犀牛角制品真偽及其所屬種類的分子鑒定方法

專利名稱：犀牛角制品真偽及其所屬種類的分子鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種犀牛角制品真偽及其所屬種類的分子鑒定方法。
背景技術：
世界上的犀牛主要包括五個物種，S卩非洲的黑犀(Diceros bicornis)和白犀(Ceratotherium simum),亞洲的印度犀(Rhinoceros unicornis)、爪睡犀(Rhinoceros sondaicus)和蘇門達臘犀(Dicerorhinus sumatrensis)。由于犀牛角是貴重的中成藥原料配藥，犀牛成為近現代偷獵的對象，犀牛棲息地的減少，導致犀牛數量急驟減少。目前亞洲犀幾近滅絕，而現存的非洲犀，數量也不多，為了挽救面臨絕種的犀牛，印度犀和白犀被瀕危動物紅皮書(IUCN)列為受威脅物種，黑犀、爪哇犀和蘇門達臘犀都被列為極危物種。由于犀角被夸大的近乎神奇的藥用價值及其工藝品巨大的收藏價值，目前仍有很多人大量偷獵犀牛或進行有關犀角的非法交易，且據稱不同種類的犀角藥用價值及收藏價值差異相當大，因此區分和鑒別生物工藝品及制品中是否是犀角或是否含有犀角成分及其所屬種類，在實際應用中極為重要，準確、可靠的鑒定方法為相關部門執法和查驗提供有力的證據。我國境內已經沒有野生犀牛，作為《國際瀕危野生動物種貿易公約》的成員國之一，為了更好的保護這個瀕危種，1993年5月29日中國國務院發出了《關于禁止犀牛角和虎骨貿易的通知》，并停止生產含犀角成分的中成藥。但93年以前生產的含有犀角成分的藥物或犀角制品在市場中仍然有售，且價格不菲，藥品成分中是否真的含有犀角成分，需要可靠的鑒定方法。近些年，由于犀角的稀缺和珍貴，有關犀角的非法貿易、偷運或走私從未停止，犀角工藝品價值不斷攀升，而亞洲犀角工藝品的收藏價值更是無法估量，一只明清時代由名家雕刻的亞洲犀角杯價值百萬，甚至千萬。在巨額的經濟利益的誘使下，市場上甚至出現了用牛角或其它仿偽品冒充犀角工藝品及其制品，因此尋找能夠準確鑒定犀角制品真偽或其制品中是否含有犀角成分的生物學方法顯得尤為重要。傳統的犀牛角鑒定方法，主要是形態學和組織學鑒定，這些方法可以鑒定形態完整的犀牛角，然而市場上銷售的犀角多為半成品、粉末狀或經過打磨、拋光、上色后的工藝品，其結構特征不易分辨，此時形態學觀察未必能準確判定犀角制品真偽或其制品中是否含有犀角成分。

發明內容
本發明的目的是提供一種犀牛角制品真偽及其所屬種類的分子鑒定方法。本發明提供了通用引物對在輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛的應用；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對。所述犀牛具體可為非洲黒犀。本發明還提供了一種輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛的方法，包括如下步驟(I)以犀牛角制品的基因組DNA為模板，用通用引物對進行PCR擴增；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對； (2 )將步驟(I)得到的PCR擴增產物依次進行測序和同源性比對，根據同源性比對結果輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛。所述“根據同源性比對結果輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛”的實現方法具體如下將所述測序結果與NCBI的GenBank庫中的COI基因進行BLAST比對，如果測序結果與某種犀牛的COI基因片段同源性最高且為98%以上，則判斷所述犀牛角制品中的犀牛角材料來源于該種犀牛。因為同源性比對結果可能具有一定的局限性，可結合其它現有方法(如構建系統發育樹)進行輔助判斷。所述基因組DNA是采用磁珠法從所述犀牛角制品中提取得到的。所述基因組DNA 具體是采用美國Promega公司的DNA Purification System for food從所述犀牛角制品中提取得到的。從犀角中提取總的DNA存在一定難度，首先犀角中蛋白含量很高，且高度角質化，不利于DNA的釋放；其次，犀牛角制品的打磨工藝、染色等都可能嚴重的破壞基因組DNA，且年代久遠，部分DNA會有降解，也增加了提取難度；再次，由于取材時不能破壞犀牛角制品的表面，因此只能得到極微量的碎屑。磁珠法試劑盒采用先進的分離、純化技術，有效分離并得到了高質量的DNA，特別適用于低拷貝、微量樣本的提取。所述步驟(I)中，所述PCR擴增的反應程序如下94 °C 3min ；94 °C 30sec、
45°C 30sec,72 °C lmin，5 個循環；94 °C 30sec,51 °C lmin、72 °C lmin，35 個循環；72°C IOmin。所述犀牛具體可為非洲黒犀。本發明還保護通用引物對在鑒定市售犀牛角制品真偽中的應用；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對。所述犀牛角制品具體可為非洲黒犀的犀牛角制品。本發明還保護一種輔助鑒定市售犀牛角制品真偽的方法，包括如下步驟(I)以市售犀牛角制品的基因組DNA為模板，用通用引物對進行PCR擴增；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對；(2)將步驟(I)得到的PCR擴增產物依次進行測序和同源性比對，根據同源性比對結果輔助鑒定市售犀牛角制品的真偽。所述“根據同源性比對結果輔助鑒定市售犀牛角制品的真偽”的實現方法具體如下將所述測序結果與NCBI的GenBank庫中的COI基因進行BLAST比對，如果測序結果與犀牛的COI基因片段同源性最高且為98%以上則判斷所述犀牛角制品為真，如果測序結果與非犀牛的COI基因片段同源性最高且為98%以上則判斷所述犀牛角制品為偽。所述基因組DNA是采用磁珠法從所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述基因組DNA具體是米用美國Promega公司的DNA Purification System for food從所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述步驟(I)中，所述PCR擴增的反應程序如下94 °C 3min ；94 V 30sec、45°C 30sec,72°C lmin，5 個循環；94°C 30sec、51°C lmin、72°C lmin，35 個循環；72°C IOmin0所述犀牛具體可為非洲黒犀。
以上任一所述的犀牛角制品可為主要材料為犀牛角的犀牛角工藝品，也可為僅添加了少量犀牛角材料的藥品或營養品。本發明為犀牛角制品真偽及其所屬種類的的鑒定提供準確可靠的分子生物學技術方法，也為出入境生物資源查驗及物種管制，防止非法交易及口岸執法提供科學有效的鑒定依據。


