專利名稱：產生體外血管的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及用于產生體外血管的裝置和方法。
背景技術：
循環系統由血管網絡構建，血管網絡從細胞和生化傳輸、營養和氧交換到溫度調節起到廣泛的作用，同時在生物的整個生存和發育過程中保持一定的塑性。血管的發育、功能和內穩態為多種生理和病理現象的主要構成要素。這樣有效的系統的建立基于初級的基礎材料，血管內皮細胞(EC)，EC調節經血管輸送、血管擴張和血管形成及退化。由于利用如此復雜的任何系統，故障和調節異常可以導致大量疾病。因此，闡明作為血管形成基礎的細胞和分子機制對于開發新的治療干預措施是必要的。已經開發出大量的體內和體外實驗系統來研究血管動力學和血管功能。在2D 基體上培養的EC廣泛用于屏障功能、內皮的機械敏感響應和包括白細胞與循環腫瘤細胞(CTCs)的血源性細胞的經內皮細胞遷移的研究。然而，這樣的2D內皮單層缺少提供信號以誘導細胞類似它們的先天特征的三維環境。此外，沒有一種方法已經成功表明，通過整合自然3D形態發生以及通過遍布的血管網絡的微循環重組復雜的血管生理機能。體外模型系統可以捕捉在血管形成期間的EC的詳細動力學，且可以整合對體內血管的功能特征起作用的重要生理成，該體外模型系統將對血管生物學研究提供了有用的實驗平臺。此外，就人和動物的生理差別而言，當前體外系統的缺陷預測可能性導致在新藥開發過程中的臨床試驗的失敗，反映復雜的血管生理機能的新的體外模型通過提供抗血管原化合物或血管活性化合物的有效的和準確的評估使藥劑學受益。
發明內容
技術問題本發明總體涉及用于體外用3D凝膠產生具有內腔的可灌注的、連接網絡狀的血管的裝置和方法的領域。技術手段在本發明的一個示例性實施方式中，一種產生血管的裝置，包括a)槽通道，該槽通道與槽入口流體連通；b)源通道，該源通道與源入口流體連通，該源通道基本上與所述槽通道平行；c)形成血管的通道，該形成血管的通道與形成血管的通道的入口流體連通，該形成血管的通道在槽通道和源通道之間設置成與槽通道的一側和源通道的一側接觸，該形成血管的通道基本上平行于源通道和槽通道；d)第一培養通道，該第一培養通道與第一培養通道入口流體連通，該第一培養通道設置成與槽通道的另一側接觸，該第一培養通道基本上平行于槽通道；和e)第二培養通道，該第二培養通道與第二培養通道入口流體連通，該第二培養通道設置成與源通道的另一側接觸，該第二培養通道基本上平行于源通道，其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間的相互作用，所述多個微結構以設定的間隔布置在各個相鄰的通道的界面上。
本發明的另一不例性實施方式涉及一種產生血管的方法，包括a)將ECM(細胞外基質)和形成血管的細胞注入產生血管的裝置的形成血管的通道中山)將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞注入產生血管的裝置的第一培養通道和/或第二培養通道中；和(3)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，且培養形成血管的細胞和共培養的細胞。結合附圖和下文的描述將描述本發明的一個或多個實施方式的細節。其它的特征、目的和優點將通過說明書、附圖和權利要求書而變得明顯。有益效果本發明提供了三維地產生體外血管的裝置和方法。
圖1(a)和圖1(b)示出產生血管的裝置的實施方式。 圖2為示出將ECM充入根據實施方式的產生血管的裝置的形成血管的通道的機理的示意圖。圖3為示出使用根據實施方式的產生血管的裝置產生血管的一些方法的示意圖。圖4為示出使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法的模擬血管生成過程的實驗設置和細胞種植配置的示意圖。圖5示出通過使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法模擬血管生成過程所產生的血管網絡的顯微圖像。圖6為示出使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法模擬血管生成過程的實驗設置和細胞種植配置的示意圖。圖7(a)和圖7(b)示出通過使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法模擬血管生成過程所產生的另一血管網絡和血管生成芽的顯微圖像。圖8示出產生血管的裝置的另一實施方式。圖9示出顯示FITC (異硫氰酸熒光素)溶液的熒光顯微圖像，FITC溶液具有70kDa的分子質量，以及半徑為7微米的熒光顆粒，所述溶液被引入通過源通道和槽通道灌注并可直接進入的血管網絡。圖10示出通過將調解炎癥反應的包括TNF-a和IL-Ia的細胞因子引入可灌注的血管網絡描述在血管的細胞頂面的ICAM-I表示的增量調節的熒光圖像。圖11示出圖示了被引入血管網絡的癌細胞的熒光圖像，該熒光圖像模擬了從起始部位散布到血流中的癌細胞，癌細胞粘附并滲入第二轉移癌部位的組織中。
