專利名稱：一種簡單快速的肉鴨糞樣總dna提取方法
技術領域：
本發明屬于動物醫學領域，特別涉及動物糞便中DNA的提取方法。
背景技術：
動物腸道中存在約30個屬500多種不同的細菌，約I X IOltl個活細菌，形成了復雜而動態平衡的微生態系統，動物胃腸道內龐大多樣的微生物群落與動物的健康和疾病有密切的聯系，對宿主營養物質的消化、吸收及免疫機制激活、生長發育等都起著十分重要的作用。若這種微生態平衡失調，則動物機體正常的生理功能就會發生紊亂，導致疾病的發生、流行，對畜牧養殖業尤其是規模化養殖產生了極大的潛在威脅。因而，近年來對腸道微生物區系結構及其多祥性研究成為當前的熱點，但由于腸道的特殊生存環境，使得腸道中
有60% -80%的微生物目前無法用傳統的分離培養技術進行研究，從而阻礙了人們對腸道微生物結構及其多祥性的客觀認識。迄今為止，腸道中只有極少部分微生物可以被培養，絕大多數還不為人所知。隨著分子生物學和細胞生物學技術的發展，腸道微生物的研究也深入到了基因和作用機制水平，人們能避開了傳統菌的群分離培養過程，直接從DNA水平上對這些腸道菌群進行相關研究，從糞便樣品中提取高質量的、具有代表性的腸道菌群總DNA是腸道微生物生態學研究的基礎。但由于糞便不但組成成分復雜(含有多聚糖、膽酸、膽鹽、膽色素、腐殖質、動物腸道脫落細胞及碎片、各種無機物和有機物等PCR的強抑制物)，而且糞便中細菌類型數目繁多，而不同細菌因其各自獨特的細胞壁成分和結構，又對不同的提取方法的敏感程度有所差異，從而導致了不同方法的提取效率不盡相同，進而使得腸道菌群多祥性分析結果不盡如人意，甚至造成偏差。目前糞便樣品總DNA并沒有標準、統ー的提取方法，因而，選擇較好的DNA提取方法對腸道微生態研究非常關鍵。目前，國內外常用的DNA提取方法主要包括機械法，如硅珠法、凍融法等；化學法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商業試劑盒法。這幾種類型的DNA提取方法中，機械法、化學法及酶或其組合方法是實驗室常規提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超聲波或反復凍融來裂解細胞釋放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、_■氧化娃等進行DNA的抽提，最后無水こ醇沉淀。這幾種常規的提取方法的優點是原理清楚，便于分析及查找實驗中出現的問題，而不足在于所提取的DNA純度不高或者得率較低，常含有大量的PCR抑制物，除腸道菌基因組外，還摻雜動物細胞、食物殘渣的基因組DNA及雜質，純度不夠理想，需要進ー步純化處理才能用于后續的實驗操作，如用蛋白酶K裂解糞便的同時還另外用十六烷基三甲基溴化銨來除去PCR反應抑制物，并且還用酚-氯仿進行了多次的抽提才得到較高純度的總DNA ；在用蛋白酶K提取糞便樣品總DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子來純化所得到的總DNA。試劑盒法雖然操作簡單、快捷、效率高，但所提總DNA濃度、得率低，價格較昂貴、處理大批樣品的科研成本太高，缺乏實驗室通用性，不適于用于大規模糞便樣品總DNA提取。另外由于專利等其它原因，試劑盒中具體成分及其含量不是很清楚，如果發生操作失敗，很難分析找出實驗失敗原因。因此，需要找到ー種新得能快速、高質、高效、廉價及無害提取具有代表性的腸道菌群總DNA的方法。
發明內容
本發明的目的之ー在于提供肉鴨糞樣總DNA提取方法，操作簡單、快速、高效、高質且價格經濟能適于實驗室大規模提取的新方法。本發明主要包括糞便樣品的預處理、樣品DNA提取、PCR及電泳。以采集新鮮糞便樣品或凍存的糞便樣品為材料，先用PBS緩沖液等對糞便樣品進行預處理，以獲得糞便樣品菌懸液，再以20-50 μ I的Clelex-100和30 μ L的O. 15molEDTA溶液組成的混合液，共同裂解細胞釋放DNA。為實現上述技術目的，本發明的技術方案為一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，具體包括以下步驟A預處理將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡不少于5分鐘后，充分震蕩均勻，得肉鴨糞樣混懸液；將肉鴨糞便混懸液通過離心處理，去除雜質并收集沉淀物I ;離心時，可將細菌沉淀于Eppendorf管中，并通過重復離心，收集細菌沉淀I入滅菌的離心管中；B 洗滌在步驟A所得沉淀物I中加入緩沖液，離心并去除上清液，重復離心處理至上清液無異色，得沉淀物II;C 提取在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復性；再次離心，取上清液III，所述上清液 III。進ー步，在步驟A中，將肉鴨糞樣用相當于其體積10倍的PBS溶液浸泡15分鐘。進ー步，在步驟A中，離心處理的條件為4°C，10000轉/分鐘，離心至少6分鐘。進ー步，在步驟B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I與PBS溶液的添加比例為每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。