專利名稱：糖化血紅蛋白測量用多層試驗片及使用其的測量方法
技術領域：
本發明涉及一種用于在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。
背景技術：
測量糖化蛋白質在進行糖尿病的診斷、預防以及治療方面非常重要。糖化蛋白質通過在生物體內葡萄糖與血中蛋白質的氨基(主要是末端氨基酸的α-氨基、賴氨酸殘基的Y-氨基)發生非酶促反應而生成。由于蛋白質糖化的程度直接與血中葡萄糖濃度(以下稱為血糖值)成比例，因此，例如，糖化血紅蛋白的情況下，通過測量糖化蛋白質可以掌握約2 3個月內的血糖控制狀態，糖化白蛋白的情況下，通過測量糖化蛋白質可以掌握約 2 3周內的血糖控制狀態。
尤其是作為糖化血紅蛋白的一種的血紅蛋白Alc在糖尿病的診斷時被認為是最重要的。
作為上述糖化蛋白質的測量方法，已知有高效液相色譜(HPLC)法、免疫法以及酶法等。在現有技術中，高效液相色譜(HPLC)法以及免疫法占據大部分，但是近年來由于酶法可以迅速、大量、正確且廉價地對大量樣本進行測量，因此也開始被頻繁采用。
有關酶法，例如已知有通過以下的工序對糖化蛋白質進行比色定量的技術(例如，參照專利文獻I 4)。
(I)使待測試樣中的紅細胞溶血以提取出糖化血紅蛋白的工序。
(2)使上述糖化血紅蛋白與蛋白酶反應從而從糖化血紅蛋白的糖化的β鏈N末端切出糖化氨基酸和/或糖化肽的工序。
(3)使上述糖化氨基酸和/或糖化肽與糖化氨基酸氧化酶反應從而生成過氧化氫的工序。
(4)在過氧化物酶的存在下使上述過氧化氫與氧化還原類顯色試劑反應而顯色的工序。
(5)根據上述顯色對待測試樣中的糖化血紅蛋白含量進行比色定量的工序。
但是，所涉及的現有技術是稀釋待測試樣、添加液體狀態的試劑、使之在反應容器內發生反應后測量反應液的吸光度的方法，以使用生物化學自動分析裝置的方法為主流，但是所述生物化學自動分析裝置存在是大型裝置且價格昂貴、需要熟練的檢測技師來操作、從採血到出報告結果為止的時間較長這些問題，難以適用于P0CT(point of care testing (即，臨床現場即時檢查))。
另一方面，為解決上述問題，發明了糖化蛋白質測量用試驗片(例如專利文獻5)， 該試驗片利用了所謂的干化學法，在該方法中，通過以干燥狀態將試劑承載在基材上，再向其添加液體狀態的待測試樣，從而將待測試樣中的水分作為溶劑而使反應得以進行。該發明改良點如下裝置為小型且廉價，操作簡便，從採血到出報告結果為止可以短時間完成。 但是，存在得不到能夠經得起實際使用的保存穩定性的問題，即糖化氨基酸氧化酶發生失活、分解、氧化還原類顯色試劑發生自顯色的問題。另外，從POCT的觀點出發，待測試樣的血液樣本必須進行溶血等前處理這一點也存在問題。
另外，還公開了利用了干化學法的由多層構成的試劑試驗片的發明(例如參照專利文獻6)。該發明也具有如下改良點裝置為小型且廉價，操作簡便，從採血到出報告結果為止可以短時間完成，但是，存在得不到能夠經得起實際使用的保存穩定性的問題，即氧化還原類顯色試劑發生自顯色的問題。另外，如從將血液分離層配置在第一層也會獲知的那樣，該發明僅僅設想對糖化蛋白質中的作為血漿蛋白質的糖化白蛋白進行測量，而沒有公開任何有關測量糖化血紅蛋白的具體例子。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1:國際公開第2002-006519號
專利文獻2:特開2004-222570號公報
專利文獻3:特開2007-181466號公報
專利文獻4:特開2010-148515號公報
專利文獻5:特開2004-333452號公報
專利文獻6:特開2004-004071號公報
非專利文獻
非專利文獻1:Clinical Chemistry 43:122390-2396(1997) 發明內容
發明所要解決的技術問題
本發明是以有關現有技術的技術問題為背景進行的。即，本發明的目的為提供一種用于在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。更具體而言，本發明的目的在于提供一種保存穩定性優異的、用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。
解決技術問題的手段
本申請發明人發現，當將蛋白酶與糖化氨基酸氧化酶承載在相同層時，在保存中發生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶失活和/或分解，從而導致保存穩定性顯著降低。
另外還發現，當將過氧化物酶與氧化還原類顯色試劑承載在相同層時，在保存中發生由過氧化物酶引起的氧化還原類顯色試劑的自顯色，從而導致保存穩定性顯著降低。 由于與葡萄糖濃度等相比，待測試樣中的糖化血紅蛋白濃度一般為低濃度，因此在測量糖化血紅蛋白時優選使用高靈敏度的無色色素，但無色色素特別不穩定，容易發生自顯色。
因而本申請發明人將蛋白酶與糖化氨基酸氧化酶承載在不同層上，并且將蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更靠近待測試樣點樣面的層上。由此發現，糖化氨基酸氧化酶的保存穩定性顯著提高，并且蛋白酶的反應性也提高，測量精度也提高，從而完成了本發明。此外，通過將過氧化物酶與氧化還原類顯色試劑分別承載在不同層上，使提高氧化還原類顯色試劑的保存穩定性同時獲得成功，從而完成了本發明。
S卩，本發明具有以下構成要素。
1、一種多層試驗片，用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，其特征在于該多層試驗片至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、 (b)層的順序層疊，在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過氧化物酶和氧化還原類顯 色試劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分 子基材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
2、根據I所述的多層試驗片，其特征在于所述多層試驗片在(a)層和(b)中的至 少一層上還承載有表面活性劑。
3、一種多層試驗片，用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，其特征在于所述多 層試驗片至少層疊有下述(a)層、(b)層和(C)層，所述(a)層、(b)層和(C)層從待測試樣 點樣面按(a)層、(b)層及(C)層、(a)層、(C)層及(b)層或(C)層、(a)層及(b)層的順 序層疊，在(a)層、(b)層和(C)層中的不同層上分別承載過氧化物酶和氧化還原類顯色試 劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分子基 材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材，(C)層至少承載有除蛋白酶和糖 化氨基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。
4、根據3所述的多層試驗片，其特征在于所述多層試驗片在(a)層、(b)層和(C) 層中的至少一層上還承載有表面活性劑。
5、根據I至4中任一項所述的多層試驗片，其特征在于蛋白酶是選自至少由 來自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈霉菌 (Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶組成的組中的一種以上。
6、根據I至5中任一項所述的多層試驗片，其特征在于氧化還原類顯色試劑是最 大吸收波長為600nm 800nm的無色色素。
7、根據I至6中任一項所述的多層試驗片，其特征在于表面活性劑是親水親油平 衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value HLB Value)為 10 20 的非離子性表面活 性劑。
8、一種測量方法，其特征在于所述測量方法使用權利要求1 7中任一項所述的 多層試驗片，至少經過以下工序⑴ (iii)對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，工序⑴ 在上述多層試驗片上表面上點樣待測試樣的工序；工序(ii):從與上述多層試驗片的待測 試樣點樣面相反的面利用反射光測量反射率和/或吸光度的工序；以及工序(iii):從所得 的反射率和/或吸光度計算出選自由血紅蛋白含量、糖化血紅蛋白含量、糖化血紅蛋白含 量與血紅蛋白含量的比所組成的組中的一個以上的工序。