具體實施例方式本發明提供了以三維方式產生體外血管的裝置和方法。本發明提供了一種產生血管的裝置，包括a)槽通道，該槽通道與槽入口流體連通；b)源通道，該源通道與源入口流體連通，且基本上與槽通道平行；c)形成血管的通道，該形成血管的通道與形成血管的通道入口流體連通，該形成血管的通道在槽通道和源通道之間設置成與槽通道的一側和源通道的一側接觸，該形成血管的通道基本上平行于源通道和槽通道；d)第一培養通道，該第一培養通道與第一培養通道入口流體連通，該第一培養通道設置成與槽通道的另一側接觸，該第一培養通道基本上平行于槽通道；和e)第二培養通道，該第二培養通道與第二培養通道入口流體連通，該第二培養通道設置成與源通道的另一側接觸，該第二培養通道基本上平行于源通道，其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間相互作用，這些微結構以設定的間隔被布置在各個相鄰的通道的界面上。通過本方法，可以模擬血管生成的過程。在圖I中示出產生血管的裝置的實施方式。產生血管的裝置400包括與基體160相連的基部145。基體160包括與槽通道110相通的槽入口 105，槽入口 105能夠將流體注入槽通道110 ;和與源通道120相通的源入口 115，源入口 115能夠將流體注入源通道120。另外，基體160包括與槽通道110相通的槽出口 141，槽出口 141能夠將注入的流體排出槽通道110 ;和與源通道120相通的源出口 142，源出口 142能夠將注入的流體排出源通道120。圖I為示出包括入口和出口的槽通道110和源通道120的示意圖。在另一實施方式中，槽通道110和源通道120可以形成一個通道以便互相連通。在該情況下，槽入口 105和源入口 115可形成一個入口，以及槽出口 141和源出口 142可形成一個出口。而且，通過槽入口 105和 源入口 115可以注入和排出流體，而不使用分離的槽出口 141和源出口 142。此外，基體160包括設置成與槽通道110的一側和源通道120的一側接觸的形成血管的通道320，形成血管的通道320在槽通道110和源通道120之間，且形成血管的通道320基本上平行于槽通道110和源通道120。另外，基體160包括設置成與槽通道110的另一側接觸的第一培養通道410，第一培養通道410基本上平行于槽通道110 ;和設置成與源通道120的另一側接觸的第二培養通道420，第二培養通道420基本上平行于槽通道120。圖I為示意圖，其示出形成血管的通道320、第一培養通道410和第二培養通道420分別包括入口 305、入口 405、入口 415和出口 143、出口 441和出口 442。然而，可以通過入口注入和排出流體而不使用各自的出口。槽通道110、源通道120、形成血管的通道320、第一培養通道410和第二培養通道420的相鄰界面通過以設定的間隔布置多個微結構450而被分開，使得在每個通道中的生物化學物質可以相互反應。微結構450具有細柱形狀，其長度和高度范圍在數十至數百微米(μ m)之間。多個微結構450可以500 μ m或小于500 μ m的間距被布置。根據實驗的目的和條件可以適當地確定間距。產生血管的區域335是通過將i)細胞外基質(ECM)或ii)ECM和形成血管的細胞注入形成血管的通道320而三維地形成的。產生血管的區域335提供了空間，在該空間中形成血管的細胞被三維地增殖和分化以形成血管。由于多個微結構450以設定的間隔被布置在形成血管的通道320與槽通道110和源通道120之間的相鄰界面中，當i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞被注入形成血管的通道320時，i) ECM或ii) ECM和形成血管的細胞在形成血管的通道320中形成產生血管的區域325，由于i) ECM或ii) ECM和形成血管的細胞的表面張力，而i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞在微結構450之間沒有任何泄漏。同時，由于在每個通道中的各種生物化學物質可以通過多個微結構450之間的間隙流動和擴散，在槽通道110和源通道120中含有的各種血管生成因子和/或營養成分可以被提供至形成血管的通道320。另外，在產生血管的區域335中產生的血管延伸貫穿形成在多個微結構450之間的間隙，以與槽通道110和源通道120連通，由此形成血管的入口 /出口且可以使血管灌注有包含在源通道120或槽通道110中的流體。因此，當穿過與多個微結構450之間的間隙連通的槽通道110和源通道120直接傳輸各種生物化學物質和生物物理物質以及信號進入血管中時，血管的反應可以被實時觀測并記錄。因此，通過改變設置在形成血管的通道320與槽通道110和源通道120之間的微結構的形狀、長度和數量，待產生的血管網絡的入口和出口的數量可以被調整。可以理解，例如微結構的形狀的各種參數可以被做出改變，而不違背圖I中實施方式的范圍。因此，其它參數可以在實驗的目的和配置的范圍內被改變。圖2為示出將i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞注入形成血管的通道的示意圖。根據本發明，基體160可以由疏水材料制成。被注入形成血管的通道320的i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞330在多個微結構450之間形成彎月面。