專利名稱：微生物發酵生產低溫β-半乳糖苷酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫e -半乳糖苷酶微生物發酵方法。該發明生產的低溫0 -半乳糖苷酶主要應用于食品工業、環保、醫藥等領域，可以降低生產成本，減少工藝流程，提高生產效率，增加經濟效益，改善
產品質量。
背景技術：
^ -半乳糖苷酶(EC3. 2. I. 23)又稱為乳糖酶，^ -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，是一種無毒副作用的生物酶制劑。它能夠在特定的條件下水解P-D-半乳糖苷鍵(￠-1,4-糖苷鍵)，將乳糖水解成a -D-葡萄糖和3 -D-半乳糖，同時乳糖酶具有轉移半乳糖苷的作用，能把半乳糖連接到乳糖上，生成低聚半乳糖(李玉強等，食品添加劑，2001)。早期￠-半乳糖苷酶生產方法主要是從哺乳動物組織和一些植物中提取，存在生產成本高、純度低、生產工藝復雜等問題(張莉，東北農業大學學報，2009);利用微生物發酵生產3 -半乳糖苷酶工藝比較簡單、生產成本較低、純度高(周春雷等，極地研究，2010)。目前國內對微生物發酵生產￠-半乳糖苷酶的研究集中于中、高溫酶，主要是￠-半乳糖苷酶產生菌篩選、理化性質及酶分子特性的研究(劉文玉等，新疆農業科學，2007 ;李玉強等，食品添加劑，2001)，對低溫￠-半乳糖苷酶的研究尚在起步階段，產業化、規模化生產及應用還未見報道。與中、高溫木聚糖酶相比，低溫￠-半乳糖苷酶具有更松散、柔順的分子結構，使其在自然條件下具有高酶活及高催化效率，從而提高底物利用率，降低能耗，縮短作用過程的時間；另外，低溫P -半乳糖苷酶對熱敏感，可通過溫和的熱處理使其變性失活，從而控制酶水解程度，使產品品質不受影響，這將有助于低溫￠-半乳糖酶的推廣和使用(李興峰等，中國食品學報，2003)，這些優勢都是中、高溫￠-半乳糖苷酶所無法比擬的。利用低溫￠-半乳糖苷酶在降低生產成本及降低能耗方面的巨大優勢，可從根本上擺脫中、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝，這將為人類擺脫生存和發展中所面臨的諸如疾病、能源危機以及環境污染等困境提供現實的機遇。因此，微生物發酵生產低溫￠-半乳糖苷酶具有廣闊的開發潛力和應用前景。
發明內容
本發明是提供一種微生物發酵生產低溫P -半乳糖苷酶的方法，該方法主要是微生物經過低溫馴化后，在10 16°c液體發酵生產低溫￠-半乳糖苷酶，這種生產方法獲得的低溫￠-半乳糖苷酶粗酶液酶活可達115U/ml，如再經過分離和純化可以得到不同濃度和純度的酶制劑。添加該酶制劑只需在10 16°C催化就可明顯提高原料的轉化率。該酶制劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫P -半乳糖苷酶的方法具體包括以下步驟
(I)將產生￠-半乳糖苷酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化后的P -半乳糖苷酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫P -半乳糖苷酶結束；(4)將(3)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液；(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發明中使用的菌種來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。0 -半乳糖苷酶產生菌(例如，CICC菌種編號10138或6046)，菌種先活化、低溫馴化后，按本發明產酶條件發酵生產低溫P -半乳糖苷酶，低溫馴化后的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水I. 0L, pH 7. 2,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基乳糖5.0 15. 0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5.0 15. OgjNaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基蛋白胨8. 0 12. 0g，酵母膏12. 0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂15. 0 25. Og,自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基乳糖15.0 25. 0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 4. 0 7. 0g，K2HPO4 1.0 3.5g，自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌301^11。(2)將產生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好； (4)按常規方法將低溫馴化后的P -半乳糖苷酶產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 5%接種量接入10L液體發酵培養基中，在10 12°C培養120 144h時，即微生物發酵生產低溫￠-半乳糖苷酶結束；
(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離
心收集沉淀。(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實施例二 (I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水I. 0L, pH 7. 2,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基乳糖5.0 15. 0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5. 0 15. OgjNaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂15. 0 25. Og,自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4LO 3. 5g，自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的P -半乳糖苷酶產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的5 7%接種量接入50L液體發酵培養基中，在12 14°C培養96 120h時，即微生物發酵生產低溫P -半乳糖苷酶結束；(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀。(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實施例三(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨10. 0g，酵母膏15. 0g,NaCl 5. 0g，K2HPO4 2. 5g，蒸餾水
I.0L, pH 7. 2,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基乳糖5.0 15. 0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5.0
15.0g, NaCl 4.0 8.0g，K2HP042. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12.0 16. 0g，NaCl 4.0 7. 0g，K2HPO4L 5 3. 5g，瓊脂15. 0 25. Og,自來水I. 0L，pH值自然，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基乳糖15. 0 25. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4LO 3. 5g，自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生P -半乳糖苷酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的P -半乳糖苷酶產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的7 9%接種量接入100L液體 發酵培養基中，在14 16°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫￠-半乳糖苷酶結束；(6)將(5)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離
心收集沉淀。(7)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為￠-半乳糖苷酶粗酶液。(8)根據不同需要和使用對象不同，將(7)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫￠-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟 (1)將產生￠-半乳糖苷酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好； (2)按常規方法將低溫馴化后的P-半乳糖苷酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫P -半乳糖苷酶結束； (4)將(3)的發酵液4，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為P-半乳糖苷酶粗酶液； (6)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進一步包括將步驟(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養基分別為 (1)菌種低溫馴化培養基乳糖5.0 15.0g，蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏5.0 15. OgjNaCl 4. 0 8. 0g，K2HPO4 2. 0 4. 5g，蒸餾水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養基蛋白胨8.0 12. 0g，酵母膏12. 0 16. 0g, NaCl 4. 0 7. Og,K2HPO4 I. 5 3. 5g，瓊脂15. 0 25. Og,自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基乳糖15.0 25.0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 4. 0 7. 0g，K2HPO4 1.0 3.5g，自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌301^11。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫β-半乳糖苷酶的方法是將產生β-半乳糖苷酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化后的β-半乳糖苷酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫β-半乳糖苷酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集菌體，數次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/38GK102653746SQ20121010690
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者崔愛萍, 張慶芳, 遲乃玉 申請人:大連大學