專利名稱：一種高密度培養枯草芽孢桿菌的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，更具體涉及一種高密度培養枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtil is、的方法。
背景技術：
抗生素作為飼料添加劑，在畜禽防疫方面雖起到積極的作用，但抗生素的廣泛使用帶來了環境污染、殘毒危害、病菌抗藥、人畜安全受到威脅等一系列問題。另外，抗菌素會抑制和殺死腸道內的有益菌群，造成腸道正常菌群微生態失調，導致疫病的發生，出現二重感染，有害于人畜健康。1974年，Parker提出與“抗生素”相對的新概念——“益生菌”。 益生菌，源于希臘語“對生命有益”，是指能定植于宿主腸道內，產生確切健康功效的活的有益微生物的總稱，是具有調節動物腸道微生態平衡，達到提高宿主健康水平和健康狀態的活菌制劑及其代謝產物。近年來許多研究發現，芽孢桿菌對動物和人的病原菌具有顯著的拮抗作用，引起廣大微生物和免疫學工作者的密切關注。芽孢桿菌的芽孢具有耐熱、抗干燥、便于運輸和使用等優點，在西方國家芽孢桿菌已被開始應用于人的功能性食品和動物飼料添加劑。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，革蘭氏陽性需氧菌，是我國農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，因其無毒、無殘留、無污染，同時具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，對改善動物消化道微環境、促進動物營養的消化吸收、提高動物飼料的轉化率和增強畜禽免疫力起到重要作用，已被越來越多地研制成飼用微生態制劑， 廣泛應用于畜牧業、飼料等行業。目前對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物質的分離純化與表征、 以及枯草芽孢桿菌的產酶特性和在豆柏中的應用效果研究等，而在提高枯草芽孢桿菌菌體產量的發酵技術方面則報道較少。
發明內容
本發明提供了一種高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，以提高枯草芽孢桿菌的菌體產量。本發明提供的高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，具體如下以枯草芽孢桿菌 {Bacillus subtil is)為菌種,經活化后接種到發酵培養基中培養。發酵培養基為可溶性淀粉12.5-17.5g/L、蛋白胨20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4 O. 25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8. 0 ;培養條件培養溫度 35-45°C、轉速 150-200r/min、裝液量 60-100mL/250mL ;接種量為 5-10% (v/v)，培養時間 16-18h。更優選地，發酵培養基為可溶性淀粉15g/L、蛋白胨22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、 Na2HPO4 O. 5g/L、MgS04 O. 5g/L，pH7. 0 ;培養溫度 37°C、轉速 200r/min、裝液量 80mL/250mL ； 接種量為5% (v/v)，培養時間16h。
所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂 15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
經過以上條件優化，枯草芽孢桿菌的細胞生物量可達4. 32X 109cfu/mL,比優化前 (I. 33X 108cfu/mL)提高了 31. 48 倍。本發明的顯著優點枯草芽孢桿菌是一種非常有應用價值和市場前景的微生態制劑，但在實際應用過程中仍然存在一些問題。在自然條件下的枯草芽孢桿菌，作用效果常常不理想，因此，要對其進行改良，使其在加工工藝、劑型和貯藏技術等環節上有所突破。本發明通過對培養基配方及培養條件的研究，為枯草芽孢桿菌的工業化發酵生產以及進一步開發利用打下基礎。
圖I枯草芽孢桿菌的生長曲線；圖2不同碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖3可溶性淀粉添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響圖4不同氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖5蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖6不同無機鹽種類對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖7培養基初始PH值對枯草芽孢桿菌生長的影響;圖8培養溫度對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖9轉速對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖10培養基裝液量對枯草芽孢桿菌生長的影響；圖11接種量對枯草芽孢桿菌生長的影響。
具體實施例方式以下實施例采用的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌E菌株(參考文獻趙瑩等，枯草芽孢桿菌發酵蔗渣生產黃腐酸的工藝條件優化.福州大學學報(自然科學版)，2010，38
(2):290-296)，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例I
1.枯草芽孢桿菌生長曲線的測定
將枯草芽孢桿菌活化后，以5%(v/v)的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基(牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化鈉 5g，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2)中，裝液量 100mL/250mL，在 30°C、 200r/min下培養，分別采用分光光度法和平板菌落計數法測定不同培養時間時的0D_值和菌落數，以培養時間為橫坐標、分別以0D_值和菌落數為縱坐標繪制生長曲線圖(圖I)。 由生長曲線確定枯草芽孢桿菌的最佳培養時間為16h。
2.枯草芽孢桿菌的培養基配方優化
以牛肉膏蛋白胨液體培養基為基礎培養基，研究不同碳源、氮源、無機鹽對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響。培養條件接種量5%(v/v)，裝液量100mL/250mL，在30°C、200r/min 下培養16h。
2.1碳源種類對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