在該情況中，當液體彎月面中的壓力在一定的壓力水平(閾壓水平)下時，彎月面由于抵抗的表面張力而沒有進入槽通道110的一側和源通道120的一側。壓力范圍受微結構之間的間隙和微結構的高度的影響，在該壓力范圍中，彎月面可停止在微結構之間而不允許彎月面進入槽通道110的一側和源通道120的一側。因此，這兩個參數(微結構之間的間隙和微結構的高度)可以被優化以調整閾壓力水平。調整閾壓力水平的具體方法參見Carlos P. Huang等的文獻(Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellularco—cultures， LabChip，2009，9，1740-1748)。當i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞被注入形成血管的通道時，彎月面可以通過調整微結構之間的間隙和微結構的高度可以被有效地停留在微結構之間，由此精確地調整i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞注入到沒有完全物理上互相分開的通道之間。甚至當i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞被注入第一培養通道和第二培養通道時，這也可以用相同的方式適用。通過將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞注入第一培養通道410和第二培養通道420而三維地形成細胞培養區435和細胞培養區445。由于多個微結構450以設定的間隔被布置在第一培養通道410、第二培養通道420與槽通道110和源通道120之間的相鄰界面中，當i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞被注入第一培養通道410和第二培養通道420時，由于i) ECM或ii) ECM和共培養的細胞具有表面張力，故i) ECM或ii) ECM和共培養的細胞在第一培養通道410和第二培養通道420中形成細胞培養區435和細胞培養區445，而i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞在微結構450之間沒有任何泄漏。細胞培養區435和細胞培養區445提供了這樣的空間，在該空間中，共培養的細胞可以三維地被培養。該三維多細胞的共培養可更符合生理條件地模擬體內環境，因此可以提高從共培養的細胞生產和分泌的各信號材料。同時，由于在第一培養通道410和第二培養通道420中制得的各信號材料和例如包括在槽通道110和源通道120中的血管生成因子之類的各生物化學物質可以通過多個微結構450之間的間隙擴散，因此可以進行第一培養通道410與槽通道110之間和第二培養通道420與源通道120之間的生物化學物質的活性相互作用。槽通道110和源通道120提供的通道允許流體的流動。本文中，流體可包括細胞培養介質和各種血管生成因子等。由于槽通道110和源通道120中的每一個被設置在形成血管的通道335與第一培養通道410之間和形成血管的通道335與第二培養通道420之間，因此細胞培養介質和血管生成因子被提供至形成血管的通道335、第一培養通道410和第二培養通道420。以此方式，槽通道110和源通道120提供了這樣的通道，通過該通道，在形成血管的通道335、第一培養通道410和第二培養通道420中的兩細胞組(形成血管的細胞和共同培養的細胞)可借助旁分泌信號相互作用，以及，形成血管的細胞和共培養的細胞可以被培養較長的一段時間。已知在形成血管的細胞和共培養的細胞之間的旁分泌相互作用用來提高進入血管網絡的形成血管的細胞的形態發生。另外，由于形成血管的細胞和共培養的細胞通過槽通道110和源通道120在物理上彼此分開，故形成血管的細胞和共同培養的細胞可以容易地彼此獨立地被觀測和分析。具體而言，由于槽通道110和源通道120與形成在微結構450之間的間隙處的血管網絡的入口 /出口連通，因此可以穿過空隙施加多種生物化學物質、生物物理物質和信號進入血管。因此，可以模擬多種生化信號、生物物理信號與血管之間的相互作用，由此實時圖像化和量化血管對各種刺激的響應。當根據本發明的產生血管的裝置400用于產生血管時，ECM的種類和特征、形成血管的細胞、細胞培養介質和共培養的細胞與下文所述相同。本發明的一個具體實施方式
中，ECM可以為例如選自膠原蛋白凝膠、纖維蛋白凝膠、基質膠、自組裝多肽凝膠、聚乙二醇凝膠和藻酸鹽凝膠中的至少一種。在該實施方式中使用了纖維蛋白凝膠。ECM可含有選自藥品化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子、蛋白質、納米材料和小干擾核糖核酸(siRNA)中的至少一種，并且量化和評估在血管形成和作用時它們的效果和功效，或估計作為治療劑 時它們的促進血管生成或抗血管生成特征。在本發明的另一具體實施方式
