專利名稱：一種基于pcr的甜瓜雜交種種子遺傳純度快速鑒定方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于PCR的甜瓜雜交種種子遺傳純度快速鑒定方法。
背景技術：
甜瓜(Cucumis melo L.)屬葫蘆科一年生蔬菜。甜瓜雜交種在產量、品質、抗病性等方面具有較強的雜種優勢，目前市場上對甜瓜雜交種的需求量逐年增加。多數甜瓜為雄全同株(雄花兩性花同株)或雌雄同株異花植物(中國農業科學院鄭州果樹研究所等主編.中國西瓜甜瓜.北京中國農業出版社，2000. 2)，在人工雜交制種過程中，常常由于母本去雄不及時，隔離不嚴或不徹底等原因，會導致甜瓜雜交種混有小部分母本自交或由其 它來源不明花粉混雜所引起的‘假雜種’。另外，由于雜交種商業化程度較高，有少數的經營者對雜交種摻假導致種子遺傳純度下降，給生產者造成巨大的經濟損失，嚴重損害了育種工作者與合法種子生產經營者的正當權益，同時也給種子供應單位帶來極大的索賠風險。因此，在甜瓜雜交種子上市前，簡便、快速、準確地鑒定其遺傳純度已成為育種工作者與種子生產經營者急需解決的難題。目前，種子遺傳純度鑒定普遍采用的方法是田間形態學鑒定、同工酶鑒定，但田間鑒定方法費時費力，成本高，不能滿足市場的要求，且易受季節限制和環境因素影響，準確性低。有時由于假雜交種與真雜交種形態學差異不明顯，在苗期與成株期不易鑒別。同工酶分析易受環境和取材料部位的影響，特別對于一些親本遺傳差異較小的雜交品種，難以進行純度檢測與鑒定，準確度不高(柳李旺等，分子標記技術在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測中的作用.分子植物育種，2004，2(4) :563 568)。近年來，隨著現代生物技術的不斷發展，利用 SSR (Simple Sequence Repeats,簡單序列重復)、ISSR (Inter-Simple SequenceRepeats,簡單序列重復間序列)、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA,隨機擴增多態性DNA)等分子標記技術對雜交種進行遺傳純度鑒定已有相關報道，但大部分還是單獨運用某一種分子標記來進行分析，準確度偏低(Pallavi, H. M.，et al. Identification of SSRmarkers for hybridity and seed genetic purity testing in sunflower(Helianthusannuus L. ) Helia, 2011 (34):59-66)。 利用 SRAP(Sequence-Related AmplifiedPolymorphism,相關序列擴增多態性)、RAPD等多種分子標記同時對甜瓜F1雜交種種子進行遺傳純度檢測，可以有效克服形態學鑒定方法的缺點，不但快速簡便，成本低、穩定可靠，而且不受生長階段與環境影響，已成為甜瓜種子遺傳純度鑒定的重要檢測方法之一。‘海蜜2號’厚皮甜瓜是江蘇省海門市農業科學研究所育成的海蜜系列甜瓜品種之一，具有產量高，品質優，風味獨特，抗病性強等優點，適合于長江中下游多濕地區保護地春、秋兩季栽培，該品種種植面積不斷擴大(顧錫江，施建新，包衛紅.海蜜2號厚皮甜瓜栽培技術規程及其研究與推廣.中國西瓜甜瓜，2003(1) : 16 19)
發明內容
本發明的目的是提供一種基于PCR的甜瓜雜交種種子遺傳純度快速鑒定方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現甜瓜雜交種‘海蜜2號’種子遺傳純度的鑒定方法，分別利用所篩選的SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以提取的‘海蜜2號’甜瓜親本與F1單株基因組DNA為模板進行PCR擴增，應用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物；只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的雜交種，缺少任一親本條帶均為假雜交種；所述的SRAP引物對NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列為SEQ ID NO. 1，反向引物NAUSRfc8序列為SEQ ID NO. 2，該引物組合能夠擴增出大小為350bp的母本特異條帶，370bp的父本特異條帶；所述的RAPD引物NAURP401序列為SEQ ID NO. 3，產生大小為1270bp的母本特異條帶，960bp的父本特異條帶。其中，SRAP標記PCR反應
