專利名稱：一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及ー種α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法。
背景技術：
7_ 氨基頭抱燒酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)是頭抱菌素C (Cephalosporin C, CPC)的母核,是生產50種以上臨床半合成頭孢菌素類抗生素的關鍵原料。目前主要的生產廠家有奧地利的Biochemie公司、意大利的Antibioticos公司和國內主要的中潤藥業，健康元，福抗，山西威奇達，哈藥集団，魯抗醫藥及聯邦制藥等公司。2010年全球的7-ACA需求在4000多噸，而國內7-ACA實際產量達到5500噸左右。因此，如 何環保并經濟有效地制備7-ACA，降低生產成本，提高企業競爭力是當前民族醫藥發展亟需解決的關鍵問題。當前7-ACA主要通過化學法或酶法裂解CPC獲得。化學裂解CPC制備7-ACA存在嚴重的能耗與治污成本問題，目前已逐步被酶裂解法所取代。國內外已經エ業化的是雙酶兩步法。關于該エ藝路線，首先，利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)在一定的條件下將CPC氧化脫氨，生成α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸(AKA-7-ACA)和過氧化氫酶(CAT)，AKA-7-ACA這個中間體是很不穩定的，很容易被同時生成或另外加入的過氧化氫氧化脫羧生成戊ニ酰基-7-氨基頭抱燒酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid, GL-7-ACA)。GL-7-ACA 這個中間體在GL-7-ACA酰化酶的作用下脫去側鏈生成7-ACA。雙酶兩步法具有生產エ藝簡單、環境污染少、生產條件溫和、生產成本低廉，且產品質量穩定等優勢。該エ藝需要涉及到2 3個反應器。隨著7-ACA產品日益嚴峻的國際競爭壓力，為縮短生產エ藝方法以進一歩降低7-ACA的生產成本，人們對ー步法生產7-ACA(單罐生產法)的研究極為關注。目前所報道的一歩法エ藝包括兩個方面第一、單酶一歩法通過ー種單酶(頭孢菌素C酰化酶,Cephalosporin Cacylase)轉化CPC生產7-ACA。雖然投入了大量的資源從事近40年的研究，然而至今發現的頭孢菌素C酰化酶存在酶活力低，還無法滿足エ業化生產的要求，而通過基因克隆技術也無法實現該酶活力有實質性的提高，該酶基因結構很復雜。第二、雙酶ー步法利用DAAO和G1-7-ACA酰化酶協同作用轉化CPC—步法生產7-ACA。該エ藝可獲得較好的7-ACA產率，但由于反應體系存在過氧化氫，使得酶催化劑的穩定性 受到嚴重影響。最近，三酶法裂解CPC生產7-ACA的エ藝已經被提出，其エ藝就是通過DAAO和CAT協同作用催化CPC產生AKA-7-ACA，該中間產物在無戊ニ酸的條件下可被G1-7-ACA酰化酶水解產生7-ACA，這就避免了過氧化氫對反應體系的不利影響。三酶法エ藝存在ー個需解決的問題，就是G1-7-ACA酰化酶對AKA_7_ACA的酶活性較低(該酶對AKA-7-ACA的米氏常數Km值是其對GL-7-ACA Km值的4倍)，使得最終的7-ACA產率只有76 80%，與エ業化生產的要求還有ー些距離，因為エ業化的雙酶兩步法7-ACA產率> 86%。這樣，獲取高活力水解AKA-7-ACA的酰化酶將具有巨大的經濟利益，將掀起國際上研究的ー個高潮。高活力水解AKA-7-ACA的酰化酶的獲得可以通過兩種方法第一、從自然界篩選酶產生菌；第二、通過定向進化技術對G1-7-ACA酰化酶、CPC酰化酶或青霉素G酰化酶分子結構改造，獲得AKA-7-ACA水解活力較強的突變酶。但不管何種策略，都將涉及到一個技術手段——篩選系統的建立。AKA-7-ACA是很不穩定的，在條件為28°C、pH 8.0時，半衰期僅為5h。本發明制備了 AKA-7-ACA的兩個結構類似物，即己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸(adipoyl-7-ADCA)和酮己ニ酰_7_氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸(Keto-7-ADCA)。這三個化學結構有相同的內酰胺母環、相同或相近的環上六碳烷基側鏈，都是G1-7-ACA酰化酶水解的底物。酰化酶對這三種化學結構的底物特異性(或專ー性結合)是相同的。兩個結構類似物的穩定性高于AKA-7-ACA的I 2數量級。這樣，這兩個結構類似物代替AKA-7-ACA作為篩選酶產生菌的誘導底物。蠟樣芽胞桿菌對adipoyI-7-ADCA和Keto-7-ADCA不敏感，但對7-ADCA敏感。
發明內容