中，形成血管的細胞可以為例如選自內皮細胞、上皮細胞、癌細胞、干細胞、干細胞衍生的細胞和內皮前驅細胞中的至少一種。形成血管的細胞可以理解成包括突變細胞、其轉基因細胞和轉染細胞。該實施方式使用了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。在本說明書中，術語“形成血管的細胞”指通過包括在細胞培養介質中的誘導血管生成劑或產自共培養的細胞的血管生成因子的相互作用而形成血管的細胞。形成血管的細胞可通過接近地模擬在體內觀測到的血管形成過程的血管形成術或血管生成術而形成血管。例如，從各種人體器官分離出的HUVEC、人微血管內皮細胞、人腦微血管內皮細胞和人淋巴內皮細胞之類的血管內皮細胞可以用作形成血管的細胞。不僅從人獲取的細胞系，而且從小鼠、大鼠、牛和豬分離出的多種細胞系可以被用作形成血管的細胞。另外，癌細胞可以被用于進行癌生長和轉移機制的研究。如上文所述，本領域技術人員可以根據實驗的目的適當地選取形成血管的細胞的種類。在本發明的另一具體實施方式
中，本領域中已知的任一細胞培養介質可以被用作細胞培養介質。在該實施方式中使用了 EGM-2介質(LONZA)。細胞培養介質可含有選自藥物化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子、蛋白質、納米材料和小干擾核糖核酸(siRNA)中的至少一種，以量化和評估在血管形成和作用時它們的效果和功效，或估計作為治療劑時它們的促進血管生成或抗血管生成特征。在本發明的又一具體實施方式
中，共培養的細胞可以為通過與形成血管的細胞相互作用而分泌形成血管所需的例如血管生成誘導劑的生物化學物質的細胞。共培養的細胞可以為例如選自星形膠質細胞、膠質細胞、間皮細胞、纖維母細胞、平滑肌細胞、癌細胞、夕卜膜細胞、神經膠質細胞、干細胞、干細胞衍生的細胞和與內皮細胞相互作用的細胞中的至少一種。共培養的細胞可以被理解成包括突變細胞、其轉基因細胞和轉染細胞。當待產生的血管為在腦中的血管時，共培養的細胞優選為星形膠質細胞、膠質細胞、間皮細胞或纖維母細胞。當待產生的血管為不同于腦中的血管的血管時，共培養的細胞將優選為纖維母細胞或平滑肌細胞。另外，為了進行癌癥和血管生成之間關系上的研究，腫瘤細胞可以被用作共培養的細胞。該實施方式使用了人肺成纖維細胞。在該實施方式中，共培養的細胞為人肺成纖維細胞和HUVEC。因此，共培養的細胞類型、組合和其共培養的細胞種植配置在該實驗的目的和配置的范圍內。可以執行血管生成因子、細胞培養介質和共培養的細胞的添加以對形成血管的細胞的生長、增殖和形態發生提供合適的環境。血管生成因子、細胞培養介質和共培養的細胞的種類和組成可以由本領域技術人員適當地選取。本發明還提供了產生血管的方法，包括a)將ECM和形成血管的細胞注入產生血管的裝置的形成血管的通道中山)將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞注入產生血管的裝置的第一培養通道和/或第二培養通道中；和(3)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，且培養形成血管的細胞和共培養的細胞。通過本方法，可以模擬血管生成的過程。·
圖3示出使用根據本發明的產生血管的裝置400的產生血管的方法。此處，產生血管的方法包括將ECM和形成血管的細胞330注入形成血管的通道320，將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞230注入第一培養通道410和第二培養通道420，并將含有細胞培養介質和/或各種血管生成因子的流體130注入槽通道110和源通道120。當ECM、細胞、細胞培養介質和各種血管生成因子被注入每個通道時，不需要額外的外部實驗裝備，且它們可以通過移液管移取而被簡單地被注入。另外，形成血管的細胞和共培養的細胞可以與待注入形成血管的通道或第一培養通道和第二培養通道中的ECM混合，并可以通過槽通道或源通道被注入以根據實驗目的使它們粘附在形成在微結構之間的ECM的側壁上。使用形成血管的細胞與ECM混合并被注入形成血管的通道的方法可以模擬血管網絡的形成血管化過程，以及，使用附著在ECM上的形成血管的細胞的方法可以模擬血管生成過程，以允許形成血管生成芽和端細胞。圖3的示意圖示出將i)ECM或ii)ECM和形成血管的細胞/共培養的細胞順序注入每個通道和仿形的一個可能的步驟，該步驟在將細胞培養介質或血管生成因子裝入源通道和槽通道之后。i)ECM或ii) ECM和形成血管的細胞330被注入形成血管的通道320，并隨后將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞230被注入第一培養通道410和第二培養通道420。然而，注入次序不影響血管的形成。因此，將例如ECM或共培養的細胞的材料注入每個通道的次序可以根據實驗者的便利性和實驗的特點而改變。根據ECM或共培養的細胞的種類，通過增加的溫度、化學反應或光照可以聚合被注入每個通道的ECM或共培養的細胞。在該聚合過程之后，營養成分和血管生成因子可以通過將細胞培養介質注入槽通道和源通道而被提供至形成血管的通道320、第一培養通道410和第二培養通道420。長期的細胞培養和血管形成可以通過誘導旁分泌相互作用和相應通道之間提供的營養因子進行。如果形成血管的細胞需要附著在裝在形成血管的通道內的ECM的側壁上，則懸浮在細胞培養介質中的形成血管的細胞可以通過以90度角傾斜形成血管的裝置10分鐘至15分鐘而被注入源通道或槽通道以使它們附著在期望的位置。