9、根據8所述的測量方法，其特征在于待測試樣為全血樣本。
發明效果
根據本發明，能夠提供一種用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗 片，該多層試驗片抑制了糖化氨基酸氧化酶的失活或分解，并且抑制了氧化還原類顯色試 劑的自顯色，且保存穩定性優異。
圖1是本實施例中使用的用于上下夾持試驗片將其固定的板狀夾具。本夾具設置 有兩個貫穿孔。
具體實施方式
以下，對本發明進行詳細闡述。
(測量對象物)
本發明的測量對象物是糖化血紅蛋白，從糖尿病診斷應用的觀點出發，優選血紅蛋白的β鏈N末端被糖化的血紅蛋白Alc (以下有時也稱為HbAlc)。
(待測試樣)
作為本發明的待測試樣，可以列舉出全血、血細胞、血漿、血清、髓液、汗、尿、淚液、 唾液、皮膚、粘膜、毛發等生物體試樣(即從生物體上采取的試樣)或飲料水、調料等食品類。另外，生物體試樣不僅限于來自人體，來自狗、貓、牛等哺乳類動物的生物體試樣也是對象。其中，從糖尿病診斷應用的觀點出發，優選全血或血細胞，從POCT的觀點出發，更優選未進行血細胞/血漿或血清分離前處理的全血。
本發明中待測試樣的量沒有特 別限定，例如優選為IyL 50 μ L，更優選為 I μ L 40 μ L，進一步優選為I μ L 30 μ L。如果待測試樣量少于I μ L，則恐怕無法從多層試驗片的最上層展開到最下層。另一方面，如果待測試樣量多于50 μ L，則例如待測試樣為血液時，由于患者的負擔變大，因此不優選。
(測量原理)
本發明中糖化血紅蛋白的測量原理是通過所謂的酶比色法進行測量，在該方法中，借助待測試樣中的水分進行酶促反應(所謂的干化學法)，從而使多層試驗片顯色，然后通過測量反射光來測量其顯色程度。通過使用上述測量原理，裝置的小型、輕量、低價格化成為可能。另外，正確、簡便且迅速的測量成為可能。
以下，對測量紅細胞中的糖化血紅蛋白含量時的反應進行說明，但這并不構成對本發明的任何限制。
(I)使待測試樣中的紅細胞與表面活性劑反應、使之溶血以提取出糖化血紅蛋白的工序。
(2)使上述糖化血紅蛋白與蛋白酶反應從而從糖化血紅蛋白的糖化的β鏈N末端切出糖化氨基酸和/或糖化肽的工序。
(3)使上述糖化氨基酸和/或糖化肽與糖化氨基酸氧化酶反應從而生成過氧化氫的工序。
(4)在過氧化物酶的存在下使上述過氧化氫與氧化還原類顯色試劑發生反應而顯色的工序。
(5)根據上述顯色對待測試樣中的糖化血紅蛋白含量進行比色定量的工序
(多層試驗片)
本發明的多層試驗片由多個高分子基材(以下有時也稱為層)構成。上述多層試驗片的層數可以根據實施方式而變化，優選為2 7層，更優選為2 6層，進一步優選為 2 5層。另外，除了本發明所需要的承載有試劑(表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑等)的高分子基材外，層數中還包括用于展開血液的展開層或透明支撐層等。層數為一層時，蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶以及過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑等不得不承載在同一層，恐怕會產生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶的失活、分解或氧化還原類顯色試劑的自顯色。即，多層試驗片的保存穩定性恐怕會顯著降 低。另一方面，層數多于7層時，由于從最上層到最下層展開所需的待測試樣量變多，因此 不優選。
上述多層試驗片可以采用任意的工序制作而成。代表性地，可以采用將多個層分 別浸潰在一種以上的試劑溶液中后再干燥的慣用工序來制作多個層，然后組裝成最終的試 驗片。
上述多層試驗片的特征為不含有血液分離層。另外，血液分離層是指用于通過從 全血過濾血細胞而得到血漿或血清的層。本發明的測量對象物不是血漿或血清中所含的糖 化白蛋白，而是血細胞中所含的糖化血紅蛋白，因此，將血細胞過濾之后則無法測量。
(層結構)
上述多層試驗片的層結構需要將蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更靠近待測 試樣點樣面的層(以下，有時也稱為上層)上。當將蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更遠 離待測試樣點樣面的層(以下，有時也稱為下層)上時，恐怕會導致蛋白酶不能充分反應， 從而降低靈敏度。
另外，上述多層試驗片的層結構需要將蛋白酶與糖化氨基酸氧化酶分別承載在不 同的層上，進一步優選將過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑分別承載在不同層上。當將蛋 白酶與糖化氨基酸氧化酶承載在相同層時，恐怕會發生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶 的失活、分解，當將過氧化物酶與氧化還原類顯色試劑承載在相同層時，恐怕會發生氧化還 原類顯色試劑的自顯色。即，多層試驗片的保存穩定性恐怕會顯著降低。以下示出層結構 的具體例子，但這并不構成對本發明的任何限制。
當設上述多層試驗片的第一層側為待測試樣點樣面、第二層側為反射光測量面 時，可以列舉出蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更上層的以下結構。
色試劑。1、第一層蛋白酶、過氧化物酶；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、氧化還原類顯2、第一層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧3、第一層蛋白酶；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯4、第一層蛋白酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑；以及第二層糖化氨基酸 其中，更優選將過氧化物酶與氧化還原類顯色試劑分別承載在不同層的以下結1、第一層蛋白酶、過氧化物酶；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、氧化還原類顯2、第一層:蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧
化物酶。
色試劑。
氧化酶。
構。
色試劑。
化物酶。
進一步優選將氧化還原類顯色試劑承載在反射光測量面(第二層)上的、可以期 待進行高靈敏度的測量的以下結構。
1、第一層蛋白酶、過氧化物酶；以及第二層糖化氨基酸氧化酶、氧化還原類顯色試劑。
當設上述多層試驗片的第一層側為待測試樣點樣面、第三層側為反射光測量面 時，可以列舉出蛋白酶承載在比糖化氨基酸氧化酶更上層的以下結構。
1、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三層過氧化物酶、氧化還 原類顯色試劑。
2、第一層蛋白酶；第二層過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
3、第一層蛋白酶；第二層氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化 酶、過氧化物酶。
4、第一層過氧化物酶；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
5、第一層氧化還原類顯色試劑；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化 酶、過氧化物酶。
6、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶；以及第三層氧化還 原類顯色試劑。
7、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶、氧化還原類顯色試劑；以及第三 層過氧化物酶。
8、第一層蛋白酶；第二層過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
9、第一層過氧化物酶；第二層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
10、第一層氧化還原類顯色試劑；第二層蛋白酶、過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