本發明的目的在于提供ー種α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，通過建立ー個三層瓊脂平板培養的篩選系統，利用蠟樣芽胞桿菌作為篩選系統的指示菌，高效地從眾多候選菌中篩選出AKA-7-ACA酰化酶產生菌。本發明操作簡單，不需要昂貴復雜的實驗儀器，每人一天可以篩選超過5000個候選菌株，篩選效率高，具備高通量篩選的特點，適合運用于エ業菌株育種。本發明的技術方案ー種α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其篩選過程包括(I) α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸(AKA-7-ACA)及其結構類似物的制備，所述結構類似物是己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸(adipoy 1-7-ADCA)和/或酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸(Keto-7-ADCA)；(2)篩選系統指示菌的選擇與培養、候選菌富集培養及正負對照菌株的選擇與培養;(3)三層瓊脂平板培養基篩選系統的制備；(4)目標α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的判斷，所述判斷的方法是目標α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌通過三層瓊脂平板培養基培養有無出現蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈的來判定。所述α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2%頭孢菌素C用
O.I O. 2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7. 5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶，反應過程通入純氧，啟動攪拌裝置，溫度控制在27 29°C下，反應2 2. 5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到α -酮己ニ 酰-7-氨基頭孢烷酸。所述酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2%去こ酰氧基頭孢烷酸用O. I O. 2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7. 5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶,反應過程通入純氧,啟動攪拌裝置，溫度控制在27 29°C下，反應2 2. 5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸。所述己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸(adipoyl-7-ADCA)的制備是己ニ酰氯(彡99. 5%，Sigma公司提供)緩慢地滴入pH值為8 9的7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸堿性溶液中，在攪拌狀態下加入小蘇打固體(NaHCO3)，控制反應的pH值不發生變化，反應2 3h后離心收集反應產物，進行干燥、結晶得到adipoyl-7-ADCA。步驟(I)中AKA-7-ACA結構類似物的結構鑒定可以使液質聯用，或者經過結晶得到単體后，在通過質樸儀鑒定。所述候選菌來源于自然界或候選突變體，主要是假單胞菌類，其富集培養是指將假單胞菌放入含10 12mmol/L adipoyl-7-ADCA的富集培養基中富集培養16 24h ;然 后稀釋涂布在LB瓊脂平板培養基上，在35 37°C的條件下培養16 24h，獲得候選菌的單菌落細胞。所述篩選系統指示菌是蠟樣芽胞桿菌，其培養是將單菌落的蠟樣芽胞桿菌培養在LB液體培養基活化后，在35 37°C的條件下培養15 17h。其中步驟(2)中篩選系統指示菌的選擇原則是對誘導底物(adipoyl-7-ADCA和Keto-7-ADCA)不敏感(最小抑菌濃度> 256 μ g/ml)，但對7-ADCA敏感(最小抑菌濃度2 4 μ g/ml)，并且該菌株不是致病菌，能通過簡單培養。所述正負對照菌株分別是硝基還原假單孢菌和大腸桿菌，其培養是分別將單菌落的硝基還原假單孢菌和大腸桿菌挑出，在LB瓊脂平板培養基上劃線培養，在35 37°C的條件下培養16 24h，獲得硝基還原假單孢菌單菌落細胞和大腸桿菌單菌落細胞。其中步驟⑵中正負對照菌株的選擇原則正對照菌株要求能分泌表達AKA-7-ACA酰化酶，且菌株不是致病菌，能通過簡單培養。負對照菌株要求不分泌表達AKA-7-ACA酰化酶，且菌株不是致病菌，能通過簡單培養。所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第一層瓊脂平板培養基的制備15 16mLLB培養基倒平板，其瓊脂含量為I. 5%，候選菌通過點接種至平板培養基中，同時硝基還原假單孢菌和大腸桿菌也點接種至平板培養基中分別作為正、負對照，該平板培養基在35 37°C條件下培養12 24h使菌落長出。所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第二層瓊脂平板培養基的制備在低于45°C的條件下半固體培養基均勻地覆蓋在第一層瓊脂平板培養基上，其用量是3 5ml，覆蓋的厚度為O. 3 O. 6mm，在35 37°C下對菌株培養4 5h ;所述半固體培養基含的瓊脂為O. 5 O. 6 %，己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸或酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢燒酸5 6mg/ml。所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第三層瓊脂平板培養基的制備在低于45 0C的條件下，將含有瓊脂含量為O. 5 O. 6 %，蠟樣芽胞桿菌含量為O. 01 O. 02 %的半固體培養基均勻地覆蓋在第二層瓊脂平板培養基上，其用量是3 5ml，覆蓋的厚度為
