快速檢測沙門氏菌的lamp試劑盒的制作方法

專利名稱：快速檢測沙門氏菌的lamp試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測沙門氏菌(Salmonella)的LAMP試劑盒,屬于食品檢測領域。
背景技術：
沙門氏菌屬(Salmonella)是引起細菌性食物中毒的重要病原體之一，也是腸桿菌科中最復雜的菌屬，屬革蘭氏陰性菌。目前全世界已分離出2523個血清型，我國已發現216個。沙門氏菌的多種血清型可以引起中毒，以腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌最常見。沙門氏菌中毒的癥狀主要由急性腸胃炎為主，潛伏期一般為四至四十八小時，短期是數小時，長期是兩天至三天，前期癥狀有惡心、頭疼，全身乏力和發冷等，主要癥狀有嘔吐、腹瀉、腹疼，糞便以黃綠色水樣便，有時帶膿血和黏液，一般發熱的溫度在三 十八攝氏度至四十攝氏度，重病人出現打寒戰、驚厥、抽搐和昏迷的癥狀。近年來發展起來的環介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因定性檢測方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸定性檢測的重要方法之一。環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術是一種新型等溫核酸擴增方法，該法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結果及反應時間短，特異性強，靈敏度高等優點。傳統檢測沙門氏菌的培養方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時還需要血清學鑒定，一般為4 6d，費時費力，具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費力等缺點。各種常規PCR方法具有敏感性強、特異性高、簡便、快速等優點，有較多應用于沙門氏菌檢測的報道，但由于存在PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題以及需要特殊的儀器設備而限制了其在基層單位的應用。因此隳待開發精確、靈敏、快速、無污染的臨床檢驗方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的不足，提供一種快速檢測沙門氏菌的LAMP試劑盒及其使用方法。為達到上述目的，本發明采用以下技術方案一種快速檢測沙門氏菌的LAMP試劑盒，該試劑盒包括a) LAMP反應液，b)標準陽性模板，c)陰性質控標準品；LAMP反應液含有引物，引物為以下6組特異性引物中的任意一組(I)上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3' ；(SEQ ID No. 2)上游內引物FIP:
5' -ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3' ；(SEQ ID No. 3)下游內引物BIP:5' -GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA-3' ；(SEQ IDNo. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游內引物FIP :5 ' -GCGCAGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAGAT-3 '；(SEQ IDNo. 7)下游內引物BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3' ; (SEQ ID
No. 8) (3)上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3' ; (SEQ ID No. 9)下游外引物B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3' ; (SEQ ID No. 10)上游內引物FIP# -GCGCAGCATCCGCATCAATAATATGCCCGGTAAACAGATGAG-3' ；(SEQ ID No. 11)下游內引物BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3' ; (SEQ IDNo. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3' ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -GCGGAGGACAAATCCATACC-3' ; (SEQ ID No. 14)上游內引物FIP :5'-CAGTACGCTTCGCCGTTCGCTTGATGCCGATTTGAAGGCC-3' ；(SEQ ID No. 15)下游內引物BIP:5' -GGTGACGCTATTGCCGGCATCCACCGAAATACCGCCAAT-3' ；(SEQ IDNo. 16)(5)上游外引物 F3 :5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3' ; (SEQ ID No. 17)下游外引物B3 :5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3' ; (SEQ ID No. 18)上游內引物FIP 5 ' -GGCTTTCCCTTTCCAGTACGCTAGGCCGGTATTATTGATGCG-3 '；(SEQ IDNo. 19)下游內引物BIP:5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3' ；(SEQ IDNo. 20)(6 )上游外引物 F3 :5' -AGGCCGGTATTATTGATGCG-3' ; (SEQ ID No. 21)下游外引物B3 :5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3' ; (SEQ ID No. 22)上游內引物FIP : 5 ' -ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAGAACGGCGAAGCGTACTG-3 ' ; (SEQID No. 23)下游內引物BIP:5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3' ；(SEQ IDNo. 24)具體地說，a) LAMP 反應液LAMP反應液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的內引物、5mol/L 甜菜喊、50mmol/L MgSO4 和 10mmol /T, dNTPs 組成。在本發明的一個具體方案中，LAMP反應液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 內弓 I 物 FIP、BIP 各 2· O μ 1，10 μ mol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，IOmmoI/LdNTPs3. Ομ I, 50mmol/L MgSO4 3· O μ 1，5. Omol/L 甜菜堿 4· 5 μ 1，Bst DNA 聚合酶大片段