11、第一層蛋白酶、過氧化物酶；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三層氧化 還原類顯色試劑。
12、第一層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三 層過氧化物酶。
13、第一層過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
14、第一層蛋白酶、過氧化物酶；第二層氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
15、第一層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；第二層過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
其中，更優選將過氧化物酶與氧化還原類顯色試劑分別承載在不同層上的以下結 構。
2、第一層蛋白酶；第二層過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
3、第一層蛋白酶；第二層氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化 酶、過氧化物酶。
4、第一層過氧化物酶；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
5、第一層氧化還原類顯色試劑；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化 酶、過氧化物酶。
6、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶；以及第三層氧化還 原類顯色試劑。
7、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶、氧化還原類顯色試劑；以及第三 層過氧化物酶。
9、第一層過氧化物酶；第二層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
10、第一層氧化還原類顯色試劑；第二層蛋白酶、過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
11、第一層蛋白酶、過氧化物酶；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三層氧化 還原類顯色試劑。
12、第一層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三 層過氧化物酶。
14、第一層蛋白酶、過氧化物酶；第二層氧化還原類顯色試劑；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
15、第一層蛋白酶、氧化還原類顯色試劑；第二層過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶。
進一步優選將氧化還原類顯色試劑承載在反射光測量面(第三層)上的、可以期 待進行高靈敏度的測量的以下結構。
2、第一層蛋白酶；第二層過氧化物酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
4、第一層過氧化物酶；第二層蛋白酶；以及第三層糖化氨基酸氧化酶、氧化還 原類顯色試劑。
6、第一層蛋白酶；第二層糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶；以及第三層氧化還 原類顯色試劑。
11、第一層蛋白酶、過氧化物酶；第二層糖化氨基酸氧化酶；以及第三層氧化 還原類顯色試劑。
優選上述各層(第一層、第二層、第三層)中的至少一層進一步承載有表面活性 劑。另外，只要蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶以及過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑不存在 于同一層，則上述試劑(表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類 顯色試劑等)可以重復承載于各層(第一層、第二層、第三層)。此外，根據需要各層可以承 載有緩沖劑。
(高分子基材)
作為構成本發明的多層試驗片的高分子基材，只要能夠承載所需量的上述試劑 (表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑等)，并且待 測試樣能夠在水平方向以及豎直方向適當地展開，則可以使用任何形態、組成的材料。以下示出高分子基材的形態、組成的具體例子，但這并不構成對本發明的任何限制。
(形態)
作為上述高分子基材的形態，可以列舉出濾紙、纖維結構體、多孔質膜(膜過濾器)、薄膜等可以自支撐的材料或高分子凝膠等不能自支撐的材料。另外，使用高分子凝膠等不能自支撐的材料時，優選設置濾紙、纖維結構體、多孔質膜(膜過濾器)、薄膜等可以自支撐的材料作為支撐體。
(組成)
作為上述高分子基材的組成，可以列舉出作為聚酯樹脂的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和聚萘二甲酸丁二醇酯(PBN)等；作為烯烴樹脂的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚丁烯等；作為乙烯基樹脂的聚氯乙烯(PVC)、聚偏氯乙烯和聚醋酸乙烯等；丙烯酸樹脂；丙烯酸酯樹脂；作為氟樹脂的聚四氟乙烯(PTFE)和聚偏氯乙烯(PVDF)等；聚碳酸酯樹脂；作為聚醚樹脂的聚甲醛(POM)、 聚苯醚(PPO)、聚醚酮(PEK)、聚醚醚酮(PEEK)、聚苯硫醚(PPS)、聚砜(PSU)、聚醚砜(PES) 和聚醚酰亞胺(PEI)等；作為聚酰胺樹脂的尼龍和芳酰胺等；以及作為纖維素類的醋酸纖維素、硝化纖維素和再生纖維素等。
上述高分子基材的形狀沒有特別限定，例如可以列舉出正方形、長方形、圓形、橢圓形等薄板狀。
從裝置的小型、輕量、低價格化的觀點出發，上述高分子基材的面積越小越好，但是例如優選為1_2 IOOOmm2,更優選為2mm2 500mm2,進一步優選為5mm2 200mm2。
從待測試樣的展開性以及酶(蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶)反應性的觀點出發，上述高分子基材的(一層的)厚度例如優選為IOym 2000μπι，更優選為 20 μ m 1000 μ m,進一步優選為 50 μ m 500 μ m。
(檢測)
對反應進行檢測時，最簡便的是向已經顯色的多層試驗片照射光(入射光)，然后檢測其反射光，但是也可以使用除此以外的方法。作為光源沒有特別限定，例如可以列舉出 UV燈、氙燈、氪燈、水銀燈、氘燈、鎢絲燈、鹵素燈、發光二極管(LED)、激光等。其中，從光波長控制的容易性以及裝置的小型、輕量、低價格化的觀點出發，優選發光二極管(LED)。上述入射光的角度(入射角)沒有特別限定，可以采用任意的角度。另一方面，對反射光的檢測沒有特別限定，優選垂直于檢測面。此外，若使用光電二極管或積分球則可以容易地進行檢測。
(蛋白酶)
作為本發明所使用的蛋白酶，只要能夠與糖化血紅蛋白的糖化的β鏈N末端作用而切出糖化氨基酸和/或糖化肽，則可以使用任何種類的蛋白酶，例如可以列舉出來自動物、植物、微生物的蛋白酶等。以下示出蛋白酶的具體例子，但這并不構成對本發明的任何限制。
(來自動物的蛋白酶)
作為來自動物的蛋白酶，可以列舉出因子Xa (factor Xa)、血纖維蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶(thrombin)、胃蛋白酶(pepsin)、亮氨酸氨肽酶 (Ieucinaminopeptidase)、膜液素(pancreatin)、膜妝酶(elastase)、膜蛋白酶(trypsin) > 糜蛋白酶 A (chtmotrypsin A)、氨肽酶 M(aminopeptidase Μ)、羧肽酶 A (carboxypeptidase A)、羧妝酶 B (carboxypeptidase B)、·丐蛋白酶(calpain)、組織蛋白酶B(cathepsin B)、組織蛋白酶C(cathepsin C)、組織蛋白酶D(cathepsin D)、內切蛋白酶 Arg-C(endoprotinaseArg-C)等。
(來自植物的蛋白酶)
作為來自植物的蛋白酶,可以列舉出羧肽酶W(carboxypeptidase W)、激肽釋放劑 (kallikrein)、無花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、糜木瓜酶(chimopapain)、菠蘿蛋白酶(bromelain)等。
