專利名稱：Pcr-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起醫院感染和細菌性食物中毒的一種主要病原菌，該菌可分泌20多種毒性蛋白質，主要存在于皮膚、粘膜，特別是鼻咽部，30%-80%的人群為該病原菌的攜帶者，日本的調查結果表明，平均32. 5%的食品存在金葡菌的污染。隨著分子生物學的發展，已有用普通PCR或熒光PCR檢測金黃色葡萄球菌的報道，雖然這些方法可達到快速、高通量的目的，但卻無法獲得分子診斷的黃金標準-DNA堿基序 列，因此有出現假陽性的可能。焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是近年來發明的一項實時地進行短片段DNA測序技術，該技術在DNA序列分析時不需要電泳和熒光標記，直接測定測序引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認PCR產物，同時由于主要分析PCR產物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的二級結構造成的人工假象，使測序結果更加準確，目前應用于基因表達、病毒檢測、SNP分析、耐藥基因檢測、真菌鑒定、DNA甲基化分析等多個領域。致病性較強的金黃色葡萄球菌可產生凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，附著于細菌表面成塊，凝塊包繞細菌，使其免遭抗生素、抗體、吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有2種凝固酶,一種是分泌至菌體外的蛋白質稱為游離凝固酶(FreeCoagulase),此酶與血漿中的凝固酶反應因子協同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出，另一種結合于菌體表面并不釋放，稱為結合凝固酶(Bound Coagulase)或凝聚因子(ClumpingFactor),它可直接作用于纖維蛋白原,可用玻片法檢出。凝固酶因子試驗和血衆凝固酶試驗是兩個不相關試驗，兩者不能相互替代，也不可相互印證。金黃色葡萄球菌既可產生凝固酶，亦可產生凝集因子，而血漿凝固酶試驗是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的關鍵。我國國家標準GB4789. 10-2010《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》，也將血漿凝固酶試驗作為鑒定金黃色葡萄球菌的指標。
發明內容
本發明的目的是提供簡便、快捷、準確性高、特異性強的PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發明根據金黃色葡萄球菌的凝固酶基因保守序列設計擴增引物和測序引物，建立了結合PCR-焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌的方法，從而實現了本發明的目的。本發明的PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物
PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)測序引物S CTTTAAGCGATAATTATACT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本發明的第二個目的是提供PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)
測序引物S CTTTAAGCGATAATTATACT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本發明的第三個目的是提供非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2 )使用上述PCR弓丨物進行PCR反應，回收PCR產物，制備單鏈模版，然后應用上述測序引物對PCR產物進行焦磷酸測序，自測序引物3\端后的第一個堿基開始測序，測序引物后的29個DNA堿基序列為CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA時，判斷樣品中含有金黃色葡萄球菌。優選，所述的PCR 反應，其擴增體系 50 μ L，PCR Mix Buffer25 μ 1，Taq 酶 5 μ 1，MgCl2 I μ 1,10 μ M上、下游引物各2 μ I,DNA模板I μ I,去離子水14 μ I,所述的PCR反應條件為預變性 95°C 5min ；95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，45 個循環；72°C 12min。本發明根據金黃色葡萄球菌血漿凝固酶DNA堿基列中的保守區域，用PyroMarkAssay Design軟件設計PCR引物和測序引物，建立了 PCR-焦磷酸測序，從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌的方法。本發明先對目標片段進行PCR擴增，保證擴增片段的特異性，再用擴增產物制備單鏈模板，在測序引物的引導下進行焦磷酸測序。檢測的所得堿基序列，用NCBI網站的BLAST功能反復比對時發現，血衆凝固酶DNA測序引物后的喊基序列具有良好的特異性,測序引物后29個DNA堿基序列為CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA時就可鑒定金黃色葡萄球菌。PCR擴增試驗結果，擴增引物具有較好的特異性，20株金黃色葡萄球菌均擴增出大小215bp大小的DNA片段,而單增李斯特氏菌等其他對照菌株未擴增出DNA條帶。焦磷酸測序結果，20株金黃色葡萄球菌所得DNA堿基序列測序引物后的堿基序列比對，100%匹配的堿基數分別為29bp-44bp，均超過需檢測的29個DNA堿基序列，而其他對單增李斯特氏菌等對照菌株未測出DNA堿基序列。模擬樣品檢測結果，焦磷酸測序結果與傳統檢測方法一致，但在檢測周期上傳統方法需要培養、劃線分離、凝固酶試驗等，需要2d-3d，而焦磷酸測序方法增菌18h-24h、核酸提取、PCR擴增和焦磷酸測序3h，整個試驗21h-27h完成，簡便快捷，而且可通DNA堿基序列的水平上檢測金黃色葡萄球菌，避免了單純PCR擴增檢測易污染造成的假陽性結果，準確性高，具有較好的應用前景。