分別以1% (表示g/100mL，以下類同)的蔗糖、環糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、葡萄糖為碳源，取代牛肉膏蛋白胨液體培養基中的牛肉膏，考察它們對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響，以碳源種類為橫坐標，0D_增長量為縱坐標作圖。圖2顯示，以可溶性淀粉為碳源時，枯草芽孢桿菌的OD6tltl增長量最大，為O. 798 (菌懸液稀釋10倍測定)；而用乙酸鈉和葡萄糖作為碳源時，0D_增長量較小。綜合細胞生物量和培養基成本進行考慮，確定采用可溶性淀粉作為碳源。2.2碳源添加量對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
比較可溶性淀粉不同添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響，以碳源添加量為橫坐標， 0D_增長量為縱坐標作圖，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_ (圖3)。結果表明，隨著可溶性淀粉添加量的增加，0D_增長量也不斷提高；當碳源添加量為I. 5%時，枯草芽孢桿菌的 OD600增長量達到最高，為O. 544 ;隨之繼續增加可溶性淀粉的添加量，OD600增長量下降。因此，確定枯草芽孢桿菌可溶性淀粉的最適添加量為I. 5%。2.3氮源種類對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
在碳源優化的基礎上，分別以1%的蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉為氮源，考察它們對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響，以氮源種類為橫坐標，OD600增長量為縱坐標作圖(圖4)。結果表明，枯草芽孢桿菌利用蛋白胨作為氮源時，OD6tltl增長量最高， 為1.475 ;而采用無機氮源時，細胞生物量相對較低，因此選取蛋白胨作為培養基的氮源。2.4氮源添加量對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
以蛋白胨添加量為橫坐標，以OD6tltl增長量為縱坐標，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_ (圖5)。結果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增長量也隨之提高；當蛋白胨添加量為
2.25%時，枯草芽孢桿菌的0D_增長量達到最高，為O. 718 ;隨后繼續增加蛋白胨的添加量， OD600增長量有所下降。因此，確定枯草芽孢桿菌的蛋白胨最適添加量為2. 25%。2.5無機鹽種類對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
在碳源、氮源優化的基礎上，分別以O. 5%的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、鑰酸鈉、 硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵為無機鹽添加到培養基中，以無機鹽種類為橫坐標，OD600 增長量為縱坐標，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_ (圖6)，確定最佳無機鹽。結果表明，當以NaCl、Na2HPO4, MgSO4作為無機鹽時，枯草芽孢桿菌的OD6tltl增長量較大，分別為O. 751、
O.872,0. 758，因此選擇NaCl、Na2HP04、MgS04作為枯草芽孢桿菌培養的最佳無機鹽。在確定最佳無機鹽種類的基礎上，進一步深入研究無機鹽的最適添加量及其相互作用。2.6無機鹽添加量對枯草芽孢桿菌細胞生物量的影響
不同的微生物生長所需的無機鹽種類和濃度不同。上述實驗結果表明，NaCl, Na2HPO4 和MgSO4對枯草芽孢桿菌生長的影響較為明顯，因此以這三種鹽為考察因素設計正交試驗 L9(34)，對無機鹽配方進行優化。通過單因素試驗，初步確定上述無機鹽的較優水平分別為 NaCl 0%-0. 25%、Na2HPO4 0%-0. 1%, MgSO4 0%-0. 1%。表I枯草芽孢桿菌無機鹽優化正交試驗因素和水平表
權利要求
1.一種高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于以枯草芽孢桿菌OfeciJAz1S subti I is)為菌種，經活化后接種到發酵培養基中培養；發酵培養基為可溶性淀粉12.5-17. 5g/L、蛋白胨 20-25 g/L、NaCl I. 5-2. 75 g/L、Na2HPO4 O. 25-0. 75g/L、MgSO4O.25-0. 75g/L，ρΗ6· 0-8.0 ;培養條件培養溫度 35-45 °C、轉速 150_200r/min、裝液量 60-100mL/250mL ;接種量為 5-10% (v/v)，培養時間 16_18h。
2.根據權利要求I所述的高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述發酵培養基為可溶性淀粉 15g/L、蛋白胨 22. 5g/L、NaCl 2. 5g/L、Na2HPO4 O. 5g/L、MgSO4 O. 5g/ L, ρΗ7· O0
3.根據權利要求I所述的高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述培養條件為培養溫度37°C、轉速200r/min、裝液量80mL/250mL ;接種量為5% (v/v)，培養時間 16h0
4.根據權利要求I所述的高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7· 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵領域，更具體涉及一種高密度培養枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的方法，以提高枯草芽孢桿菌的菌體產量。本發明提供的高密度培養枯草芽孢桿菌的方法，該方法以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為菌種，經活化后接種到發酵培養基中培養。經過優化，枯草芽孢桿菌的細胞生物量可達4.32×109cfu/mL，比優化前(1.33×108cfu/mL)提高了31.48倍。本發明通過對培養基配方及培養條件的研究，為枯草芽孢桿菌的工業化發酵生產以及進一步開發利用打下基礎。
文檔編號C12R1/125GK102586153SQ20121005629
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者嚴芬, 葉秀云, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 陳江平 申請人:福州大學