圖4圖解了根據本發明的實施方式通過以下步驟用于模擬血管化的血管生成的實驗配置將混合物注入形成血管的通道320、第一培養通道410和第二培養通道420中的每個通道，該混合物通過將內皮細胞、HUVEC或纖維母細胞、正常人肺纖維母細胞(NHLF)與纖維蛋白凝膠混合；將細胞培養介質、內皮細胞生長介質_2(EGM-2)注入槽通道110和源通道120。根據細胞培養介質的類型和實驗目的，影響細胞響應的血管生成因子或其它因子可以被混入纖維蛋白凝膠或EGM-2以提高或調整形成血管的細胞的細胞培養和形態發生。圖5為根據如圖4所示的本發明的實施方式通過血管生成過程形成的血管網絡的顯微圖像。從逐日顯微鏡的觀測可以看出，血管網絡從植入在纖維蛋白基質中的HUVEC自發地出現在形成通道的血管內，產生復雜地互相連接的圖案。血管延伸貫穿微結構450之間形成的間隙，形成與槽通道110和源通道120中的細胞培養介質流體連通的可灌注的血管腔。因此，可以看出，血管的內部形成與包含在源通道和槽通道中的細胞培養介質的直接流體連接，由此血管腔為可直接進入的并為可灌注的血管網絡。本發明還提供了產生血管的方法，包括a)將ECM注入產生血管的裝置的形成血管的通道中；b)將形成血管的細胞注入產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，以及將形成血管的細胞附著在暴露于布置在形成血管的通道的兩側上的微結構之間的ECM上；c)將i)ECM或ii)ECM和共培養的細胞注入產生血管的裝置的第一培養通道和/或第二培養 通道中；和d)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，且培養形成血管的細胞和共培養的細胞。通過本方法可以模擬血管生成的方法。為了提供促進血管生成的方向梯度以導引形成血管的細胞的血管生成芽形成，形成血管的細胞所附著的位置、共培養的細胞的注入和血管生成因子的引入源通道和槽通道中可以通過執行本實驗的人被容易地控制。圖6圖解了用于模擬血管化的血管形成過程的實驗配置。在此處，通過將纖維蛋白凝膠裝入形成血管的通道320來誘導血管生成芽，以形成血管產生區335 ;將內皮細胞和HUVEC注入設在形成血管的通道320的左側處的槽通道110中；以及將HUVEC附著在通過微結構450之間的間隙暴露出的纖維蛋白凝膠上；和在設置在形成血管的通道320的右側處的第二培養通道420中，注入培養纖維母細胞、NHLF和纖維蛋白凝膠；以及將細胞培養介質、內皮細胞生長介質-2(EGM-2)注入槽通道110和源通道120。根據培養的細胞的類型和實驗目的，影響細胞響應的血管生成因子或其它因子可以被混入纖維蛋白凝膠或EGM-2以提高或調整形成血管的細胞的細胞培養和形態發生。在該情況下，可以顯示，血管生成芽從附著有HUVEC的血管產生區335的左側朝向第二培養通道420的方向生長，在第二培養通道420中纖維母細胞NHLF被培養。以及，血管生成芽在穿過血管產生區335之后形成可灌注的血管。圖7(a)描繪了通過使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法模擬血管生成過程的生長48小時的血管生成芽的顯微圖像。圖7(b)描繪了通過使用根據本發明的用于產生血管的裝置和方法生長后模擬血管生成過程4天產生的另一血管網絡的圖像。本發明還提供了產生血管的裝置，該裝置包括a)第一培養通道，該第一培養通道與第一培養通道入口流體連通山)形成血管的通道，該形成血管的通道與第一血管形成通道入口流體連通，該形成血管的通道設置成與第一培養通道的一側接觸，該形成血管的通道基本上平行于第一培養通道；c)槽通道，該槽通道與槽通道入口流體連通，該槽通道設置成與第一培養通道的另一側接觸，該槽通道基本上平行于第一培養通道；和d)源通道，該源通道與源通道入口流體連通，該源通道設置成與形成血管的通道的另一側接觸，該源通道基本上平行于第一培養通道，其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間相互作用，這些微結構以設定的間隔被設置在各個相鄰的通道的界面上。本發明還提供了一種產生血管的方法，包括a)將ECM注入產生血管的裝置的形成血管的通道中；b)將共培養的細胞注入所述產生血管的裝置的第一培養通道中，并將共培養的細胞附著在暴露在所述微結構之間的所述ECM上，所述微結構布置在所述形成血管的通道的一側上；c)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入所述產生血管的裝置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培養所述共培養的細胞。在圖8中，通道320表示形成血管的通道，通道410表示注入了共培養的細胞的通道，以及通道120或通道110表示注入了細胞培養介質和/或各種血管生成因子的通道。圖8為產生血管的裝置的主視圖，該裝置帶有作為上述直接接合形成血管的通道的右側的第一培養通道。在產生血管的裝置中模擬血管生成的方法類似于在圖6中描述的方法。在形成血管的通道和第一培養通道中，共培養的細胞被三維地植入ECM中，由于形成血管的 通道和第一培養通道被直接連通，故該裝置具有當實驗旨在觀測和模擬血管生成芽形成和朝向促進血管生成的定向生長時提供更便利的裝置的優點。 血管網絡通過源通道和槽通道被灌注和直接進入。本發明還提供一種將流體灌注到根據血管生成術和血管再生術制得的血管中的方法，其中所述血管通過源通道和/或槽通道可進入，由此允許流體流進入血管。在如上文所述的本發明的一個具體實施方式