進ー步，在步驟B中，離心處理的條件為10000轉/分鐘離心至少3分鐘。進ー步，在步驟C中，在沉淀物II中加入與步驟B所述緩沖溶液等量的蒸餾水，重懸并離心，離心條件為10000轉/分鐘離心不少于3分鐘。進ー步，在步驟C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的體積比3 2，所述蛋白酶K的初始濃度為20mg/ml，所述EDTA溶液的初始濃度為O. 15moL。進ー步，在步驟C中，所述初次離心的條件是4°C，12000轉/分鐘離心10分鐘。進ー步，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的體積比為3 2，所述沉淀物II與所述蛋白酶K的體積比為I 10-20 ;所述裂解液為Clelex-100，Clelex-100與EDTA溶液的體積比為20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的體積比為I 10-20，所述EDTA溶液的濃度為O. 15mol/L，所述蛋白酶K的濃度為20mg/mL。進一歩，將步驟C所得上清液III中DNA為模板，其上游引物為5’ -aacgcgaagaaccttac-3’，其下游引物為5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，PCR 的反應條件預變性，94°C，5min ;變性，94°C 45s ;退火，56°C 45s ;延伸，72°C 45s，循壞 33 次；最后 72°C延伸IOrnin0本發明已進行了廣泛的比較研究，通過分析所得糞便總DNA的濃度、純度、得率及16SrDNA全長擴增結果表明，本發明所得的DNA片段較完整、大小約為500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴增的模板，以及糞便微生態學等方面的研究。本發明簡單方便，產量、得率和濃度及純度高且價格便宜。
圖I為本發明提取的DNA電泳檢測圖圖中編號1-3為重復3次平行提取的糞便總DNA ;編號4-6為常規酚氯仿法提取的糞便總DNA ;編號7-9為試劑盒法提取的糞便總DNA ；編號10為標準品；上樣量均為5 μし其中M為Marker DL-2000,分子量標準從下至上依次為 IOObp,250bp,500bp,750bp,IOOObp,2000bp。
具體實施例方式本發明方法提取肉鴨糞便樣品總DNA。實驗所用樣品為采集的麻鴨的糞便，所采集的糞便樣品于_20°C下保存，備用。實施例II預處理稱取備用的糞便樣于ー無菌的離心管A中，用10倍體積的PBS浸泡15分鐘；在實踐操作中，浸泡時間在不少于5分鐘，或用其它緩沖液替代PBS，均可實現除雜質及離心分離的功能。浸泡完成后，于漩渦振蕩器上振蕩混勻，充分懸浮清洗菌體；混勻的懸液于4°C，500轉/分鐘后，離心10分鐘，去除粗顆粒(低速離心的目的在于去除糞便中的粗顆粒，除了離心之外，也可以采用如過濾等其它方式去除粗顆粒雜質)，將去除粗顆粒后的液體于另ー只50mL滅菌離心管內B中；之后，4°C，10000轉/分鐘，離心6分鐘，收集沉淀物I于Eppendorf管中。通過重復離心，從保存的糞便樣品中轉移200-300mg離心后的細菌沉淀入2mL滅菌的離心管中。2 洗滌 在所得沉淀物I加入ImL PBS,振蕩15秒混勻，10000轉/分，離心3分鐘，傾去上清，得沉淀物II。重復此步驟至上清無異色。在沉淀物I中添加其它的緩沖溶液并通過其它離心條件也可達到對沉淀物的洗滌作用。在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復性；再次離心，取上清液III，所述上清液 III。3 提取在沉淀物II中加入ImL雙蒸水，振蕩混勻，10000轉/分鐘離心3分鐘，傾去上清，重復此步驟I次；取出離心管，10000轉/分鐘離心5分鐘后，吸取上清液II 450 μ L至另ー 2mL離心管中；加入30 μ L初始濃度為O. 15moL的EDTA溶液，20 μ L蛋白酶K(初始濃度為20mg/mL)(蛋白酶K和沉淀物II的體積比為10-20 I的范圍內均可實現)，振蕩混勻，55°C水浴消化，經實驗證實，O. 15-1小時均可實現水浴消化的效果；4°C，12000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清，得沉淀III，沉淀III可用于總DNA的提取；在沉淀III中加裂解液Clelex-100 (20-50 μ L均可，裂解液Clelex-100與沉淀III的體積比為10-20 I的范圍內均可實現，優選15 I)，和30 μ L初始濃度為O. 15moL的EDTA溶液，浸沒沉淀III。置于冰上3分鐘，使DNA復性。離心2分鐘，取上清，-20°C保存。測DNA含量備用。申請人:用本發明對同一肉鴨糞便樣品進行了 3次的重復提取實驗，如圖I所示，結果表明本發明方法的多次重復提取的實驗效果基本一致，這說明該發明方法非常地穩定，適用于肉鴨糞便總DNA的大規模提取。實施例2對實施例I提取的DNA進行16SrDNA的PCR擴增檢測。應用本實施例2提 取的 DNA 作為模板，以設計的引物U968f :5’ -aacgcgaagaaccttac-3 和 L1401r 5’ -gcgtgtgtacaagaccc-3’，擴增糞便微生物16SrDNA V3區。利用常規方法、試劑盒法和本發明的方法制備的糞便總DNA IyL作PCR反應的模板，分別擴增糞便微生物的16SrDNAV3區。50 μ L PCR反應體系組成如下