I.O μ I組成,反應液總體積20 μ I。b)標準陽性模板標準陽性模板是含有沙門氏菌高度保守基因invA基因317個堿基對的核苷酸片段構成的pMD18-T-invA載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。invA基因的核苷酸序列為5 ' -CAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATG GATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTTA-3' (SEQ ID No. 25)實驗所用的標準品為含有目的擴增片段的質粒pMD18-T_invA，該質粒轉化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，_20°C保存。c)陰性質控標準品陰性質控標準品為無菌雙蒸水。本試劑盒的工作原理使用本發明提供的快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒，在恒溫條件下(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，并伴隨產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀。反應結束后，12000r/min離心30s，即可用肉眼觀察管底白色沉淀。在本發明提供的快速檢測沙門氏菌LAMP試劑盒中，針對沙門氏菌檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物、dNTPs、Mg2+濃度、甜菜堿等的優化，通過優化方案，反復實驗，建立了檢測沙門氏菌的環介導等溫擴增方法，并研制出檢測沙門氏菌的LAMP試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測沙門氏菌的要求。使用本發明的LAMP試劑盒檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟a)用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國標法培養待檢樣品l_4h ； b)用水煮法從待測樣品中提取DNA ；c)取b)步中的樣品DNA加入到LAMP試劑盒的反應液中，65°C保溫Ih ;同時用標準陽性模板和陰性質控標準品分別做陽性對照和陰性對照；d)反應結束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析。本發明提供的快速檢測沙門氏菌LAMP試劑盒可對沙門氏菌進行定性檢測，并可替代一直沿用的傳統的培養法和血清法檢測方法。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果I、與傳統培養法相比，檢測速度快，僅lh，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過5h。2、特異性好，靈敏度高；3、步驟簡單，可重復性高；4、可同時進行多個樣品檢測。


圖I為實施例I中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I 一標準陽性模板， 2—陰性對照，3—沙門氏菌陽性樣本，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖2為實施例I中沙門氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖，圖中I—DNA Marker,2一標準陽性模板， 3—陰性對照，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陽性樣本， 7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本，9 一沙門氏菌陰性樣本；圖3為實施例2中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I 一標準陽性模板， 2—陰性對照，3—沙門氏菌陽性樣本，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖4為實施例3中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I 一標準陽性模板， 2—陰性對照，3—沙門氏菌陽性樣本，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖5為實施例4中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I 一標準陽性模板， 2—陰性對照，3—沙門氏菌陽性樣本，4—沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖6為實施例5中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I 一標準陽性模板， 2—陰性對照，3—沙門氏菌陽性樣本，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖7為實施例6中沙門氏菌離心后觀察白色沉淀結果，圖中I-標準陽性模板，2-陰性對照，3-沙門氏菌陽性樣本，4一沙門氏菌陽性樣本，5—沙門氏菌陽性樣本，6—沙門氏菌陰性樣本，7—沙門氏菌陰性樣本，8—沙門氏菌陰性樣本；圖8為實施例7中沙門氏菌LAMP試劑盒特異性實驗觀察白色沉淀結果，圖中I一標準陽性模板， 2—陰性對照， 3—甲型副傷寒沙門氏菌，4一乙型副傷寒沙門氏菌，5—腸炎沙門氏菌，6—豬霍亂沙門氏菌，7—痢疾志賀氏菌，8—金黃色葡萄球菌；圖9為實施例8中沙門氏菌LAMP試劑盒靈敏度實驗觀察白色沉淀結果，圖中I一稀釋10 1倍，2一稀釋10 2倍，3一稀釋10 3倍，4一稀釋10 4倍，5一稀釋10 5倍，6一稀釋10 6倍，7一稀釋10 7倍，8一稀釋10 8倍，9一稀釋10 9倍，10—稀釋 10 10 倍。
具體實施方式
下面結合具體實施實例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D. L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實施例I :I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，試劑組成a) LAMP反應混合液LAMP 反應混合液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 內引物 FIP、BIP各 2.0 μ 1，10 μ mol/L 夕卜弓 I 物 F3、B3 各 I. O μ 1，10mmol/L dNTPs 3· O μ 1，50mmol/LMgS043. Ομ 1,5. Omol/L甜菜堿4· 5 μ I，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I組成，反應液總體積20 μ I。 其中引物序列如下上游外引物F3:5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；下游外引物B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'；上游內引物FIP :5' -ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3'；下游內引物BIP :5' -GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA-3'；b)標準陽性模板標準陽性模板pMD18-T-invA是含有沙門氏菌高度保守基因invA基因317個堿基對的核苷酸片段構成的pMD18-T-invA載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α中增殖。實驗所用的標準品為含有目的擴增片段的質粒pMD18-T-invA，該質粒轉化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，-20°C保存。c)陰性質控標準品陰性質控標準品為無菌雙蒸水。2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟a、食物樣品預處理取3份經傳統培養法鑒定的沙門氏菌陽性食品，3份沙門氏菌陰性食品，分別稱取25g (mL)樣品放入盛有225mL BPff的無菌均質杯中，以8000r/min 10000r/min均質Imin 2min,或置于盛有225mL BPff的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打Imin 2min。若樣品為液態,不需要均質,振蕩混勻即可。無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養，于36°C ±1°C培養l_4h。如為冷凍產品，應在450C以下不超過15min解凍。b、細菌模板DNA的制備分別取10(^1^細菌培養物，120001'/11^11離心21^11，去上清，加入50 μ L無菌水,充分混勻，100°C水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板