(來自微生物的蛋白酶)
作為來自微生物的蛋白酶，可以列舉出以枯草桿菌蛋白酶(subtiIisin)、 嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、分散酶(dispase)、蛋白酶N (proteinase N)等為代表的來自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶；以IP酶等為代表的來自曲霉菌(Aspergillus) 的蛋白酶；以鏈霉蛋白酶(pronase)等為代表的來自鏈霉菌(Streptomyces)的蛋白酶；以蛋白酶K (proteinase K)等為代表的來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶；以肽酶R(peptidase R)等為代表的來自根霉(Rhizopus)的蛋白酶；以羧肽酶 P (carboxypeptidase P)、Η)酶等為代表的來自青霉菌(Penicillium)的蛋白酶；以內切蛋白酶Glu-C(endoprotinase Glu-C)等為代表的來自葡萄狀球菌(Staphylococcus)的蛋白酶；以梭菌蛋白酶(clostripain)等為代表的來自梭菌(Clostridium)的蛋白酶；以內切蛋白酶Lys-C(endoprotinase Lys-C)等為代表的來自溶桿菌(Lysobacter)的蛋白酶； 以金屬蛋白酶(metalIoendopeputidase)等為代表的來自豬茶(Grifola)的蛋白酶；以羧肽酶Y (carboxypeptidase Y)、蛋白酶A (proteinase A)等為代表的來自酵母(Yeast)的蛋白酶；以氨基肽酶T(aminopeptidase T)等為代表的來自棲熱菌(Thermus)的蛋白酶； 以內切蛋白酶Asp-N(endoprotinase Asp-N)等為代表的來自假單胞桿菌(Pseudomonus) 的蛋白酶；以及以質譜級賴氨酸肽鏈內切酶(Iysylendopeputidase)、消色肽鍵端解酶 (achromopeputidase)等為代表的來自無色菌(Achromobacter)的蛋白酶等。
其中，從穩定性、反應性(血紅蛋白的切斷速度)、獲得的容易性、價格等原因出發，優選來自微生物的蛋白酶，更優選為選自由來自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶所組成的組中的一種以上。作為市售品，作為來自桿狀菌 (Bacillus)白勺蛋白酶的Toyoteam NEP (卜3千一 ^ NEP,東洋紡織公司制)、Type_X(SIGMA 公司制)、Type-XXIV(SIGMA公司制)、嗜熱菌蛋白酶(大和化成公司制)、高溫蛋白酶 PClO (大和化成公司制)、作為來自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶的Type-XIII (SIGMA 公司制)、Type-XXIII (SIGMA公司制)、作為來自鏈霉菌(Streptomyces)的蛋白酶的 Type-XIV以及作為來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶的蛋白酶K(Roche公司制)等適于使用。
其中，從測量血紅蛋白Alc的觀點出發，作為來自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶的 Toyoteam NEP(東洋紡織公司制)、Type-X(SIGMA 公司制)、Type-XXIV(SIGMA 公司制)、 嗜熱菌蛋白酶(大和化成公司制)、高溫蛋白酶PClO (大和化成公司制)、作為來自鏈霉菌 (Streptomyces)的蛋白酶的Type-XIV更適于使用。
只要達到目標活性，則上述蛋白酶可以是精制品，也可以是粗精制品。另外，也可 以是通過基因操作而制成的物質，而不管有無化學修飾。并且，上述蛋白酶可以單獨使用， 也可以兩種以上組合使用。
上述蛋白酶的濃度沒有特別限定，優選為O. lU/cm2 lOOOOU/cm2，更優選為IU/ cm2 1000U/cm2。蛋白酶濃度低于O. lU/cm2時，由于反應性降低而延長測量時間，因此不 優選。另一方面，蛋白酶濃度高于lOOOOU/cm2時，有時會導致背景升高或導致高價格化。
進行上述蛋白酶反應時的pH可以不進行調整，但優選通過適當的pH調整劑、例如 下列緩沖劑進行調整，以使所使用的蛋白酶達到最合適的pH。
(糖化氨基酸氧化酶)
本發明所使用的糖化氨基酸氧化酶(以下有時也稱為果糖基氨基酸氧化酶FA0D) 在公知文獻中被稱為以下各種名稱果糖基胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基縮氨酸 氧化酶、果糖基胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基縮氨酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化 氨基酸氧化酶、糖化縮氨酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化氨基酸氧化酶、糖化縮氨酸氧化酶、 阿馬多里酶(amadoriase)、酮胺氧化酶、酮胺氧化酶等。
作為本發明所使用的糖化氨基酸氧化酶，只要是與糖化氨基酸和/或糖化肽產生 特異性作用而生成過氧化氫的酶，則可以使用任何種類的酶。以下示出糖化氨基酸氧化酶 的具體例子，但這并不構成對本發明的任何限制。
作為糖化氨基酸氧化酶,可以列舉出來自赤霉菌(Gibberella)的酶、來自曲霉 菌(Aspergillus)的酶、來自青霉菌(Penicillium)的酶、來自鐮刀菌(Fusarium)的酶、 來自棒狀桿菌(Corynebacterium)的酶、來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶、來自正青霉 菌(Eupenicillium)的酶、來自Achaetomiella的酶、來自毛殼菌(Chaetomium)的酶、來 自大腸菌的酶、來自德巴利氏酶(Debaryomyces)的酶、來自彎孢菌(Curvularia)的酶、 來自新赤殼菌(Neocosmospora)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶、來自暗球腔菌 (phaeosphaeria)的酶、來自念珠菌(Candida)的酶以及來自頂荀霉菌(Acremonium)的酶坐 寸ο
其中，從穩定性、反應性(糖化氨基酸和/或糖化肽的氧化速度)、獲得的容易 性、價格等原因出發，優選為選自由來自子囊殼菌(Coniochaeta)的酶、來自正青霉菌 (Eupenicillium)的酶、來自彎抱菌(Curvularia)的酶、來自新赤殼菌(Neocosmospora) 的酶、來自曲霉菌(Aspergillus)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶和來自暗球 腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上，更優選為選自由來自子囊殼菌 (Coniochaeta)的酶、來自曲霉菌(Aspergillus)的酶、來自隱球菌(Cryptococcus)的酶和 來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上。
其中，從測量血紅蛋白Alc的觀點出發，優選為選自由來自子囊殼菌 (Coniochaeta)的酶和來自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所組成的組中的一種以上。
只要達到目標活性，則上述糖化氨基酸氧化酶可以是精制品，也可以是粗精制品。 另外，也可以是由基因操作所制成的物質，而不管有無化學修飾。并且，上述糖化氨基酸氧 化酶可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。
上述糖化氨基酸氧化酶的濃度沒有特別限定，優選為O. 01U/cm2 lOOOU/cm2，更 優選為O. lU/cm2 lOOU/cm2。糖化氨基酸氧化酶濃度低于O. 01U/cm2時，由于反應性降低而延長測量時間，因此不優選。另一方面，糖化氨基酸氧化酶濃度高于lOOOU/cm2時，有時 會導致背景升高或導致高價格化。
