專利名稱：短日照敏感型細胞死亡ssd1基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體為一種短日照敏感型細胞死亡SSDl基因及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
細胞死亡是生物體的一種常見的生命現象。細胞因受到嚴重損傷而累及胞核時，呈現代謝停止、結構破壞和功能喪失等不可逆性變化，此即細胞死亡。一般來講，細胞死亡可分為兩種類型生理性死亡(physiological cell death)和非生理性死亡(nonphysiological cell death)。生理性死亡是由細胞內的死亡程序所控制的細胞死亡，生物在其生長發育及形態建成過程中，利用生理性死亡控制細胞的數目，或作為一種防御 機制清除被感染、被誘變或被損傷的細胞。非生理性死亡是生物在生長發育過程中由于意外的外界因素如激光照射、有毒物質傷害或營養缺乏等，或者由于生物體內的缺陷如產生ATP的酶突變，或者突變后的基因產物對細胞具有毒害作用等原因引起的細胞死亡(Vauxand Korsmeyer, 1999)。因此,導致生物體細胞死亡的機制非常復雜。目前關于植物細胞死亡的遺傳調控機制有了一定的進展，近年來的研究發現光周期也會調控植物的細胞死亡。在擬南芥中，Dietrich等篩選了一系列受光照調控的細胞死亡突變體，其中Isdl和lsd3的細胞死亡在短日照條件下受到抑制，而lsd2和lsd5的細胞死亡在長日照條件下受到抑制(Dietrich et al. , 1994) ;Ishikawa等分離出的三個細胞死亡突變體，其中Ienl和len3只在短日照條件下導致細胞死亡(Ishikawa etal., 2003; Ishikawa et al.，2006)，而lin2在所有的生長條件下都會發生細胞死亡，但在長日照條件下較嚴重(Ishikawa et al.，2001);突變體atipsl是肌醇合成的關鍵酶基因發生突變，同時其細胞死亡依賴于光照長度(Meng et al. , 2009) ;flul突變體在由黑暗轉為光照培養時，也會迅速表現出白化和壞死(Meskauskiene et al.，2001)。
發明內容
針對以上的背景技術，本發明提供一種短日照敏感型細胞死亡SSDl基因及其編碼蛋白與應用，所述SSDl基因具有如SEQ ID NO :1所示的序列。其中，所述SSDl基因編碼序列如SEQ ID NO :3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO 5 所示。其中，所述SSDl基因的應用，是SSDl基因在光周期調控植物細胞死亡中的應用。其中，所述SSDl基因的應用，是SSDl基因在轉基因植物中的應用。其中，所述SSDl基因的應用，是該基因的功能喪失在光周期調控植物細胞死亡中的應用。其中，所述SSDl基因的應用，是植物中其同源基因的研究在光周期調控植物細胞死亡中的應用。本發明是以模式植物擬南芥為試驗材料，通過篩選EMS誘變的突變體庫，在短日照條件下篩選得到一個細胞死亡突變體，命名為短日照敏感型細胞死亡突變體(short-daysensitive cell death mutant l，ssdl)。采用圖位克隆法分離SSDl基因，并發現了該基因突變位點。實驗結果表明，SSDl基因的突變在短日照條件下導致了細胞的死亡，SSDl基因是擬南芥在短日照條件下生長所必需的，且在植物中具有廣泛的同源性。進一步，本發明通過試驗表明，SSDl基因具有在短日照條件下調控植物細胞死亡的功能，該基因生物學功能的發現以及同源基因的相關研究有助于深化光周期調控植物細胞死亡的研究，對探討植物細胞死亡的分子機理具有重要的科學意義，同時對短日照地區作物品種改良具有重要的應用價值。
圖I是短日照條件下ssdl突變體和野生型(Col-O)的表型圖(Bar=5cm)。圖2是短日照條件下ssdl突變體的白化死亡的莖桿、葉片及果莢圖(Bar=lcm)。 其中左圖為莖桿；右上圖為葉片；右下圖為果莢。圖3是ssdl突變體在MS培養基(含1%蔗糖)上的種子萌發及幼苗的白化死亡表型圖。其中LD表示長日照；SD表示短日照；d為天數；四副小圖皆為野生型(Col-O)與ssdl突變體的對照圖，左側為野生型，右側為ssdl突變體。圖4是轉基因植株的互補驗證圖。圖5是蓮座葉的臺盼藍染色圖(Bar=250 μ m)。