中，根據本發明的血管產生的裝置400可形成各種信號材料的濃度梯度，該信號材料通過培養在分別設置在形成血管的通道320的左側和右側上的第一培養通道410和第二培養通道420中培養的共培養的細胞之間的不同種類的細胞或通過調整相對濃度而由共培養的細胞分泌。此外，通過共培養的細胞所分泌的各種信號材料的量可以通過調整在共培養的細胞和形成血管的細胞之間的相對濃度被控制。另外，通過調整分別設置在形成血管的通道320的左側和右側上的槽通道110和源通道120之間的生物化學物質的相對流量或種類和濃度，根據本發明的產生血管的裝置400還形成各種血管生成因子和營養成分的濃度梯度。根據本發明的另一具體實施方式
，通過調整添加至ECM或細胞培養介質的形成血管的細胞、共培養的細胞和生化因子的種類和來源，血管可以被誘導以具有人體的特定的器官和組織中顯現出的血管特征和人體的特定生理和病理學狀況。注射有細胞培養介質和/或ECM的流體可含有選自可溶和不溶因子、生物化學材料、生物力學刺激和細胞中的至少一種。例如，如腫瘤微環境中所觀測的，當癌細胞被注射有血管內皮細胞時，為響應各種從癌細胞分泌的血管生成因子和引發炎癥因子，可以增大血管網絡的通透性。相反，當星形膠質細胞作為共培養的細胞被注入時，通過增強構成血管的細胞之間的細胞與細胞之間的緊密接合可以降低血管網絡的通透性。此外，通過所產生的血管的相鄰的外部中的共培養的神經膠質細胞，血管網絡可以被賦予類似于在腦中的血管的特性。另外，通過共培養的間葉細胞的干細胞或外膜細胞，可以誘導血管外膜細胞的各種相互作用，由此實現細胞的微環境，在該微環境中可以進行大量的研究。在這些情況中，由于血管通過血管發生和血管生成過程形成，上述具體細胞類型可以在ECM中混合以被注入形成通道的血管中，以支持與形成血管的細胞的接觸依賴型物理相互作用，或可以被注入第一培養通道和第二培養通道以支持與上述形成血管的細胞的接觸依賴型相互作用和擴散依賴型相互作用。當調節血管網絡的通透性時，可以通過引入熒光染料和量化穿過血管壁擴散的染料的熒光強度來測量血管的通透性。另外，通過在血管的頂側植入電極和在血管的基側植入其它電極可以測量血管的通透性，電極的植入允許定量測量橫穿血管壁的跨上皮電阻(TEER)值。在本發明的另一具體實施方式
中，提供了體外模型，通過誘導通過癌細胞形成血管或將癌細胞設置在血管的內部或外部，該體外模型可以用于理解癌生長和轉移機制。為了使從癌細胞分泌的血管生成因子模擬誘導血管內皮細胞的形態發生或定向生長過程，癌細胞可以與ECM混合以被引入第一培養通道和第二培養通道中。而且，通過將癌細胞引入血管的頂側或基側，可以模型化癌細胞穿過血管壁的滲出或滲入。此外，在上述具體實施方式
中，通過血管壁從血流進入組織或從組織進入血流的可通透的細胞不限于癌細胞。在組織和血流之間來回移動穿過血管壁的其它細胞組的代表性實例包括例如巨噬細胞、中性粒細胞、外膜細胞、干細胞或內皮前驅細胞等的免疫細胞。根據本發明的另一具體實施方式
， 通過將懸浮有這些免疫細胞的流體引入血管中可以模擬免疫細胞和血管之間的相互作用。如上文所述，使用根據本發明的產生血管的裝置400，在產生血管的區域335中形成的血管可以與通過多個微結構450之間形成的間隙與槽通道110和源通道120連通，如圖5和圖7中所示。圖5和圖7中的圖像圖示了槽通道和源通道之間的相互連接，所述相互連接通過在形成血管的通道中的血管網絡的腔而形成，所述形成血管的通道通過模擬血管發生和血管生成而形成。在該情況下，各種生化和生物物理刺激和信號可以被直接發送進入血管，以及血管的響應可以被實時監控和量化。根據本發明的一具體實施方式
，通過調整被注入槽入口 105和/或槽出口 141、源入口 115和/或源出口 142的細胞培養介質的體積，可以產生槽通道110和源通道120之間的液體靜壓。所產生的液體靜壓差能夠使細胞培養介質穿過微結構450之間形成的間隙流入與槽通道110和源通道120連通的血管網絡。在該情況下，通過將注入的流體與可以控制血管特性的各種生物化學物質混合可以調節和量化例如直徑、長度、通透性、屏障功能、基因和蛋白表達之類的形態和功能特征。另外，根據液體靜壓的定量差可以控制流過血管的生物化學物質的流量。因此，可以量化和成像由作用在血管壁上的剪切應力導致的生物物理刺激下的三維血管的響應或重建。圖9為熒光顯微圖像，該圖像示出可溶/不溶的因子，熒光標記可以被注入連接至槽通道和源通道的血管，其中，可以發現熒光顆粒具有7微米的半徑和70kDa的FITC(異硫氰酸熒光素)溶液。圖10為描述通過注入導致血管中的炎癥的TNF-a/IL-la細胞因子而在血管的內側壁上誘發ICAM-I表示的熒光圖像。這表明，與對照組相反，利用TNF-a/IL-la的刺激在管內檢測到熒光反應。此外，通過機械裝置引起和控制灌注。為了保持恒定水平的流體流通過血管，注射泵和流體輸送管道可以被連接至產生血管的裝置，以監控血管的長期響應和它們在生物物理刺激下的重建。此外，使用液體靜壓或外部的泵通過施加各種級別的流進入血管和血管網絡允許在生理和病理條件下觀測到的多種流體剪切條件的模擬。