O.3 O. 6mm，在28 32°C的條件下培養11 12h。其中步驟(3)中三層瓊脂平板培養基篩選系統的制備中，半固體培養基的瓊脂含量、用量及倒平板溫度是個關鍵エ藝，倒平板溫度不超過45°C。其中步驟(4)中，目標酶產生菌的判定是通過蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈的大小來初步判斷，而最終的判斷需要經發酵培養后的酶活力測定結果來判定。本發明中所采用的硝基還原假單孢菌(Pseudomonas nitroreducens),編號ATCC 33634，原始編號JCM 2782，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC);大腸桿菌(Escherichia coli),編號ATCC 53323,保藏于四川省微生物資源保藏中心；臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，編號ATCC 13061，從上海三踏科技有限公司商業購買。硝基還原假單孢菌，革蘭氏陰性，有鞭毛，無芽孢的桿菌，菌落較大為白色、隆起，邊緣規則，表面光滑，嚴格好氧，化能異養。大腸桿菌為Y -變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科，埃希氏菌屬，大腸桿菌種的細菌。大腸桿菌在生物技術中的應用大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操 作簡單，培養條件簡單，大規模發酵經濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系。蠟樣芽胞桿菌為芽胞桿菌目，芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，蠟樣芽胞桿菌種的細菌，它是ー種地方性，土壌生活的，革蘭氏陽性，β溶血性的桿狀細菌，它會引起食物中毒。蠟樣芽胞桿菌是需氧型，與其他芽胞桿菌相同，它會產生防御性的內芽抱。本發明的優點I、本發明操作簡單，同時不需要昂貴復雜的實驗儀器。2、本發明篩選效率高，每人一天可以篩選超過5000個候選菌株，適合運用于エ業菌株育種。3、本發明通過嚴格控制三層瓊脂平板培養的篩選系統中瓊脂含量、用量及倒平板溫度，確保菌株的生長，從而控制篩選的成功率。
具體實施例本發明用下列實施例進行說明，但不限制本發明的范圍。實施例II、AKA-7-ACA及其結構類似物的制備磷酸緩沖液磷酸氫ニ鈉和磷酸ニ氫鈉按pH為7. 5的比例配置緩沖液備至。(l)AKA-7-ACA 的制備IOOml的2% CPC用濃度為O. lmol/L、pH值為7. 5的磷酸緩沖液溶解，放入反應器，加入3ml 40U的DAAO和3ml的2000U的CAT，反應過程通入純氧，并不斷攪拌，溫度控制在280C, 2h后離心收集反應液,對反應液進行濃縮并結晶得到AKA-7-ACA。
權利要求
1.ー種α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在干其篩選過程包括 (1)α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸及其結構類似物的制備，所述結構類似物是己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸和/或酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸； (2)篩選系統指示菌的選擇與培養、候選菌富集培養及正負對照菌株的選擇與培養； (3)三層瓊脂平板培養基篩選系統的制備； (4)目標α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的判斷，所述判斷的方法是目標α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌通過三層瓊脂平板培養基培養有無出現蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈的來判定。
2.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2%頭孢菌素C用O. I O. 2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7. 5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶,反應過程通入純氧,啟動攪拌裝置,溫度控制在27 29°C下，反應2 2. 5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到α -酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸。