反應體系為20ng基因組 DNA, I. 2mmol L 1Mg2t, 0. 15mmol L MNTPs,0. 5 ii mol L—1 正向引物 NAUSRem6 和 0. 5 y mol L—1 反向引物 NAUSRfc8,0. 75U TaqDNA 聚合酶，總體系IOu L0擴增程序為94°C 3min ；94 °C lmin, 35 °C lmin, 72 °C Imin 30s, 5 個循環；94°C lmin，50°C lmin，72°C lmin30s，33 個循環；72°C延伸 7min。RATO 標記 PCR 反應反應體系為20ng基因組 DNA, 2. 5mmol L 1MgCl2, 0. 15mmol L MNTPs,0. 4 u mol L4 引物，0. 75U TaqDNA 聚合酶，總體系 18 U L0擴增程序為94°C2min ；94°C 30s, 37°C lmin，72°C lmin 30s，45 個循環;72°C延伸IOmin0根據所述的PCR擴增產物電泳分析，進行種子遺傳純度鑒定；只有同時具有父、母本特異標記條帶的幼苗單株才鑒定為真雜交種，缺少任一親本條帶均判定為假雜交種；根據鑒定結果計算供檢種子的遺傳純度[供檢種子粒數(即供檢幼苗數)-假雜交種粒數(即假雜交幼苗數)]/供檢種子粒數(即供檢幼苗數)X100，單位為％。有益效果本發明篩選出能夠在一代雜種中產生具有父母本特異標記條帶且不受環境影響的分子標記，用于鑒定甜瓜雜交種種子的遺傳純度，可以大大提高雜交種純度鑒定的效率，從而為其種子遺傳純度的快速鑒定建立起高效、準確的質量控制方法。該鑒定方法具有準確性高，不受環境影響，成本低，并且能夠在短時間內準確地鑒定出甜瓜種子遺傳純度等優點。
圖I甜瓜‘海蜜2號’種子遺傳純度檢測特異性引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8的SRAP-PCR電泳圖譜。泳道I :母本；泳道2 :父本；泳道3 42 : ‘海蜜2號’F1雜交種，泳道L =IOObp的分子量標準，箭頭所指為親本特異標記。其中第12泳道只能擴增出350bp的母本特異條帶，第34泳道只能擴增出370bp的父本特異條帶。圖2是甜瓜‘海蜜2號’種子遺傳純度檢測特異性引物NAURP401的RAPD-PCR電泳圖譜。泳道I :母本；泳道2 :父本；泳道3 42 : ‘海蜜2號,F1雜交種，泳道L DL2000的分子量標準，箭頭所指為親本特異標記。其中第12泳道只能擴增出1270bp的母本特異條帶，第34泳道只能擴增出960bp的父本特異條帶。
具體實施方案實施例IIDNA 提取甜瓜‘海蜜2號’種子浸種后，于28°C光照培養箱中催芽并長出幼苗；取100_150mg幼葉，用液氮研磨，加入 ImL CTAB 裂解液(I. 4mol L-1NaCl, 0. Imol L^1TrisHCl, 20mmol T1Na2EDTA, 2%CTAB (質量百分比)，2%PVP (質量百分比)，1%(V/V)巰基乙醇)轉入2. OmL的離心管,65°C水浴30 50min ；12000rpm離心IOmin ;加等體積的氯仿異戍醇(24:1, V/V),靜置3 5min, 12000rpm離心IOmin ;吸上清于新2. OmL離心管中，加入0. I 體積3mol L^1NaAc (pH5. 2)和I體積預冷異丙醇，于4°C或_20°C冰箱中沉淀30min ；4°C,12000rpm 離心 IOmin,倒上清液,加 500 u I TE 緩沖液(10m mol *L_1 Tris/HCl (pH 8. 0), Immol .L-1EDTA(pH 8. 0) ) 65°C水浴 30min ;加入 800 y I 氯仿:異戊醇(24:1, V/V), 12000rpm離心lOmin，上清液轉入于新I. 5mL離心管中；去上清液，加入70%的預冷乙醇清洗DNA ;干燥，加入50 100 ill滅菌的TE緩沖液溶解DNA，放于4°C或_20°C冰箱中備用。2分子標記分析(I) SRAP-PCR 反應反應體系為20ng基因組 DNA, I. 2mmol L 1Mg2t, 0. 15mmol L MNTPs,0. 5 u mol I71正向引物和0. 5 u mol I71反向引物，0. 