進行上述糖化氨基酸氧化酶反應時的pH可以不進行調整，但優選通過適當的pH 調整劑、例如下列緩沖劑進行調整，以使所使用的糖化氨基酸氧化酶達到最合適的pH。
(過氧化物酶)
作為本發明所使用的過氧化物酶，只要是能夠催化過氧化氫和氧化還原類顯色試 劑反應的酶，則可以使用任何種類的酶，可以列舉出例如來自植物、來自細菌、來自擔子菌 的過氧化物酶。其中，從純度、獲得的容易性、價格等原因出發，優選為來自西洋芥末、稻子、 大豆的過氧化物酶，更優選為來自西洋芥末的過氧化物酶。作為市售產品，PE0-131(東洋 紡織公司制)、PE0-301 (東洋紡織公司制)、PE0-302 (東洋紡織公司制)等適于使用。
上述過氧化物酶的濃度沒有特別限定，優選為O. 01U/cm2 lOOOU/cm2，更優選為 0. lU/cm2 100U/cm2。過氧化物酶濃度低于0. 01U/cm2時，由于反應性降低而延長測量時 間，因此不優選。另一方面，過氧化物酶濃度高于lOOOU/cm2時，有時會導致背景升高或導 致高價格化。
進行上述過氧化物酶反應時的pH可以不進行調整，但優選通過適當的pH調整劑、 例如下列緩沖劑進行調整，以使所使用的過氧化物酶達到最合適的pH。
(氧化還原類顯色試劑)
作為本發明所使用的氧化還原類顯色試劑，只要能夠與過氧化氫反應而呈色，則 可以使用任何種類的色素，可以列舉出例如氫供體和偶聯劑、隱色體等。另外，使用氫供體 和偶聯劑的代表例子是在過氧化物酶存在下通過過氧化氫使氫供體和偶聯劑進行氧化縮 合而形成色素的Trinder法。
以下示出氧化還原類顯色試劑的具體例子，但這并不構成對本發明的任何限制。
(氫供體)
作為氫供體，可以列舉出酚、酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺 衍生物等。具體而言，可以列舉出N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺(ALPS)、N-乙基_N_(3_磺 丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙 基-N- (3-磺丙基)-3，5- 二甲基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙 基-N- (2-羥基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯 胺(T00S)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N- (2-羥 基-3-磺丙基)_3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -乙酰乙二胺、 N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰乙二胺、N- (2-羥基-3-磺丙基)-2，5- 二甲基苯胺、 N-(2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-磺丙基苯胺、N-磺丙基-3，5- 二 甲氧基苯胺等。
(偶聯劑)
作為偶聯劑，可以列舉出4-氨基安替吡啉(4AA)、氨基安替吡啉衍生物、香蘭素二 胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、3_甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物 (MBTH methybenzthiazoline hydrazone)、橫化3_甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物 (SMBTH sulphonated methybenzthiazoline hydrazone)等。
(隱色體)
作為隱色體，可以列舉出三苯基甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯胺衍生物等。具 體而言，可以列舉出4，4’ -亞芐雙(N，N-二甲基苯胺)、4，4’ -雙(N-乙基_N_(3_磺丙 基氨基)-2,6- 二甲基苯胺)甲燒、1-(乙基氨基硫代擬基)_2_ (3, 5- 二甲氧基-4-輕基苯 基)-4，5_雙(4-二乙氨基苯基)咪唑、4，4’ -雙(二甲氨基)二苯胺、N-(羧甲基氨基羰 基)-4，4’ -雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(0六64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨 基)吩噻嗪鈉鹽(DA67)等。
其中，從摩爾吸光系數、最大吸收波長等原因出發，優選為隱色體，更優選為 N-(羧甲基氨基羰基)_4，4’ -雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(DA64)、10-(羧甲基氨基羰 基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪鈉鹽(DA67)。
上述氧化還原類顯色試劑的最大吸收波長優選為600nm 800nm,更優選為 650nm 750nm。從測量血紅蛋白Alc的觀點出發，最大吸收波長在小于600nm的低波長一 側時，由于氧化還原類顯色試劑的顯色光譜與血紅蛋白的光譜重合，恐怕會降低靈敏度。另 一方面，最大吸收波長在大于SOOnm的高波長一側時，檢測設備恐怕會大型化。
上述氧化還原類顯色試劑的濃度沒有特別限定，優選為O. 000lmg/cm2 IOmg/ cm2,更優選為O. 00lmg/cm2 lmg/cm2。氧化還原類顯色試劑濃度低于O. 000lmg/cm2時,恐 怕會降低靈敏度。另一方面，氧化還原類顯色試劑濃度高于lOmg/cm2時，有時會導致背景 升高或導致高價格化。
(表面活性劑)
作為本發明所使用的表面活性劑，只要起溶血劑和/或蛋白酶反應促進劑的作 用，則可以使用任何種類的表面活性劑，優選起溶血劑和蛋白酶反應促進劑的作用的表面 活性劑。
作為上述表面活性劑，可以列舉出聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注冊商標)系 表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij (注冊商標)系表面活性劑等)、聚氧乙烯山梨糖醇 酐脂肪酸酯(Tween (注冊商標)系表面活性劑等)、聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸 酯、烷基葡糖苷、脂肪酸蔗糖酯等非離子性表面活性劑。其中，從作為溶血劑的反應性(溶 血速度)、作為蛋白酶反應促進劑的作用性、價格等原因出發，優選聚氧乙烯烷基苯基醚 (Triton (注冊商標)系表面活性劑等)。作為市售商品,TritonX (注冊商標)-100 (Nacalai Tesque 公司制)、TritonX(注冊商標)-114 (Nacalai Tesque 公司制)、Nonidet (注冊商 標)P-40 (Nacalai Tesque公司制)等適于使用。另外,上述表面活性劑可以單獨使用，也 可以兩種以上組合使用。
上述表面活性劑的親水親油平衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value HLB Value)優選為10 20，更優選為12 20，進一步優選為14 20。HLB值小于10時，恐怕 得不到足夠的溶血效果以及促進蛋白酶反應的效果。另一方面，HLB值大于20的表面活性 劑在HLB的定義上不存在。
上述表面活性劑的濃度沒有特別限定,優選為O. 000lmg/cm2 10mg/cm2,更優選 為0. 00lmg/cm2 lmg/cm2。表面活性劑濃度低于0. 000lmg/cm2時，恐怕得不到足夠的溶血 效果以及蛋白酶反應促進效果。另一方面，表面活性劑濃度高于lOmg/cm2時，并未發現效 果提聞。
(緩沖劑)
作為可用于本發明的緩沖劑，只要在pH的目標范圍內具有充分的緩沖能力，則可以使用任何種類的緩沖劑，例如可以列舉出Tris、磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、硝酸、硼酸、酒石酸、醋酸、碳酸以及Good’ s buffer (MES, ADA、PIPES、ACES、鹽酸膽胺 (cholamine)、BES, TES, HEPES,乙酰甘氨酸、麥黃酮、甘氨酰胺、蠶豆嘧啶葡糖苷)等。