此外，在3D ECM環境中的可灌注的血管網絡可以充當對在各種生理和病理現象下觀測的內皮細胞和血液帶有的細胞相互作用的模擬的新的體外模型。圖11為熒光圖像，其圖示了被引入血管網絡中的癌細胞的特征。已經遷移經過內皮的細胞示出帶有較長的突起部分和有時帶有破碎胞漿的伸展形態。位于接近血管處的滲出癌細胞在其形態方面與仍在腔中的圓細胞形成對比。通過將混合癌細胞的培養介質注入血管內壁，隨著血液流動，癌細胞轉移附著在血管內壁，通過血管壁向組織滲透。術語“基本上平行”意味著在平面上的通道相互不交叉且保持相同和/或彼此相對相似的間距。關于本文中的基本上任何復數和/或單數的使用，本領域的技術人員可以適當地根據上下文和/或應用而將復數翻譯成單數和/或單數翻譯成復數。為了清楚起見，本文清楚地闡明各種單數/復數的變換。本領域技術人員將理解，通常，本文中所用的術語，尤其在所附的權利要求(例如所附權利要求的主體)中所用的術語一般作為開放術語(例如，術語“包括”應該理解為“包括但不限于，”術語“具有”應該理解為“具有至少”等)。本領域技術人員還應該理解，如 果在權利要求中想要描述特定的數量，這樣的意圖將在權利要求中清楚地描述，以及如果沒有這樣的描述，則沒有這樣的意圖。例如，為幫助理解，所附的權利要求可將介紹性詞組“至少一個”和“一個或多個”引入權利要求的描述。然而，這樣的詞語的使用不應該理解成隱含有這樣的意思由不定冠詞引入權利要求的描述將包含這些引入的權利要求的描述的任何特定的權利要求限制為僅含有一個這樣的描述的實施方式，即使當該權利要求包括介紹性詞語“一個或多個”或“至少一個”和例如不定冠詞(例如，不定冠詞應該理解為“至少一個”或“一個或多個”)時；該權利要求同樣適用于用于介紹權利要求的描述中定冠詞的使用。此外，即使引入的權利要求描述中的具體數目被清楚地引用，本領域的技術人員將明白，這樣的描述應該被理解成至少所描述的數目(例如，僅描述了 “兩種描述”而沒有其它變型，是指至少兩種描述，或兩種或多種描述)。此外，在這些例子中，使用了類似于“A、B和C等的至少一個”的慣用方式，通常這樣的慣用方式旨在使本領域的技術人員應該這樣理解該慣用方式(例如“具有A、B和C的至少一個系統”包括但不限于，僅具有A，僅具有B，僅具有C，具有A和B，具有A和C，具有B和C，和/或具有A、B和C，等)。然而，本領域的技術人員還應該理解，無論在說明書還是在權利要求中，實質上表示兩個或更多個可選擇的術語的任何可分離的單詞和/或詞語應該理解成可以包括術語的一個，或術語中的任何一個，或術語中的兩個。例如，詞語“A或B”應理解為包括“A”或“B”或“A和B”的可能。上文說明的實例對本領域的普通技術人員提供了如何制作和使用本文中所述的裝置、系統和方法的實施方式的完整的公開內容和描述，且不旨在限制其各個實施方式的范圍。用于執行對本領域的技術人員是明顯的裝置、系統和方法的上述方式的變型旨在上述權利要求的范圍內。對本領域的技術人員指明了在說明書中提到的本發明所涉及的所有專利和出版物。在該公開內容中引用的所有參考文獻在一定程度上通過引用并入本文，如同每個參考文獻已經以全文單獨引用的方式并入本文。已經描述了裝置、系統和方法的多個實施方式。然而，可以理解，可以做出各種變形而不違背上述實施方式的精神和范圍。因此，其它的實施方式在上文的權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種產生血管的裝置，包括 a)槽通道，所述槽通道與槽入口流體連通； b)源通道，所述源通道與源入口流體連通，所述源通道基本上與所述槽通道平行； c)形成血管的通道，所述形成血管的通道與形成血管的通道的入口流體連通，所述形成血管的通道在所述槽通道和所述源通道之間設置成與所述槽通道的一側和所述源通道的一側接觸，并且所述形成血管的通道基本上平行于所述源通道和所述槽通道； d)第一培養通道，所述第一培養通道與第一培養通道入口流體連通，所述第一培養通道設置成與所述槽通道的另一側接觸，所述第一培養通道基本上平行于所述槽通道；和 e)第二培養通道，所述第二培養通道與第二培養通道入口流體連通，所述第二培養通道設置成與所述源通道的另一側接觸，所述第二培養通道基本上平行于所述源通道， 其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間的相互作用，所述多個微結構以設定的間隔布置在各個相鄰的通道的界面上。
2.一種產生血管的裝置，包括 a)第一培養通道，所述第一培養通道與第一培養通道入口流體連通； b)形成血管的通道，所述形成血管的通道與形成血管的通道的入口流體連通，所述形成血管的通道設置成與所述第一培養通道的一側接觸，并且所述形成血管的通道基本上平行于所述第一培養通道； c)槽通道，所述槽通道與槽通道入口流體連通，所述槽通道設置成與所述第一培養通道的另一側接觸，所述槽通道基本上平行于所述第一培養通道；以及 d)源通道，所述源通道與源通道入口流體連通，所述源通道設置成與所述形成血管的通道的另一側接觸，所述源通道基本上平行于所述第一培養通道， 其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間的相互作用，所述多個微結構以設定的間隔布置在各個相鄰的通道的界面上。