75U TaqDNA聚合酶，總體系IOu L0擴增程序為94°C 3min ；94 °C lmin, 35 °C lmin, 72 °C lmin 30s, 5 個循環；94°C lmin，50°C lmin，72°C lmin30s，33 個循環；72°C延伸 7min。(2) RAPD-PCR 反應反應體系為20ng基因組 DNA, 2. 5mmol L 1MgCl2, 0. 15mmol L MNTPs,0. 4 u mol L4 引物，0. 75U TaqDNA 聚合酶，總體系 18 U L0擴增程序為94°C2min ；94°C 30s，37。。lmin，72°C lmin 30s，45 個循環;72°C延伸IOmin03擴增產物檢測取擴增產物2. 5 ii L，于8%的非變性聚丙烯胺凝膠(Acr:Bic=29:1，質量比)電泳，電極緩沖液為I150V，具體步驟I)洗玻璃板，晾干后裝板，保證玻璃板不漏膠；2)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備(45mL)
30%Acr:Bis(質量比 29:1)12.0mL
SxTBE9.OmL
細2023.76mL
TEMED40.0.uL
]0%AP0.20mL
3)凝膠溶液配好后，均勻的倒入兩塊玻璃板中間，將梳子垂直插入膠中(注意防止灌膠過程中產生氣泡)，讓其充分凝固；4)待膠凝固好后裝電泳槽，倒入I XTBE電極緩沖液，于90V穩壓下預電泳30 60min;5)擴增產物加3 ii L溴酚藍緩沖液，混勻，每加樣孔上樣量3. 5 ii L ;6) 150V穩壓下電泳2. 5h左右；7)電泳完畢后將玻璃板從電泳槽中取出，剝下凝膠； 8)固定固定液(10%乙醇,0. 5%乙酸)固定15 20min,蒸懼水洗I 2次；9)染色銀染液(0. 2%AgN03)，銀染15 20min，蒸餾水快速洗2次；10)顯色顯色液(I. 5%Na0H, 0. 4% 甲醛，0. 00025%Na2S203)，顯至條帶清晰；11)記錄結果并照相。4有效特征引物的篩選有效特征引物指在一代雜種F1單株中擴增時能夠產生親本特異標記條帶的PCR引物，可以用于種子遺傳純度的分子檢測。利用RAPD和SRAP引物對甜瓜品種‘海蜜2號’及其親本進行擴增。篩選96個SRAP引物組合和144個RAPD引物，結果選出2個有效特征引物(組合)，包括I個SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8與I個RAPD引物NAURP401。SRAP弓丨物組合NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列為SEQ ID NO. I，反向引物NAUSRfc8序列為SEQ ID NO. 2 ；RAPD引物NAURP401序列為SEQ ID NO. 3。利用這2個有效特征引物(組合)對‘海蜜2號’甜瓜所有F1單株進行遺傳純度檢測。該SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRf c8能夠擴增出大小為350bp的母本特異條帶，370bp的父本特異條帶；所述的RAPD引物NAURP401序列為SEQ ID NO. 3，產生大小為1270bp的母本特異條帶，960bp的父本特異條帶。5雜種種子遺傳純度的鑒定及計算應用已經篩選到的SRAP弓丨物組合NAUSRem6/NAUSRfc8和RAPD弓丨物NAURP401分別對40株甜瓜品種‘海蜜2號’幼苗基因組DNA進行PCR擴增，根據擴增產物電泳分析進行種子遺傳純度鑒定。只有同時具有父、母本特異標記條帶的幼苗單株才鑒定為真雜交種，缺少任一親本條帶均判定為假雜交種。根據分子標記有效特征引物的PCR標記分析結果，計算供檢種子的遺傳純度(％)[供檢種子粒數(即供檢幼苗數)-假雜交種粒數(即假雜交幼苗數)]/供檢種子粒數(即供檢幼苗數)X 100。如圖I所示，SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8產生大小為350bp的母本特異條帶，370bp的父本特異條帶；40株甜瓜品種‘海蜜2號’幼苗中，有38株能夠同時擴增出350bp的母本特異條帶，370bp的父本特異條帶，為真雜交種；有2株(第12泳道和第34泳道)則只能擴增出其中一條，為假雜交種；按照上述公式計算得遺傳純度為95%。如圖2所示，RAPD引物NAURP401產生大小為1270bp的母本特異條帶，960bp的父本特異條帶；40株甜瓜品種‘海蜜2號’幼苗中，有38株能夠同時擴增出1270bp的母本特異條帶，960bp的父本特異條帶，為真雜交種；有2株(第12泳道和第34泳道)則只能擴增出其中一條，為假雜交種；按照上述公式計算得遺傳純度為95%。其中SRAP引物代號NAUSRem6，其含義為‘NAU’代表‘南京農業大學’ ；‘SR’代表‘SRAP弓丨物’，‘em6’代表‘實驗室SRAP引物編號’ ；SRAP引物代號NAUSRfc8，其含義為‘NAU’代表‘南京農業大學’ ；‘SR’代表‘SRAP引物’，‘fc8’代表‘實驗室SRAP引物編號’；RAH)引物NAURP401，其含義為‘NAU’代表‘南京農業大學’ ；‘RP’代表‘RAH)引物’，‘401’ 代表‘實驗室RAPD隨機引物編號’。
