專利名稱：維生素c二步發酵法中小菌的選育方法
技術領域：
本發明涉及生物與醫藥技術領域，特別是涉及一種維生素C 二步發酵法中小菌的選育方法。
背景技術：
維生素C(VitanunC，Vc)是人體營養必需的維生素，其不僅作為重要的醫藥產品用于治療多種疾病，也廣泛用于食品、飼料及化妝品中。隨著維生素C應用范圍的增加，市場需求量日益增大，使人們對VC生產技術不斷地進行研究、改進。目前，維生素C的發酵生產采用二步法實現，即采用芽孢桿菌(俗稱大菌，主要有巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌)和氧化葡糖桿菌(俗稱小菌)混菌發酵，其中小菌為產酸菌，可以產生2-酮基-L-古龍酸，但單獨存在產酸能力較小；而大菌不 產酸，但與小菌共同發酵明顯促進小菌產酸，為小菌伴生菌，整個發酵中小菌起到關鍵的作用。研究證實，大菌營養體在變成芽孢過程中，釋放細胞內含物，使蛋白質含量增加，可以促進小菌生長，縮短小菌生長的延遲期。現有技術中，VC 二步發酵法中小菌的選育是通過將種子液分離至平板培養，收集一定數量的小菌混合液，經物理誘變或者化學誘變后，涂布至平板培養，然后收集誘變后小菌混合液接斜面，搭接大菌培養，最后進行篩選。由于小菌個體微小，如單菌落不進一步進行增值培養，僅僅采用現有技術，將誘變后小菌收集一定數量混合進行整體考察，因為不是逐一篩選，致使未變異菌落與變異菌落、正突變與負突變的菌落無法單獨體現，所以目的菌株優良特性很難得到充分表達，給篩選工作增加難度。
發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種有效表達菌種誘變的效果，使具有各類特性的菌株性能一一得到體現，從而很容易獲得目的菌株，降低篩選難度的維生素C 二步發酵法中小菌的選育方法。為實現上述發明目的所采取的技術方案為一種維生素C 二步發酵法中小菌的選育方法，其特征是將誘變后的小菌單菌落，采用增殖培養的方法進行逐一篩選。上述小菌的選育過程為將處于對數生長期的大小菌混合種子液分離至平板培養，收集一定數量的小菌進行誘變，后涂布至平板，搭接大菌進行平板培養，培養結束后選取經誘變得到的小菌單菌落逐一分別涂布至平板，搭接大菌進行增殖培養，再逐一接斜面，搭接大菌進行斜面培養，最后搖瓶篩選目的菌株。所述大小菌混合種子液是指將包含有大小菌混合菌的出發菌株儲存液接種至種子培養基中，在25-32°C下200r/min振蕩培養至對數生長期，其所用的種子培養基為L_山梨糖I. 5，玉米漿O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸鈣O. 3，pH值為7. 0，121°C，30min滅菌，單位 g/I00ml。
所述小菌誘變采用紫外燈照射誘變。上述搭接大菌是指在已經涂布小菌的培養基上接種大菌。上述搖瓶篩選是指將斜面培養的菌種接種至發酵培養基中，在25-32°C下200r/min振蕩培養3-4天，檢測發酵液中古龍酸含量及殘余L-山梨糖濃度，留種。本發明將經誘變后的小菌單菌落，采用增殖培養的方法進行篩選，使具有各類特性的菌株性能一一得到體現，成功地淘汰了非目的菌株而得到目的菌株，使獲得優良性能目的菌株的幾率得到提高，與現有技術相比，VC 二步菌小菌單菌落選育的方法，誘變效果得到充分表達，目前已成功地得到一株周期短，產酸高、糖酸轉化率高的菌株。其在搖瓶混菌發酵中古龍酸的質量濃度比現有選育方法獲得的菌株提高5%以上，糖酸轉化率提高3-5%以上。
具體實施方式
下面所例舉的具體實施例僅僅是對本發明的解釋說明，不構成對本發明的任何限制。I選育的步驟將處于對數生長期的種子液分離至平板培養，收集一定數量的小菌進行誘變后涂布至平板，搭接大菌進行平板培養，培養結束后選取經誘變得到的小菌單菌落逐一分別涂布至平板，搭接大菌進行增殖培養，再逐一接斜面，搭接大菌進行培養斜面，搖瓶篩選目的菌株。實驗數據統計分析，初篩留種。2選育篩選過程2. I大小菌的分離取出發菌株儲存液(大小菌的混菌)接種至種子培養基中(使用種子培養基為(g/100ml) :L-山梨糖I. 5，玉米漿O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸鈣O. 3，pH值為7.0，121°C，30min滅菌)。25_32°C下200r/min振蕩培養16hr左右，生長至對數生長期，即細胞大量繁殖，代謝活動旺盛的時期。取上述種子液稀釋至10-4-10-5濃度涂布到分離平板(所用培養基為(g/100ml)L-山梨糖 I. 5，玉米漿 O. 3，蛋白胨 O. 5，尿素 0.4, KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 02，瓊脂 2. 0，pH 值為 7. 0,121°C滅菌 30min)。