其中，從在本發明所使用的蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶以及過氧化物酶的最合適 pH范圍6. O 8. 5 (優選為6. O 7. 5)內具有充分的緩沖能力等理由出發，優選為Tris、 磷酸、MES、、PIPES、TES、HEPES,更優選為 MES、PIPES。
上述緩沖劑的濃度沒有特別限定，相對于多層試驗片制作時的試劑優選為 50mM IOOmM 左右。
(其他試劑)
本發明中除了上述試劑(表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、 氧化還原類顯色試劑等)外，還可以根據需要添加血紅蛋白的氧化劑(亞鐵氰化物、迭氮化物、亞硝酸鹽、硝酸鹽等)、捕捉妨礙酶反應的離子的螯合試劑(乙二胺、聯二吡啶、乙二胺四醋酸、菲繞啉、葉啉、冠醚等)、用于去除作為妨礙過氧化氫的定量的物質的抗壞血酸的抗壞血酸氧化酶、鹽類(氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁等)、酶穩定化劑(單糖類、低聚糖類、多糖類、糖醇、甘油、葡糖酸鹽、氨基酸類、白蛋白類、球蛋白類、纖維性蛋白質等)、 氧化還原類顯色試劑穩定化劑(環糊精(cyclodextrin)類、還原性硫醇類、還原性硫酸鹽類等)。這些可以單獨使用，也可以兩種以上組合使用。
實施例
以下通過實施例對本發明進行具體說明，但這并不構成對本發明的任何限制。另外，說明書中的評價方法如下所述。
[各種評價方法]
〈1、蛋白酶的活性測量〉
蛋白酶的活性通過使用了 Folin-Ciocalteu試劑的酪蛋白Folin法計算得出。在此，在蛋白酶的最適PH下，在37°C對酪蛋白加水分解I分鐘，將產生相當于l.Oymol的酪氨酸的呈色的酶量定義為IU。
〈2、糖化氨基酸氧化酶的活性測量〉
糖化氨基酸氧化酶的活性通過在過氧化物酶的存在下，使由糖化纈氨酰組氨酸 (valyl histidine)和糖化氨基酸氧化酶反應而產生的過氧化氫與氧化還原類顯色試劑產生反應，從其吸光度的變化而計算得出。在此，在糖化氨基酸氧化酶的最合適pH (pH = 6. 5) 下，在37°C對糖化纈氨酰組氨酸加水分解I分鐘，將產生相當于1. Ομπιο 的過氧化氫的酶量定義為IU。
〈3、過氧化物酶的活性測量〉
過氧化物酶的活性通過在過氧化物酶存在下，使過氧化氫和焦掊酚(Pyrogallol) 反應，從來自生成的紅紫掊精(Purpurogallin)的吸光度的變化而計算得出。在此,在過氧化物酶的最合適pH (pH = 6. O)下，在20°C反應20秒，將產生相當于1. Omg的紅紫掊精 (Purpurogallin)的呈色的酶量定義為IU。
〈4、親水親油平衡值((Hydrophile Lipophile Balance Value HLB Value))的測量>
HLB值是通過采用Griffin法，由HLB值=20X (親水部分的式量的總和/分子量)而計算得出。另外，表面活性劑的混合物的HLB值以各成分的HLB值的加權平均表示。
〈5、糖化氨基酸氧化酶的保存穩定性>
在8ι πιΦ的桐山濾紙NO. 5Α(東京硝子器械公司制)上,滴10 μ L下述試劑I,在 25°C的遮光干燥器3909-04(東京硝子器械公司制)中干燥2小時，制作成空白試驗片。
〈試劑1>
IOOmM PIPES (同仁化學研究所公司制)pH 6. 5
500U /mL糖化氨基酸氧化酶FP0-301 (東洋紡織公司制)
接著，作為加速試驗，將空白試驗片在37°C的可編程低溫恒溫器IN604(Yamato 科學公司制)中培育5小時。然后，將上述空白試驗片和IOOOyL下述試劑2添加至離心管(microtube)內，通過用潤流攪拌器(vortex mixer) (MS儀器公司制)攪拌I分鐘，從而提取出空白試驗片中的糖化氨基酸氧化酶。接著，將上述提取液在離心超濾管(MICR0C0N) 3 (Millipore公司制)中以14000G進行離心濃縮，從而獲得200 μ L濃縮液。接著，將上述濃縮液50 μ L與Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad Laboratiories公司制)47. 5 μ L、2_ 巰基乙醇(Bio-Rad Laboratiories 公司制)2. 5 μ L 混合,在 95°C下沸騰 5 分鐘，從而制得空白溶液。
〈試劑2>
IOOmM PIPES (同仁化學研究所公司制)pH 6. 5
100倍稀釋的一般用的蛋白酶抑制劑混合物，100倍濃縮(Nacalai Tesque公司制)
接著，作為加速試驗，將本發明的多層試驗片在37°C的可編程低溫恒溫器IN 604 (Yamato科學公司制)中培育5小時。然后，將上述多層試驗片和1000 μ L上述試劑2 添加至離心管(microtube)內，通過用鏇潤混合器(vortex mixer) (MS儀器公司制)攪拌I 分鐘，從而提取出多層試驗片中的表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑。其次，將上述提取液在離心超濾管(MICR0C0N)3(Millipore公司制) 中以14000G離心濃縮，除去分子量3000以下的低分子量成分(表面活性劑、氧化還原類顯色試劑等)，從而制得200 μ L濃縮液。接著，將上述濃縮液50 μ L與Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad Laboratiories 公司制)47. 5 μ L、2_ 疏基乙醇(Bio-Rad Laboratiories 公司制)2. 5 μ L混合，在95°C下沸騰5分鐘，從而制得樣品溶液。
使用電泳最佳組合套件(best package)(預制膠用(Bio-Rad Laboratiories公司制))，在下列條件I下，對所制得的空白溶液以及樣品溶液實施SDS-PAGE。另外，空白溶液以及樣品溶液流過相同凝膠的不同孔道。
〈條件1>
預制凝膠預制膠J 10% T>12well
電泳系統小型垂直電泳槽(mini protean Tetra cell)
電源基礎電泳儀電源(power pac Basic)
標準高精度雙標(precisionPlus dual standard)
電泳緩沖液預混合緩沖液Tris/甘氨酸/SDS
標準量10μ L
電泳上樣量20 μ L
電泳條件100V固定電壓、90分鐘
溫度25°C
接著，在密閉箱(tight box)NO. 3 (AS ONE公司制)中添加電泳后的凝膠和200mL 蒸懼水，用搖擺式混合機(rocking mixer) RM-80 (AS ONE公司制)振蕩5分鐘后除去蒸餾水，進行三次這樣的清潔操作。接著，添加50mL Bio-Safe CBB G-250染色劑(Bio-Rad Laboratiories公司制)的染色液,用上述搖擺式混合機振蕩I小時后除去上述染色液。最后，添加200mL蒸餾水，用上述搖擺式混合機振蕩I小時后除去蒸餾水，可以得到電泳圖譜。
使用GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad Laboratiories 公司制)根據通常的方法對所得到的電泳圖譜中50kDa附近的來自糖化氨基酸氧化酶的譜帶粗細(泳動方向的譜帶的尺寸)以及濃度(譜帶的吸光度)進行測量。分別從所得的空白以及樣品的譜帶粗細計算出下式(I)中的譜帶保持率1，從所得的空白以及樣品的譜帶濃度計算出下式(2)中的譜帶保持率2，將譜帶保持率I以及譜帶保持率2 ^ 90%設定為◎(優)，將譜帶保持率I以及譜帶保持率2 < 90%設定為X (不良)，對糖化氨基酸氧化酶的保存穩定性(即，耐分解性)進行評價。
[數學式I]
譜帶保持率I (% )=(樣品譜帶粗細/空白譜帶粗細)X 100式(I)
[數學式2]
譜帶保持率2 (% )=(樣品譜帶濃度/空白譜帶濃度)X 100式(2)
〈6、氧化還原類顯色試劑的保存穩定性>
將本發明的多層試驗片放入鋁制封口袋(Alumi lamizip) AL-9 (東京硝子器械公司制)中，封入氮氣后，在可編程低溫恒溫器IN 604(Yamato科學公司制)中，在4°C下培育 0、24、48、72、96、120、144、168、336、504小時，或在251下培育 0、24、48、72、96、120、144、 168、336、504小時。接著，用夾具(參照圖1)將上述多層試驗片從上下夾住固定，在下列條件2下，對承載有氧化還原類顯色試劑的層的一側的反射率進行測量。
< 條件 2>
裝置名稱分光光度計UV-2450 (島津制作所公司制)
附屬裝置名稱積分球ISR_2200(島津制作所公司制)
標準白板硫酸鋇標準白板
測量波長666nm(DA67的 Xmax)