權利要求
1.甜瓜雜交種‘海蜜2號’種子遺傳純度的鑒定方法，其特征在于分別利用SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以‘海蜜2號’甜瓜親本與F1單株基因組DNA為模板進行PCR擴增，應用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物；只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的雜交種，缺少任ー親本條帶均為假雜交種；所述的SRAP弓丨物組合NAUSRem6/NAUSRf c8的正向引物NAUSRem6序列為SEQ ID NO. I，反向引物NAUSRfc8序列為SEQ ID NO. 2，該引物組合能夠擴增出大小為350bp的母本特異條帶，370bp的父本特異條帶；所述的RAPD引物NAURP401序列為SEQ ID NO. 3，產生大小為1270bp的母本特異條帶，960bp的父本特異條帶。
2.根據權利要求I所述的甜瓜雜交種‘海蜜2號’種子遺傳純度的鑒定方法，其特征在于提取‘海蜜2號’甜瓜親本幼苗與F1單株幼苗基因組DNA為模板進行PCR擴增(I)SRAP 標記 PCR 反應，反應體系為20ng 基因組 DNA, I. 2mmol ·じ1Mg2+，O. 15mmol ·じ1dNTPs，O. 5 μ mo I ·じ1 正向引物 NAUSRem6 和 O. 5 μ mo I ·じ1 反向引物 NAUSRf c8,0. 75U TaqDNA 聚合酶，總體系 10 μ L ;擴增程序為94°C 3min ；94°C lmin,35°C lmin,72°C Imin 30s，5 個循環；94°C lmin，50°C lmin，72°C lmin30s，33 個循環；72°C 延伸 7min ; (2) RAPD 標記 PCR 反應，反應體系為20ng 基因組 DNA, 2. Smmo I · L 1MgCl2, O. 1 Smmo I · L MNTPs, O. 4 μ mo I · L 1引物 NAURP401，0. 75U TaqDNA 聚合酶，總體系 18 μ L ;擴增程序為94°C 2min ；94°C 30s,37°C lmin，72°C Imin 30s，45 個循環；72°C延伸 lOmin。
3.根據權利要求I所述的甜瓜雜交種‘海蜜2號’種子遺傳純度的鑒定方法，其特征在于根據所述的PCR擴增產物電泳分析，進行種子遺傳純度鑒定；只有同時具有父、母本特異標記條帶的幼苗單株才鑒定為真雜交種，缺少任ー親本條帶均判定為假雜交種；根據鑒定結果計算供檢種子的遺傳純度[供檢種子粒數-假雜交種粒數]/供檢種子粒數X 100，單位為％。
全文摘要
本發明公開一種基于PCR的甜瓜雜交種種子遺傳純度快速鑒定方法。該鑒定方法為分別利用所篩選的SRAP引物組合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以‘海蜜2號’甜瓜親本與F1單株基因組DNA為模板進行PCR擴增，應用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物；只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的雜交種，缺少任一親本條帶均為假雜交種。本發明的檢測方法克服了常規田間純度檢測操作復雜、準確度低等缺點，不僅快速、簡便，成本低，穩定可靠，且不受生長階段與環境影響，可以成為甜瓜種子遺傳純度鑒定的重要檢測方法之一。
文檔編號C12Q1/68GK102732621SQ20121019280
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者包衛紅, 徐良, 柳李旺, 陳志成, 龔義勤 申請人:南京農業大學