權利要求
1.一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，具體包括以下步驟 A預處理 將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡不少于5分鐘后，充分震蕩均勻，得肉鴨糞樣混懸液，將肉鴨糞便混懸液通過離心處理,去除雜質并收集沉淀物I ; B洗滌 在步驟A所得沉淀物I中加入緩沖液，離心并去除上清液，重復離心處理至上清液無異色，得沉淀物II ； C提取 在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA溶液的混 合液振蕩混勻，45-60°C水浴9-60分鐘；初次離心，棄上清液，得沉淀III ;在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復性；再次離心，取上清液III，所述上清液111中含有總DNA。
2.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟A中，將肉鴨糞樣用相當于其體積10倍的PBS溶液浸泡15分鐘。
3.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟A中，離心處理的條件為4°C，10000轉/分鐘，離心至少6分鐘。
4.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟B中，在所述沉淀物I中加入PBS溶液，沉淀物I與PBS溶液的添加比例為每200-300mg沉淀物I添加ImLPBS溶液。
5.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟B中，離心處理的條件為10000轉/分鐘離心至少3分鐘。
6.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，在沉淀物II中加入與步驟B所述緩沖溶液等量的蒸餾水，重懸并離心，離心條件為10000轉/分鐘離心不少于3分鐘。
7.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述混合液中蛋白酶K和EDTA溶液的體積比3 2，所述蛋白酶K的初始濃度為20mg/ml，所述EDTA溶液的初始濃度為0. 15moL。
8.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述初次離心的條件是4°C，12000轉/分鐘離心10分鐘。
9.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，在步驟C中，所述蛋白酶K和所述EDTA溶液的體積比為3 2，所述沉淀物II與所述蛋白酶K的體積比為I 10-20 ;所述裂解液為Clelex-100, Clelex-IOO與EDTA溶液的體積比為20-50 30，所述沉淀III和所述Clelex-100的體積比為I 10-20，所述EDTA溶液的濃度為0. 15mol/L，所述蛋白酶K的濃度為20mg/mL。
10.根據權利要求I所述的一種簡單快速的肉鴨糞樣總DNA提取方法，其特征在于，將步驟C所得上清液III中DNA為模板進行PCR擴增，其上游引物為.5，_aacgcgaagaaccttac_3，，弓 1. :5，_gcgtgtgtacaagaccc_3，。
全文摘要
本發明屬于動物醫學領域，特別涉及動物糞便中DNA的提取方法，具體為將肉鴨糞樣用緩沖液浸泡并震蕩均勻，去除雜質，收集沉淀物I，加入緩沖液，離心并去除上清液，離心處理至上清液無異色，得沉淀物II；在沉淀物II中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液II，加入蛋白酶K和EDTA混合液振蕩混勻水浴；離心，棄上清液，得沉淀III；在沉淀III中加裂解液和EDTA的混合液，并在低溫下使DNA復性；離心取上清液III，所述上清液III中含有總DNA；本發明所得的DNA片段較完整、大小約為500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴增的模板，以及糞便微生態學等方面的研究。本發明簡單方便，產量、得率和濃度及純度高且價格便宜。
文檔編號C12N15/10GK102851277SQ20121033008
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者楊金龍, 劉作華, 黃勇, 付利芝, 彭祥偉, 鄭華, 沈克飛, 楊睿, 張素輝 申請人:重慶市畜牧科學院