入射角0°
狹縫(slit)寬度2.Onm
光束尺寸3mmX 5mm
溫度25°C
由所得的反射率通過下式(3)的Kubelka-Munk轉換計算出Κ/S值,對于3周(504 小時)之后的Κ/s值，將Κ/S值(4°C ) < O. 25且Κ/S值(25°C ) ^ O. 50設定為◎(優)， 將 0. 25<K/S 值(4°C) ^ 0. 35 且 0. 50 < Κ/S 值(25°C ) <0.60 設定為〇(良)，將 0.35 < Κ/S 值(4°C )彡 0. 40 且 0. 60 < Κ/S 值(25°C )彡1. 30 設定為Λ (尚可)，將 0. 40 < K/ S值(4°C )且1. 30 < Κ/S值(25°C )設定為X (不良)，對氧化還原類顯色試劑的保存穩定性(即，耐自顯色性)進行評價。如果氧化還原類顯色試劑自顯色則Κ/S值上升是公知的。此外，式(3)中的％ R是反射率的意思。
[數學式3]
Κ/S 值=(1-% R)2/(2X % R)式(3)
〈7、蛋白酶的反應性〉
在本發明的多層試驗片上，將100g/L的人類血紅蛋白H7379(SIGMA公司制)水溶液20 μ L點樣在第一層，在可編程低溫恒溫器IN 604(Yamato科學公司制)中，在37°C下培育0、5、10、15、30、60分鐘。接著，將上述多層試驗片和1000 μ L上述試劑2添加至離心管 (microtube)內，通過用鏇潤混合器(vortex mixer) (MS儀器公司制)攪拌I分鐘,從而提取出多層試驗片中的表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑。接著，將上述提取液在離心超濾管(MICR0C0N) 3 (Millipore公司制)中以14000G 離心濃縮，除去分子量3000以下的低分子量成分(表面活性劑、氧化還原類顯色試劑)，從而制得200 μ L濃縮液。接著，將上述濃縮液2. 5 μ L與蒸餾水47. 5 μ L、Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad Laboratiories 公司制)47. 5 μ L、2_ 疏基乙醇(Bio-Rad Laboratiories 公司制)2. 5 μ L混合，在95°C下沸騰5分鐘，從而制得樣品溶液I 6。
使用電泳最佳組合套件(best package)(預制膠用(Bio-Rad Laboratiories公司制))，在上述條件I下，對所制得的樣品溶液I 6實施SDS-PAGE。另外，樣品溶液I 6流過相同凝膠的不同孔道。
接著，在密閉箱(tight box)NO. 3 (AS ONE公司制)中添加電泳后的凝膠和200mL 蒸懼水，用搖擺式 混合機(rocking mixer) RM-80 (AS ONE公司制)振蕩5分鐘后除去蒸餾水，進行三次這樣的清潔操作。接著，添加50mL Bio-Safe CBB G-250染色劑(Bio-Rad Laboratiories公司制)的染色液,用上述搖擺式混合機振蕩I小時后除去上述染色液。最后，添加200mL蒸餾水，用上述搖擺式混合機振蕩I小時后除去蒸餾水，可以得到電泳圖譜。
使用GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad Laboratiories 公司制)根據通常的方法對所得到的電泳圖譜中16kDa附近的來自血紅蛋白亞基的譜帶粗細(泳動方向的譜帶的尺寸)以及濃度(譜帶的吸光度)進行測量。分別從所得的37°C下培育O分鐘至 60分鐘之后的譜帶粗細計算出下式(4)中的譜帶消失率1，從所得的37°C下培育O分鐘至 60分鐘之后的譜帶濃度計算出下式(5)中的譜帶消失率2，對于譜帶消失率I以及譜帶保持率達到90%以上的時間(以下，也稱為譜帶消失時間)，將O分鐘<譜帶消失時間< 5分鐘設定為 (優)，將5分鐘 < 譜帶消失時間< 15分鐘設定為〇(良)，將15分鐘 < 譜帶消失時間<30分鐘設定為Λ (尚可)，將30分鐘<譜帶消失時間設定為乂(不良)，對蛋白酶的反應性進行評價。
[數學式4]
譜帶消失率I ( % ) = {1-(譜帶粗細(O分鐘至60分鐘)/譜帶粗細(O分鐘))}Χ100 式(4)
[數學式5]
譜帶消失率2 ( % ) = {1-(譜帶濃度(O分鐘至60分鐘)/譜帶濃度(O分鐘))}Χ100 式(5)
〈8、氧化還原類顯色試劑的靈敏度、相關性>
使合成的果糖基繳氨酰組氨酸(fructosyl-valyl-histidine)(以下,有時也稱為F-VH)溶解在100g/L的人類血紅蛋白H7379 (SIGMA公司制)水溶液中，使其形成O μ m、 50μπι、100μπι、200μπι、500μΜ，調制成5個水平的測量試樣。接著，用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將20 μ L上述測量樣本點樣在第一層，在室溫下培育I 分鐘之后，在下列條件3下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。
< 條件 3>
測量試樣人類血紅蛋白Η7379 100g/L
F-VH O μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、200 μ Μ、500 μ M
裝置名稱分光光度計UV-2450 (島津制作所公司制)
附屬裝置名稱積分球ISR-2200 (島津制作所公司制)
標準白板硫酸鋇標準白板
測量波長666nm(DA67)、727nm(DA64)、555nm(T00S)、630nm(MA0S)
入射角0°
狹縫(slit)寬度2.Onm
光束尺寸3mmX 5mm
溫度25°C
由所得的F-VH在O μ M 500 μ M的反射率通過上式(3)的Kubelka-Munk轉換而得到F-VH在O μ M 500 μ M的Κ/S值。由所得到的F-VH在O μ M的Κ/S值和F-VH在 500 μ M的Κ/S值計算出下式(6)的Κ/S波動率，將Κ/S變動率彡2. O設定為◎(優)，將K/ S變動率<2. O設定為X (不良)，對氧化還原類顯色試劑的靈敏度進行評價。此外，式(6) 中的 Κ/s 值(O μ Μ)、Κ/S 值(500 μ Μ)分別是 F-VH 在 O μ M 的 Κ/S 值、F-VH 在 500 μ M 的 K/ S值的意思。
[數學式6]
Κ/S 變動率=Κ/S 值(500 μ Μ) /Κ/S 值(O μ Μ)式(6)
另外，計算出所得到的Κ/S值和F-VH濃度的Pearson相關系數r，將r > 0. 95設定為 (優)，將0.95彡r < 0.90設定為〇(良)，將0. 90彡r < 0. 85設定為Λ (尚可)， 將r < 0. 85設定為X (不良)，對相關性進行評價。
〈9、血紅蛋白Alc值校準曲線的制作〉
用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將HbAlc測量性能評價用試樣QRM HbAlc 2007-1 ( 一般社團法人檢查醫學標準物質機構公司制)20 μ L點樣在第一層，在37°C的可編程低溫恒溫器IN 604(Yamato科學公司制)中培育15分鐘之后，在下列條件4下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。
< 條件 4>
測量試樣HbAI c測量性能評價用試樣QRM
LEVEL 1、2、3、4、5
裝置名稱分光光度計UV-2450 (島津制作所公司制)
附屬裝置名稱積分球ISR-2200 (島津制作所公司制)
標準白板硫酸鋇標準白板
測量波長480nm、666nm
入射角0°
狹縫(slit)寬度2.Onm
光束尺寸3mmX 5mm
溫度25°C
由所得的在480nm處的反射率以及在666nm處的反射率通過上式(3)的 Kubelka-Munk轉換而得到在480nm處的Κ/S值以及在666nm處的Κ/S值。接著，由所得到的在480nm處的Κ/S值以及在666nm處的Κ/S值計算出下式(7)的Κ/S比。Κ/S比與血紅蛋白Alc值成比例(參照非專利文獻I)是公知的。另外，式中的Κ/S值(480nm)、K/S值 (666nm)分別是在480nm處的Κ/S值、在666nm處的Κ/S值的意思。
Κ/S 比=Κ/S 值(666nm)/K/S 值(480nm)式(7)
計算出所得到的Κ/S比與HbAlc測量性能評價用試樣QRM中所規定的HbAlc值 (LEVEL I = 4. 67%, LEVEL 2 = 5. 29%, LEVEL 3 = 6. 96%, LEVEL 4 = 9. 08%, LEVEL 5 =10. 79% )的Pearson相關系數1*，將r > O. 95設定為◎(優)，將O. 95彡r < O. 90設定為〇(良)，將0.90彡r< 0.85設定為Λ (尚可)，將r彡O. 85設定為父(不良)，對相關性進行評價。