具體實施例方式實施例I :擬南芥EMS誘變與篩選一、化學誘變處理將擬南芥野生型(Col-O)種子置于重蒸水中攪拌30分鐘，在4°C下放置12小時后，把種子轉移到IOOmM的磷酸緩沖液(pH6. 5)中，加入O. 2% (v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)，封口后放在水浴(25°C)振蕩器上振蕩12hr，然后用蒸餾水漂洗種子。二、誘變植株培養將漂洗好的種子置于4°C下春化3天，播種于人工土壤(東北黑土 蛭石=1 :1，V/V)中。在光照培養室生長，培養溫度22±2°C ;光照強度80-120 μ Hi0InT2iT1 ;相對濕度65% ；光周期為16小時光照、8小時黑暗。采收成熟種子即M1代，M1代自交收種得M2代，干燥備用。三、突變體的篩選將M2代種子表面消毒、用無菌水沖洗后，點播于MS培養基上。在4°C黑暗下春化3天，轉入長日照條件(16小時光照、8小時黑暗)下生長。培養一周轉入人工土壤，生長2-3周，然后轉入短日照條件(8小時光照、16小時黑暗)下，生長4-7天，從中篩選出現細胞死亡的植株，然后轉入正常光照條件下(即長日照條件)生長，單株收獲種子(M3)。在相同條件下再分別對M3代株系進行篩選，鑒定出一個穩定遺傳的株系，命名為短日照敏感型細胞死亡突變體(short-day sensitive cell death mutant l，ssdl)。
在長日照條件下，該突變體的表型與擬南芥野生型(Col-O)沒有明顯差異；但將其轉入短日照條件下，該突變體的表型出現異常，見圖1，生長受到抑制，植株葉片、幼嫩的莖、花序和果莢會發生部分萎蔫進而白化死亡，見圖2，但不導致植株整體死亡，可結少量種子。發明人繼續觀察比較該突變體與野生型(Col-Ο)，發現鋪種在含1%蔗糖的MS培養基上的ssdl突變體的種子萌發不受光周期的影響，但是I周以后大部分突變體幼苗出現白化死亡,見圖3。實施例2 圖位克隆法分離SSDl基因一、圖位克隆群體的構建將ssdl突變體(Col-Ο背景)與另一生態型Landsberg erecta (Ler)進行雜交，得到F1代雜合體A代雜合體自交，得到&代；播種F2代種子，在短日照條件下篩選出現細胞壞死的個體，在同一個育苗盤中同時鋪種一行ssdl突變體作為對照。共收集了 2500株F2遺傳群體用于基因的圖位克隆。二、分子標記的選擇與設計根據TAIR網上(www. arabidopsis. org)公布的擬南芥全基因組DNA多態性數據庫，選擇了分子標記NT7123, EAT，F21M12, NGA63, F16J7-TRB，JV18/19, F21J9-83201。根據文獻報道，設計了分子標記SGCSNP9772，見表I。此外，基于TAIR網上CACP(CereonArabidopsis polymorphism Collection)釋放的Ler已測序的表達序列標簽(EST)與Col-O序列進行比對，找出InDels位點，設計了 3對SSLP和5對CAPS分子標記用于基因精細定位，見表2及表3。引物的合成皆由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。表I已公布用于定位的分子標記
權利要求
1.一種短日照敏感型細胞死亡SSDl基因，其特征是所述SSDl基因具有如SEQ ID NO:I所示的序列。
2.如權利要求I所述的基因，其特征是所述SSDl基因編碼序列如SEQID NO 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO : 5所示。
3.如權利要求I所述基因的應用，其特征是SSDl基因在轉基因植物中的應用。
4.如權利要求I所述基因的應用，其特征是SSDl基因在光周期調控植物細胞死亡中的應用。
5.如權利要求I所述基因的應用，其特征是該基因的功能喪失在光周期調控植物細胞死亡中的應用。
6.如權利要求I所述基因的應用，其特征是植物中SSDl基因的同源基因的研究在光周期調控植物細胞死亡中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種短日照敏感型細胞死亡SSD1基因及其編碼蛋白與應用，所述SSD1基因具有如SEQ ID NO1所示的序列。本發明是以模式植物擬南芥為試驗材料，通過EMS誘變，篩選獲得一個短日照敏感型細胞死亡突變體ssd1。采用圖位克隆法分離該基因，并發現了基因突變位點，該基因的缺失在短日照條件下導致了細胞死亡。SSD1基因是擬南芥在短日照條件下生長所必需的，且在植物中具有廣泛的同源性。該基因生物學功能的發現以及同源基因的相關研究有助于深化光周期調控植物細胞死亡的研究，對探討植物細胞死亡的分子機理具有重要的科學意義，同時對短日照地區作物品種改良具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/29GK102911946SQ20121029436
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者任春梅, 彭文, 韓成云, 謝道昕, 朱旗, 彭志紅, 陳 峰 申請人:湖南農業大學