圖I是金黃色葡萄球菌血漿凝固酶(Co)基因的PCR擴增產物電泳圖，其中M :50bpmarkerU BJ CMCC26003、2_20 :JP1_JP19、21 :去離子水；圖2是金黃色葡萄球菌特異性試驗PCR擴增產物電泳圖，M:50bpmakerU:JPCMCC26003、2 :單增李斯特菌、3 :阪崎腸桿菌、4 :糞鏈球菌、5 :痢疾志賀氏菌、6 :小腸結腸炎耶爾森氏菌、7 :肺炎克雷伯氏菌、8 :藤黃微球菌、9 :大腸桿菌、10去離子水圖3是BJ CMCC26003焦磷酸測序結果圖；圖4是JPl焦磷酸測序結果圖；圖5是JP2焦磷酸測序結果圖；圖6是JP3焦磷酸測序結果圖；圖7是JP4焦磷酸測序結果圖；圖8是JP5焦磷酸測序結果圖
圖9是JP6焦磷酸測序結果圖；圖10是JP7焦磷酸測序結果圖；圖11是JP8焦磷酸測序結果圖；圖12是JP9焦磷酸測序結果圖；圖13是JPlO焦磷酸測序結果圖；圖14是JPll焦磷酸測序結果圖；圖15是JP12焦磷酸測序結果圖；圖16是JP13焦磷酸測序結果圖；圖17是JP14焦磷酸測序結果圖；圖18是JP15焦磷酸測序結果圖；圖19是JP16焦磷酸測序結果圖；圖20是JP17焦磷酸測序結果圖；圖21是JP18焦磷酸測序結果圖；圖22是JP19焦磷酸測序結果圖；圖23是單增李斯特氏菌焦磷酸測序結果圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :I、材料和方法菌株來源金黃色葡萄球菌共20株，其中標準菌株I株-金黃色葡萄球菌CMCC26003，不同食品中的分離株19株，菌株信息見表I。陰性對照菌株7株，分別為單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC29212。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國藥品生物制品鑒定所和廣東出入境檢驗檢疫局技術中心。所有菌株均經相應國家標準進行了確證。表I :金黃色葡萄球菌菌株信息菌株編號樣品名菌株編號菌株編號樣品名樣品名
JPl凍羅非魚JP2豬腳JP3濕魚肚
JP4凍豬后腳JP5凍帶魚JP6全殼牡蠣
JP7 冰鮮鴿JP8豬大腸IP9冰凍魚肚
JPlO凍羅非魚片JPll鰻魚JP12凍羅非魚片
JP13凍金線魚JP14凍金線魚JP15凍金線魚
JP16凍南倉魚JP17凍金線魚JP18凍羅非魚片· JP19 豬腳CMCC26003標準菌株I. 2主要儀器和試劑焦磷酸測序PyroMark ID系統-瑞典Biotage公司；PCR擴增儀-PE9700型；核酸提取儀-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、瓊脂糖、PCR分子量標記(50_500bp) Taq酶-寶生物工程(大連)有限公司；鏈親和素標記磁珠(sepharosebeads) -GE. Healthcare公司；焦磷酸測序用酶、dNTP、結合緩沖液(Binding Buffer)、退火緩沖液(Annealing Buffer)、變性緩沖液(Denaturation Buffer)、洗漆緩沖液(WashingBuffer)等-QIAGEN上海辦事處；7. 5%氯化鈉肉湯-北京陸橋有限公司。1.3引物和探針設計根據GenBank公布的金黃色葡萄球菌凝固酶基因序列中的保守區域，用PyroMark Assay Design軟件設計引物和測序引物，上游引物F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG,下游引物 R:TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC，測序引物 S :CTTTAAGCGATAATTATACT，擴增片段大小分別為215bp，下游引物5/端標記生物素，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。I. 4模板制備所有菌株均用7. 5%氯化鈉肉湯36°C培養18h_24h，取Iml菌懸液移入離心管，12000r/min離心5min去上清,用Iml去離子水漂浮沉淀，12000r/min離心3min去上清，重復兩次，最后加200 μ I去離子水在核酸提取儀上提取DNA，作為DNA模版，用于PCR擴增。I. 5PCR擴增體系及電泳參數擴增體系50μ L，PCR Mix Buffer25 μ 1，Taq酶5 μ IjMgCl2 I μ 1，10 μ M 上、下游引物各 2 μ I (上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG,下游引物R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC)，DNA模板I μ 1，去離子水14 μ I。循環參數為預變性 95°C 5min，95°C 15s，65°C 30s, ,72°C 30s，45 個循環，72°C 12min，4°C保存。PCR 產物一部分在2%瓊脂糖凝膠上電泳，另一部分用于焦磷酸測序。PCR擴增產物電泳結果凝固酶基因PCR擴增結果，20株金黃色葡萄球菌均擴增出215bp大小的DNA片段(圖1)，而單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC29212等對照菌株未見擴增條帶(圖2 )，表明設計的擴增引物具有較好的特異性，能特異性地擴增金黃色葡萄球菌。