圖I為樣本2的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；M為分子量標準，I至4均為樣本的PCR擴增產物。
圖2為樣本I的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；M為分子量標準，I至4均為樣本的PCR擴增產物。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。實施例I、鑒定市售犀牛角制品真偽及其中的犀牛角材料來源于哪種犀牛樣本I和樣本2分別為兩個市售犀牛角制品(犀角杯)，其中樣本I已鑒定為非洲黑犀的犀牛角制品，樣本2已鑒定為黃牛的牛角制品(即假冒偽劣的犀牛角制品)，將樣本I和樣本2分別進行以下操作I、用電鉆鉆取微量碎屑，采用磁珠法(DNA Purification System for food,美國Promega公司試劑盒)分別提取各個樣本的基因組DNA。2、分別以步驟I提取的各個基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對(靶基因為COI基因)進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1，其中I代表樣本1、2代表樣本2。Fl :5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，；Rl :5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。PCR 反應體積(25 iil)，含 2. 5 ill IOXQiagen PCR 緩沖液(包含 15mM MgCl2),0. 5u IMgCl2 (25mM) ,0. 25 u I dNTP Mix(IOmM) ,0. 5u I Fl (IOmM)、0. 5 y I Rl (IOmM)、0. 5u ITaq DNA 酶(Qiagen, 5U/L)、2. Oii I 基因組 DNA。PCR 反應程序94 °C 3min ；94 °C 30sec、45 °C 30sec、72 °C lmin, 5 個循環；94°C 30sec,5rC lmin、72°C lmin，35 個循環；72°C IOmin03、分別將步驟2得到的各個PCR擴增產物進行測序。樣本I的測序結果見序列表的序列1，樣本2的測序結果見序列表的序列2。根據測序原理，序列I和序列2中自5’末端第56位至自3’末端第57位之間的序列為可信區間。4、將步驟3得到的各個測序結果分別在GenBank中進行BLAST比對。樣本I與非洲黑犀相似性高達98% (非洲黑犀中的同源序列見GENBANK ACCESSION NO. FJ905814. I自5’末端第5399至5999位核苷酸)，即該犀牛角制品中的犀牛角材料疑似來自非洲黒犀。樣本2與黃牛的相似性為100% (黃牛中的同源序列見GENBANK ACCESSI0NN0. HQ184039. I自5’末端第5736至6 336位核苷酸)，即該犀牛角制品中的犀牛角材料疑似來自黃牛，為偽造的犀牛角制品。
權利要求
1.通用引物對在輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛中的應用；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對。
2.一種輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛的方法，包括如下步驟 (1)以犀牛角制品的基因組DNA為模板，用通用引物對進行PCR擴增；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對； (2)將步驟(I)得到的PCR擴增產物依次進行測序和同源性比對，根據同源性比對結果輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述基因組DNA是采用磁珠法從所述犀牛角制品中提取得到的。所述基因組DNA具體是采用美國Promega公司的DNAPurificationSystem for food從所述犀牛角制品中提取得到的。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述PCR擴增的反應程序如下94で 3min ；94°C 30sec,45°C 30sec,72°C lmin，5 個循環；94で 30sec、51tlmin、72°C lmin，35 個循環；72で IOmin0
5.通用引物對在鑒定市售犀牛角制品的真偽中的應用；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對。
6.ー種輔助鑒定市售犀牛角制品的真偽的方法，包括如下步驟 (1)以市售犀牛角制品的基因組DNA為模板，用通用引物對進行PCR擴增；所述通用引物對為序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對； (2)將步驟(I)得到的PCR擴增產物依次進行測序和同源性比對，根據同源性比對結果輔助鑒定市售犀牛角制品的真偽。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在干所述基因組DNA是采用磁珠法從所述市售犀牛角制品中提取得到的。所述基因組DNA具體是采用美國Promega公司的DNAPurification System for food從所述市售犀牛角制品中提取得到的。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述PCR擴增的反應程序如下94で 3min ；94°C 30sec,45°C 30sec,72°C lmin，5 個循環；94で 30sec、51tlmin、72°C lmin，35 個循環；72で IOmin0
全文摘要
本發明公開了一種犀牛角制品真偽及其所屬種類的分子鑒定方法。本發明提供了通用引物對在輔助鑒定犀牛角制品中的犀牛角材料來源于哪種犀牛中的應用。所述通用引物對為序列表的序列1所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的引物對。本發明為犀牛角制品真偽的鑒定工作提供準確可靠的分子生物學技術方法，也為出入境生物資源查驗及物種管制，防止非法交易及口岸執法提供科學有效的鑒定依據。
文檔編號C12Q1/68GK102732634SQ20121024207
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月12日 優先權日2012年7月12日
發明者宋云, 張永江, 李明福, 王仁睿, 許瑾, 趙竹, 魯潔 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院