DNA。c、LAMP反應分別取5μ I b)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應液中，65°C恒溫擴增60min。同時用標準陽性模板和陰性質控標準品分別做陽性對照和陰性對照。d、結果判定待反應結束后12000r/min離心30S，觀察有無沉淀產生(見附圖I)。取5 μ I LAMP產物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本都有條帶，陰性樣本則無條帶(見附圖2)。附圖I為離心后觀察白色沉淀結果，附圖2為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。e、結論反復重復試驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀或電泳條帶，對照組均無沉淀或電泳條帶，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，沉淀觀察法與電泳檢測法效果一致，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例2:I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；下游外引物B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'；
上游內引物FIP :5' -GCGCAGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAGAT-3'；下游內引物BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3'；2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法與實施例I所述方法完全相同，反復重復試驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀，對照組均無沉淀(見附圖3)，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例3:I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；下游外引物B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'；上游內引物FIP :5' -GCGCAGCATCCGCATCAATAATATGCCCGGTAAACAGATGAG-3'；下游內引物BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3'；2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法與實施例I所述方法完全相同，反復重復試驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀，對照組均無沉淀(見附圖4)，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例4: I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3'；下游外引物B3:5' -GCGGAGGACAAATCCATACC-3'；上游內引物FIP :5' -CAGTACGCTTCGCCGTTCGCTTGATGCCGATTTGAAGGCC-3'；下游內引物BIP :5' -GGTGACGCTATTGCCGGCATCCACCGAAATACCGCCAAT-3'；2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法與實施例I所述方法完全相同，反復重復試驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀，對照組均無沉淀(見附圖5)，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例5:
I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3'；下游外引物B3:5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3'；上游內引物FIP :5' -GGCTTTCCCTTTCCAGTACGCTAGGCCGGTATTATTGATGCG-3'；下游內引物BIP :5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3'；2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法與實施例I所述方法完全相同，反復重復試 驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀，對照組均無沉淀(見附圖6)，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例6:I.新型快速可視化檢測沙門氏菌LAMP試劑盒組成與配制，與實施例I所述試劑盒的不同之處在于特異性引物序列不同，本試劑盒的引物序列如下上游外引物F3:5' -AGGCCGGTATTATTGATGCG-3'；下游外引物B3 :5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3'；上游內引物FIP :5' -ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAGAACGGCGAAGCGTACTG-3'；下游內引物BIP :5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3'；2.使用所述基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法與實施例I所述方法完全相同，反復重復試驗3次，所得檢測結果相同，實驗組均有沉淀，對照組均無沉淀(見附圖7)，與預期結果一致。說明本試劑盒檢測沙門氏菌效果良好，并且不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。實施例7 :基于環介導等溫擴增技術快速檢測工業食品中致病沙門氏菌的PCR試劑盒的特異性實驗a、DNA模板的制備分別取經過DNA有效性驗證的甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的菌液10 μ I，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無菌水，充分混勻，100 V水浴IOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。b、LAMP反應取5 μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應液中，65°C恒溫擴增60min。同時用標準陽性模板和陰性質控標準品分別做陽性對照和陰性對照。C、結果判定待反應結束后12000r/min離心30S，觀察有無沉淀產生(見附圖8)。附圖8為沙門氏菌LAMP試劑盒特異性實驗觀察白色沉淀結果。d、結論結果顯示只有陽性標準品、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌有白色沉淀，而痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和陰性對照沒有白色沉淀。上述實驗說明本試劑盒具有良好的特異性。實施例8 :快速檢測沙門氏菌LAMP試劑盒靈敏度實驗a、取Iml過夜培養的沙門氏菌培養液做10倍倍比稀釋，稀釋至10_9。取每個稀釋度的菌液10 μ 1,12000r/min離心2min,去上清,加入50 μ L無菌水，充分混勻，100°C水浴IOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。