I. 6單鏈模板制備及焦磷酸測序將15 μ I PCR產物轉移至96孔PCR板中，加入2 μ I 磁珠(sepharose beads), 20 μ I 結合緩沖液(Binding Buffer)和 43 μ I 純水，常溫震蕩混20min ;打開真空泵,將真空預裝工具prep tool在高純水中清洗30秒,將prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完畢后將攜帶有磁珠的prep tool放入70%乙醇中5秒,再分別在變性緩沖液Denaturation Buffer和洗漆緩沖液WashingBuffer中各清洗20s 30s, prep tool放在裝有退火預混液PSQ 96板(預先加入43 μ I退火緩沖液 Annealing Buffer 和 2 μ I 測序引物 S CTTTAAGCGATAATTATACT, 10 μ M)的上方，關掉真空泵，輕輕搖動釋放磁珠，將PSQ96板在80°C放置5min，自然冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。測序程序采用SQA模式，按ATCG的堿基排列順序，依次循環加入15次，根據軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PSQ96孔板和試劑倉放入PyroMark ID系統中進行焦磷酸測序。測序峰及相應的DNA堿基序列由儀器SQA軟件自動分析產生。I. 7焦磷酸測序結果判斷20株金黃色葡萄球菌焦磷酸測序結果，根據模版濃度等條件的不同，測出 38bp-44bp大小不等的DNA堿基序列(圖3-圖22)，而單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102和糞鏈球菌ATCC29212等7株對照株未測出DNA堿基序列(圖23，本研究只列出單增李斯特氏菌焦磷酸測序結果圖)。20株金黃色葡萄球菌檢測的DNA堿基序列，分別與測序弓I物后的DNA序列比對，發現100%匹配的DNA堿基數29bp-44bp，所有有效測序結果均超過29個堿基(表2)，表明測序引物的特異性較好，并且可用測序引物后的CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA的29個DNA堿基序列特異性地檢測金黃色葡萄球菌。表2 :金黃色葡萄球菌焦磷酸測序檢測結果
權利要求
1.一種PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物 PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；下游引物 R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ； 測序引物 S :CTTTAAGCGATAATTATACT。
2.—種PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為 PCR 引物上游引物 F AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG ；下游引物 R TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC ； 測序引物 S :CTTTAAGCGATAATTATACT。
3.一種非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權利要求I所述的PCR引物進行PCR反應，回收PCR產物，制備單鏈模版，然后應用權利要求I所述的測序引物對PCR產物進行焦磷酸測序，自測序引物3\端后的第一個堿基開始測序，測序引物后的29個DNA堿基序列為CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA時，判斷樣品中含有金黃色葡萄球菌。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的PCR反應，其擴增體系50μ L，PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq 酶 5 μ 1，MgCl2 I μ 1，10 μ M 上、下游引物各 2 μ 1，DNA 模板I μ 1，去離子水14μ 1，所述的PCR反應條件為預變性95°C 5min ；95°C 15s, 65 °C 30s,，72°C 30s, 45 個循環；72°C 12min。
全文摘要
本發明公開了一種PCR-焦磷酸法檢測金黃色葡萄球菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發明根據金黃色葡萄球菌血漿凝固酶DNA堿基列中的保守區域，用PyroMark Assay Design軟件設計PCR引物和測序引物，建立了PCR-焦磷酸測序，從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌的方法。本發明先對目標片段進行PCR擴增，保證擴增片段的特異性，再用擴增產物制備單鏈模板，在測序引物的引導下進行焦磷酸測序。檢測的所得堿基序列，用NCBI網站的BLAST功能反復比對時發現，血漿凝固酶DNA測序引物后的堿基序列具有良好的特異性，測序引物后29個DNA堿基序列為CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA時就可鑒定金黃色葡萄球菌。
文檔編號C12N15/11GK102816844SQ201210281539
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者許龍巖, 袁慕云, 李宏, 唐勤, 相大鵬 申請人:許龍巖, 袁慕云, 李宏, 唐勤, 相大鵬