〈10、血紅蛋白Alc值的測量〉
用夾具(參照圖1)將本發明的多層試驗片從上下夾住固定，將20UL健康人的全血或糖尿病患者的全血點樣在第一層，在37°C的可編程低溫恒溫器IN 604 (Yamato科學公司制)中培育15分鐘之后，在下列條件5下，對與測量試樣點樣面相反的面的反射率進行測量。另外，對健康人的血液以及糖尿病患者的血液，使用作為市售的自動分析儀的日立自動分析儀7180(日立高科公司制)以及作為市售的血紅蛋白Alc測量試劑的Nordia N HbAlc (積水醫療科技公司制)按照通常的方法進行了測量，計算出血紅蛋白Alc值。
<條件5>
測量試樣健康人的血液5個水平；糖尿病患者的血液5個水平
裝置名稱分光光度計UV-2450(島津制作所公司制)
附屬裝置名稱積分球ISR-2200(島津制作所公司制)
標準白板硫酸鋇標準白板
測量波長480nm、666nm
入射角0°
狹縫(slit)寬度2. Onm
光束尺寸3_X5_
溫度25°C
由所得的在480nm處的反射率以及在666nm處的反射率通過上式(3)的Kubelka--Munk轉換而得到在480nm處的Κ/S值以及在666nm處的Κ/S值。接著，由所得到的在480nm處的Κ/S值以及在666nm處的Κ/S值計算出上式(7)的Κ/S比。由所得到的K/S和上一'項所得到的校準曲線計算出血紅蛋白Alc值。計算出所得到的血紅蛋白Alc值在η = 10處的CV，將0%彡CV <5%設定為◎(優)，將5%彡CV< 10%設定為〇(良)，將 10%^ CV < 15%設定為Λ (尚可)，將15%彡CV設定為X (不良)，對差異進行評價。
[試驗片的制作]
[實施例1]
在8ι πιΦ的桐山濾紙NO. 5Α(東京硝子器械公司制)上滴10 μ L下述試劑3,接著在其他的8πιπιΦ的桐山濾紙NO. 5Α(東京硝子器械公司制)上滴10 μ L下述試劑4，分別在 250C的遮光干燥器3909-04 (東京硝子器械公司制)中對其干燥2小時，制作成兩種單層試驗片。通過對所得到的兩種單層試驗片進行層疊，而制作成多層試驗片。另外，所承載的表面活性劑濃度為O. lmg/cm2，蛋白酶濃度為lOU/cm2，糖化氨基酸氧化酶濃度為lOU/cm2，過氧化物酶濃度為40U/cm2，氧化還原類顯色試劑濃度為O. lmg/cm2。
所得到的多層試驗片的詳細情況示于表I。另外，表中的NP40、XIV、FP0、PE0、DA67 是Nonidet (注冊商標)P-40、蛋白酶Type-XIV、糖化氨基酸氧化酶FP0-301、過氧化物酶 PE0-302、DA67分別承載于各層的意思。以下相同。
< 試劑 3>
IOOmM PIPES (同仁化學研究所公司制)pH 6. 5
5. Omg/mL Nonidet (注冊商標)P-40 (Nacalai Tesque 公司制)
500U/mL 蛋白酶 Type-XIV (SIGMA 公司制)
< 試劑 4>
IOOmM PIPES (同仁化學研究所公司制)pH 6. 5
5. Omg/mL Nonidet (注冊商標)P-40 (Nacalai Tesque 公司制)
500U/mL糖化氨基酸氧化酶FP0-301 (東洋紡織公司制)
2000U/mL過氧化物酶PE0-302 (東洋紡織公司制)
5. Omg/mL DA67 (和光純藥工業公司制)
[實施例2 4]
除了表面活性劑、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、過氧化物酶、氧化還原類顯色試劑被承載的層不同外，其余與實施例1同樣地操作，制作成多層試驗片。所得到的多層試驗片具體示于表I。
表I
權利要求
1.一種多層試驗片，用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，其特征在于所述多層試驗片至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序層疊，在(a)層和(b)層中的不同的層上分別承載過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分子基材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
2.根據權利要求1所述的多層試驗片，其特征在于所述多層試驗片在(a)層和(b)中的至少一層上還承載有表面活性劑。
3.一種多層試驗片，用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，其特征在于所述多層試驗片至少層疊有下述(a)層、(b)層和(C)層，所述(a)層、(b)層和(C)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層及(C)層、(a)層、(C)層及(b)層或(C)層、(a)層及 (b)層的順序層疊，在(a)層、(b)層和(C)層中的不同層上分別承載過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑，而且所述多層試驗片不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分子基材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材，(c)層至少承載有除蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶外的任意試劑的高分子基材。
4.根據權利要求3所述的多層試驗片，其特征在于所述多層試驗片在(a)層、(b)層和(C)層中的至少一層上還承載有表面活性劑。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的多層試驗片，其特征在于蛋白酶是選自至少由來自桿狀菌(Bacillus)的蛋白酶、來自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、來自鏈霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及來自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶組成的組中的一種以上。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的多層試驗片，其特征在于氧化還原類顯色試劑是最大吸收波長為600nm 800nm的無色色素。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的多層試驗片，其特征在于表面活性劑是親水親油平衡值為10 20的非離子性表面活性劑。
8.一種測量方法，其特征在于所述測量方法使用權利要求1至7中任一項所述的多層試驗片，至少經過以下工序 (i) (iii)對糖化血紅蛋白含量進行比色定量，工序(i):在上述多層試驗片上表面上點樣待測試樣的工序；工序(ii):從與上述多層試驗片的待測試樣點樣面相反的面利用反射光測量反射率和/或吸光度的工序；以及工序(iii):從所得的反射率和/或吸光度計算出選自由血紅蛋白含量、糖化血紅蛋白含量、糖化血紅蛋白含量與血紅蛋白含量的比所組成的組中的一個以上的工序。
9.根據權利要求8所述的測量方法，其特征在于待測試樣為全血樣本。
全文摘要
本發明的目的為提供一種用于在診斷現場正確、簡便且迅速地對待測試樣中的糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗片以及測量方法。該多層試驗片是用于對糖化血紅蛋白含量進行比色定量的多層試驗片；至少層疊有下述(a)層和(b)層，所述(a)層和(b)層從待測試樣點樣面按(a)層、(b)層的順序層疊；在(a)層和(b)層上承載有過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑，且過氧化物酶和氧化還原類顯色試劑分別承載在不同的層上；并且不具有血液分離層，其中，(a)層至少承載有蛋白酶的高分子基材，(b)層至少承載有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
文檔編號C12Q1/28GK102998265SQ201210077269
公開日2013年3月27日 申請日期2012年3月21日 優先權日2011年9月15日
發明者岡本淳, 塚本曉, 中森雅彥 申請人:東洋紡織株式會社