3.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2%去こ酰氧基頭孢烷酸用O. I O. 2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7. 5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶,反應過程通入純氧,啟動攪拌裝置，溫度控制在27 29°C下，反應2 2. 5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸。
4.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸的制備是己ニ酰氯緩慢地滴入pH值為8 9的7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸堿性溶液中，在攪拌狀態下加入小蘇打固體，控制反應的pH值不變,反應2 3h后離心收集反應產物,進行干燥、結晶得到己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸。
5.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述候選菌富集培養是指將假單胞菌放入含10 12mmol/L己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸的富集培養基中富集培養16 24h ;然后稀釋涂布在LB瓊脂平板培養基上，在35 37°C的條件下培養16 24h，獲得候選菌的單菌落細胞。
6.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述篩選系統指示菌是蠟樣芽胞桿菌，其培養是將單菌落的蠟樣芽胞桿菌培養在LB液體培養基活化后，在35 37°C的條件下培養15 17h。
7.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述正負對照菌株分別是硝基還原假單孢菌和大腸桿菌，其培養是分別將單菌落的硝基還原假單孢菌和大腸桿菌挑出，在LB瓊脂平板培養基上劃線培養，在34 36°C的條件下培養16 24h，獲得硝基還原假單孢菌單菌落細胞和大腸桿菌單菌落細胞。
8.根據權利要求I或5所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第一層瓊脂平板培養基的制備15 16mL LB培養基倒平板，其瓊脂含量為I. 5%，候選菌通過點接種至平板培養基中，同時硝基還原假單孢菌和大腸桿菌也點接種至平板培養基中分別作為正、負對照，該平板培養基在35 37°C條件下培養12 24h使菌落長出。
9.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第二層瓊脂平板培養基的制備在低于45°C的條件下半固體培養基均勻地覆蓋在第一層瓊脂平板培養基上，其用量是3 5ml，覆蓋的厚度為O. 3 O. 6mm，在35 37°C下對菌株培養4 5h ;所述半固體培養基含的瓊脂為O. 5 O. 6 %，己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢烷酸或酮己ニ酰-7-氨基-3-去こ酰氧基頭孢燒酸5 6mg/ml。
10.根據權利要求I所述的α-酮己ニ酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第三層瓊脂平板培養基的制備在低于45°C的條件下，將含有瓊脂含量為O. 5 O. 6%，蠟樣芽胞桿菌含量為O. 01 O. 02%的半固體培養基均勻地覆蓋在第二層瓊脂平板培養基上，其用量是3 5ml，覆蓋的厚度為O.3 O. 6mm，在28 32°C的條件下培養11 12h。
全文摘要
本發明公開了一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其篩選過程包括(1)α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸及其結構類似物的制備；(2)篩選系統指示菌的選擇與培養、候選菌富集培養及正負對照菌株的選擇與培養；(3)三層瓊脂平板培養基篩選系統的制備；(4)目標α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的判斷。本發明具有操作簡單，不需要昂貴復雜的實驗儀器，每人一天可以篩選超過5000個候選菌株，篩選效率高，具備高通量篩選的特點，可用于工業菌株育種。
文檔編號C12R1/19GK102690859SQ20121010918
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月16日 優先權日2012年4月16日
發明者譚強, 鄧超澄, 邱春會, 陳衛衛, 韋海宏 申請人:廣西中醫學院