b、LAMP反應取5 μ I a)步中樣本上清加入到20 μ I LAMP反應液中，65°C恒溫擴增 60min。C、結果判定反應結束后，12000r/min離心30s觀察管底是否產生白色沉淀，結果顯示KT1-KT8樣本管底均有白色沉淀，10_9-10_1(1樣本管底則沒有白色沉淀(見附圖9)。附圖9為沙門氏菌LAMP試劑盒靈敏度實驗觀察白色沉淀結果。d、結論結果顯示當菌液稀釋至10_8時仍能檢測出，最低檢測極限為50CFU/ml。上述實驗說明本試劑盒具有良好的靈敏度。從上述實例可以說明，LAMP檢測方法特異性好，靈敏度高，重復性好，操作簡便，而且LAMP檢測試劑盒對樣品的檢測僅需不到5個小時就能完成，而傳統的培養法約需I周左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。
該試劑盒的操作只需I人即可完成整個操作過程，一次可檢測多個(由實際檢測需要決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權利要求
1.ー種快速檢測沙門氏菌的LAMP試劑盒，其特征在于，由LAMP反應液、標準陽性模板、陰性質控標準品組成；LAMP反應液含有引物，引物為以下6組特異性引物中的任意ー組 (I)上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'； 下游外引物 B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'； 上游內引物FIP 5' -ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3'； 下游內引物 BIP :5' -GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA-3'； (2 )上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；下游外引物 B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'； 上游內引物 FIP : 5' -GCGCAGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAGAT-3'； 下游內引物 BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3'； (3 )上游外引物 F3 :5' -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'； 下游外引物 B3 :5' -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'； 上游內引物 FIP : 5' -GCGCAGCATCCGCATCAATAATATGCCCGGTAAACAGATGAG-3'； 下游內引物 BIP :5' -GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3'； (4 )上游外引物 F3 :5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3'； 下游外引物 B3 :5' -GCGGAGGACAAATCCATACC-3'； 上游內引物 FIP : 5' -CAGTACGCTTCGCCGTTCGCTTGATGCCGATTTGAAGGCC-3'； 下游內引物 BIP :5' -GGTGACGCTATTGCCGGCATCCACCGAAATACCGCCAAT-3'； (5 )上游外引物 F3 :5' -TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3'； 下游外引物 B3 :5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3'； 上游內引物 FIP : 5' -GGCTTTCCCTTTCCAGTACGCTAGGCCGGTATTATTGATGCG-3'； 下游內引物 BIP :5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3'； (6 )上游外引物 F3 :5' -AGGCCGGTATTATTGATGCG-3'； 下游外引物 B3 :5' -AGCGGAGGACAAATCCATAC-3'； 上游內引物 FIP : 5' -ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAGAACGGCGAAGCGTACTG-3'； 下游內引物 BIP :5' -AAGGTGACGCTATTGCCGGCCCACCGAAATACCGCCAAT-3'。
2.根據權利要求I所述的PCR試劑盒，其特征是，LAMP反應液由BstDNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L 的外引物、10 μ mol/L 的內引物、5mol/L 舌甘菜喊、50mmol/LMgSO4 和 10mmol/L dNTPs 組成。
3.根據權利要求I或2所述的PCR試劑盒，其特征是，標準陽性模板是含有沙門氏菌高度保守基因invA基因317個堿基對的核苷酸片段構成的pMD18-T_invA載體，invA基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 25所示。
4.使用權利要求I 3所述的LAMP試劑盒檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 ①用緩沖蛋白胨水按照國標法培養待檢樣品4h； ②用水煮法從待測樣品中提取DNA； ③將DNA加入到LAMP試劑盒的反應體系中，65°C保溫Ih;同時用標準陽性模板和陰性質控標準品分別做陽性對照和陰性對照；④反應結束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性 分析。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測沙門氏菌的LAMP試劑盒，由LAMP反應液、標準陽性模板、陰性質控標準品組成；LAMP反應液含有Bst DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜堿。引物分為正向引物和反向引物。本發明具有特異性好，靈敏度高，快速簡便，可重復性高以及肉眼可判斷結果等優點，可對工業食品中致病沙門氏菌進行快速定性檢測，并可替代一直沿用的傳統的培養法和血清學診斷方法。
文檔編號C12Q1/68GK102851383SQ20121035560
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者王業富, 鄭虎, 盧晅 申請人:武漢真福醫藥科技發展有限公司