異對檢測的影響也大大降低。本發明通過上述技術，實現提高試劑樣品的熱響應，加快聚合酶鏈反應過程，大幅縮短實驗時間；減少DNA酶的降解，提高樣本擴增靈敏度、準確性、再現性，擴展試劑檢測線性范圍；減少實驗中的污染風險；縮短光程，提高光學檢測的靈敏度和低背景；實現低成本的多樣品多通道檢測需要。因此，利用本發明的原理和裝置平臺，可以方便地實現多通道試劑的并行PCR反應和多波長熒光檢測，并且稍加變化，可以實現試劑熔解度檢測。
權利要求
1.基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于包括擴增單元(2)，所述的擴增單元(2)內配合設置一組封閉反應器(1)，所述的封閉反應器(I) 一側配合設置激發光裝置(10)和熒光檢測裝置(11)，所述的擴增單元(2)底部配合設置給封閉反應器(I)提供動力的傳動裝置(8 )與電機(7 )連接，所述的擴增單元(2 )內配合設置兩個或兩個以上獨立不同溫度的定溫恒溫區域。
2.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的封閉反應器(I)為一次性耗材反應器，包括透明導熱管(102)及分別配合設置在透明導熱管(102)兩端的試劑進樣口( 103)和定量取樣按鈕(101 )，所述的試劑進樣口(103)與蠕動氣囊(104)連接，試劑進樣口( 103)、透明導熱管(102)、定量取樣按鈕(101)與蠕動氣囊(104)為密封體，構成封閉反應器，試劑進樣口( 103)內用于吸取放置待測樣品(9)，所述的定量取樣按鈕(101)上配合設有氣囊，所述的蠕動氣囊(104)上帶有防試劑進樣口(103)拔出的維持機構。
3.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的擴增單元(2)配合設置兩個或兩個以上不同溫度的定溫恒溫控制區域。
4.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的激發光裝置(10)包括依次設置的光源、濾光片及透鏡。
5.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的熒光檢測裝置(11)包括依次設置的濾光片、透鏡或光學收集器、檢測傳感器及濾波器。
6.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的透明導熱管(102)為薄壁毛細管狀結構，為薄壁透明導熱柔性彎管或薄壁透明導熱直管。
7.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的定溫恒溫區域內設有工作介質，所述的保溫介質為金屬、導熱流體、液體或空氣中的任意一種，每個定溫恒溫區域的工作介質由加熱膜、加熱絲或半導體制冷器進行控溫，每個定溫恒溫區域之間采用隔熱材料隔離或通過空氣間隙實現隔離。
8.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的擴增單元(2)為長方體形結構或圓錐形轉臺形結構，其外圍配合設置恒溫腔。
9.根據權利要求I所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的定溫恒溫區域配合設置由電機驅動的往復式蠕動裝置，通過震動使透明導熱管(102)內的待測樣品(9)得到充分混勻和反應。
10.根據權利要求2所述的基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，其特征在于所述的激發光裝置(10 )和熒光檢測裝置(11)配合設置透明導熱管(102 ) —側，并緊貼的透明導熱管(102)，激發光裝置(10)光路和熒光檢測裝置(11)的光路之間形成30° -150°的夾角。
全文摘要
基于封閉反應器的DNA片段擴增和定量檢測系統，屬于分子生物學檢測系統技術領域。它包括擴增單元，擴增單元內配合設置一組封閉反應器，封閉反應器一側配合設置激發光裝置和熒光檢測裝置，擴增單元底部配合設置給封閉反應器提供動力的傳動裝置，傳動裝置與電機連接，擴增單元內配合設置兩個或兩個以上獨立不同溫度的定溫恒溫區域。本發明通過上述技術，實現提高試劑樣品的熱響應，加快聚合酶鏈反應過程，大幅縮短實驗時間；減少DNA酶的降解，提高樣本擴增靈敏度、準確性、再現性，擴展試劑檢測線性范圍；減少實驗中的污染風險；縮短光程，提高光學檢測的靈敏度和低背景；實現低成本的多樣品多通道檢測需要。
文檔編號C12M1/34GK102618439SQ201210050898
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者劉志華, 胡惠平 申請人:胡惠平