25-32。。培養 2-3 天。2. 2小菌菌懸液的制備及處理將2. I平板中小菌，用接種環刮下，收集制成小菌混懸液并稀釋，鏡檢可見單個菌體。用15w紫外燈(有效波長2537埃)距離30cm照射I分鐘左右，死亡率90-95%，進行處理后涂布至平板(所用培養基為(g/100ml) :L-山梨糖I. 5，玉米漿0.3，蛋白胨0.5，尿素 0. 4，KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 0. 02，瓊脂 2. O, pH 值為 7. 0,121。。滅菌 30min)。用接種針挑取大菌均勻接至已涂布小菌的平板中，25-32°C培養2-3天。2. 3小菌增殖培養將2.2中培養的小菌單菌落，用接種環逐一分別挑至平板(所用培養基為(g/100ml) L-山梨糖 1.5，玉米漿 0.3，蛋白胨 0.5，尿素 0·4，ΚΗ2Ρ040· LMgSO4 ·7Η20 0. 02,瓊脂2. 0，pH值為7. 0，121°C滅菌30min)，用接種針挑取大菌均勻接至已涂布小菌的平板中，25-32 °C增殖培養2-3天。2. 4小菌斜面培養
將增殖后的小菌逐一接斜面(所用培養基為(g/100ml) :L_山梨糖I. 5，玉米漿O. 3，蛋白胨 O. 5，尿素 O. 4，KH2PO4O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 02，瓊脂 2. 0，pH 值為 7. 0，121°C滅菌30min)，用接種針挑取大菌均勻接至已涂布小菌的斜面中，25-32°C培養2_3天。2. 5搖瓶篩選將2. 4中的斜面取2環接種至發酵培養基(所用培養基為(g/100ml) :L_山梨糖8.0，玉米漿 L 5，尿素 1.2，pH 值為 7. 0，121°C滅菌 30min)，25-32。。下 200r/min 振蕩培養3-4天。檢測發酵液古龍酸含量及殘余L-山梨糖濃度，留種。本次試驗獲得2株菌株提高率在5%以上。搖瓶結果如下
權利要求
1.一種維生素C ニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征是將誘變后的小菌單菌落，采用増殖培養的方法進行逐一篩選。
2.按照權利要求I所述的維生素Cニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征在于上述小菌的選育過程為將處于對數生長期的大小菌混合種子液分離至平板培養，收集一定數量的小菌進行誘變，后涂布至平板，搭接大菌進行平板培養，培養結束后選取經誘變得到的小菌單菌落逐一分別涂布至平板，搭接大菌進行増殖培養，再逐一接斜面，搭接大菌進行斜面培養，最后搖瓶篩選目的菌株。
3.按照權利要求2所述的維生素Cニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征在于所述大小菌混合種子液是指將包含有大小菌混合菌的出發菌株儲存液接種至種子培養基中，在25-32°C下200r/min振蕩培養至對數生長期，其所用的種子培養基為L-山梨糖I. 5，玉米漿O. 3，蛋白胨O. 5，尿素O. 5，碳酸鈣O. 3，pH值為7. O，121°C，30min滅菌，單位g/100ml。
4.按照權利要求2所述的維生素Cニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征在于所述小菌誘變采用紫外燈照射誘變。
5.按照權利要求2所述的維生素Cニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征在于上述搭接大菌是指在已經涂布小菌的培養基上接種大菌。
6.按照權利要求2所述的維生素Cニ步發酵法中小菌的選育方法，其特征在于上述搖瓶篩選是指將斜面培養的菌種接種至發酵培養基中，在25-32°C下200r/min振蕩培養3 —4天，檢測發酵液中古龍酸含量及殘余L-山梨糖濃度，留種。
全文摘要
本發明涉及一種維生素C二步發酵法中小菌的選育方法，該方法是將處于對數生長期的種子液平板培養，選擇其中的小菌進行誘變后涂布至平板，搭接大菌進行平板培養，然后涂布至平板，搭接大菌進行增殖培養，再逐一接斜面，搭接大菌進行斜面培養，搖瓶篩選目的菌株。本發明將經誘變后的小菌單菌落，采用增殖培養的方法進行篩選，使具有各類特性的菌株性能一一得到體現，成功地淘汰了非目的菌株而得到目的菌株，使獲得優良性能目的菌株的幾率得到提高。
文檔編號C12N15/01GK102851275SQ201210308418
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者李學兵, 郭惠芬, 陳荔, 楊玉芳, 蔣鴻 申請人:寧夏啟元藥業有限公司