3.一種產生血管的方法，包括 a)將ECM和形成血管的細胞注入根據權利要求I所述的產生血管的裝置的形成血管的通道中； b)將i)所述ECM或ii)所述ECM和共培養的細胞注入所述產生血管的裝置的第一培養通道和/或第二培養通道中；和 c)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入所述產生血管的裝置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培養所述形成血管的細胞和所述共培養的細胞。
4.一種產生血管的方法，包括 a)將ECM注入根據權利要求I所述的產生血管的裝置的形成血管的通道中； b)將形成血管的細胞注入所述產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，并將形成血管的細胞附著在暴露在所述微結構之間的所述ECM上，所述微結構布置在所述形成血管的通道的兩側上； c)將i)所述ECM或ii)所述ECM和共培養的細胞注入所述產生血管的裝置的第一培養通道和/或第二培養通道中；以及 d)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入所述產生血管的裝置的所述槽通道和/或所述源通道中，且培養所述形成血管的細胞和所述共培養的細胞。
5.一種產生血管的方法，包括 a)將ECM注入根據權利要求2所述的產生血管的裝置的形成血管的通道中； b)將共培養的細胞注入所述產生血管的裝置的第一培養通道中，以及將所述共培養的細胞附著在暴露在微結構之間的所述ECM上，所述微結構布置在所述形成血管的通道的一側上；和 c)將血管生成因子和/或細胞培養介質注入所述產生血管的裝置的槽通道和/或源通道中，且培養所述共培養的細胞。
6.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述形成血管的細胞為選自內皮細胞、上皮細胞、癌細胞、干細胞、干細胞衍生的細胞和內皮前驅細胞中的至少一種。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述形成血管的細胞為選自突變細胞、轉基因細胞和轉染細胞中的至少一種。
8.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述ECM為選自膠原蛋白凝膠、纖維蛋白凝膠、基質膠、自組裝多肽凝膠、聚乙二醇凝膠和藻酸鹽凝膠中的至少一種。
9.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述共培養的細胞為選自星形膠質細胞、膠質細胞、間皮細胞、纖維母細胞、平滑肌細胞、癌細胞、外膜細胞、神經膠質細胞、干細胞、干細胞衍生的細胞以及與內皮細胞相互作用的細胞中的至少一種。
10.根據權利要求9的所述方法，其中，所述共培養的細胞為選自突變細胞、轉基因細胞和轉染細胞中的至少一種。
11.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述ECM或所述細胞培養介質包含選自藥物化合物、可溶因子、不可溶因子、生物分子、蛋白質、納米材料和小干擾核糖核酸中的至少一種。
12.—種將流體灌注到根據權利要求3或4的方法所制得的血管中的方法，其中能通過所述源通道和/所述槽通道進入所述血管，由此允許流體流引入所述血管。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述灌注是通過機械裝置引起和控制的。
14.根據權利要求12所述的方法，其中，所述流體包含選自可溶因子、不可溶因子、生物化學物質、生物力學刺激和細胞中的至少一種。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，包含在所述流體中的細胞為選自癌細胞、免疫細胞、干細胞、干細胞衍生的細胞、血細胞和內皮前驅細胞中的至少一種。
16.一種量化血管的屏障功能的方法，包括將生物化學物質注入根據權利要求3或4所述的方法所制得的所述血管中。
17.一種量化血管的通透性的方法，包括將生物化學物質注入根據權利要求3或4所述的方法所制得的所述血管中。
18.一種量化血管的通透性的方法，包括測量根據權利要求3或4所述的方法所制得的所述血管的跨上皮電阻TEER的值。
全文摘要
提供一種產生體外血管的裝置和方法。一種產生血管的裝置，包括a)與槽入口流體連通的槽通道；b)與源入口流體連通、基本上與槽通道平行的源通道；c)與形成血管的通道入口流體連通的形成血管的通道，其在槽通道和源通道之間設置成與槽通道和源通道的一側接觸，且基本上平行于源通道和槽通道；d)與第一培養通道入口流體連通的第一培養通道，其設置成與槽通道的另一側接觸，且基本上平行于槽通道；和e)與第二培養通道入口流體連通的第二培養通道，其與源通道的另一側接觸，且基本上平行于源通道，其中，多個微結構構造成允許包含在每個通道中的生物化學物質之間相互作用，且以設定的間隔被布置在各個相鄰的通道的界面上。
文檔編號C12N5/071GK102899249SQ20121012027
公開日2013年1月30日 申請日期2012年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者全盧力, 金秀東, 李現宰, 鄭旻桓 申請人:首爾大學校產學協力團