專利名稱：一種高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人臍帶血間充質干細胞高效分離及培養的方法。
背景技術：
干細胞是指生物體內能夠進行自我更新，并維持機體各組織細胞新陳代謝的一群細胞。同時，在生物體內各種組織受到內源或外源性的損害時，干細胞可以被激活執行分化功能，從而達到修復該組織的目的。間充質干細胞在適當的條件下，具有強大的增值能力和分化能力，能夠修復多種組織損傷，包括骨骼，肌肉，神經等組織，因此，間充質干細胞在再生醫學治療領域引起了越來越多的重視。骨髓當中含有豐富的間充質干細胞，因此得到了最為廣泛和深入的研究.研究證 實，骨髓間充質干細胞表達特定的表面抗原表型，比如，⑶45_，⑶34_，⑶29+，⑶90+，⑶73+和CD105+。在體外和體內環境中可向骨骼，軟骨，神經以及胰島等細胞分化。另外，骨髓間充質干細胞具有免疫調節的功能，分泌多種免疫相關信號分子，從而在免疫性疾病治療過程中發揮作用。但是，盡管骨髓間充質干細胞細胞較易分離和培養，但是，骨髓來源有限，難以滿足臨床大量的需求.即便是進行病人的自體移植，患者也必須承擔額外的痛苦。在其他組織，比如肌肉，脂肪，腦以及臍帶血等其它組織也能分離獲得間充質干細胞。這些細胞有與骨髓間充質干細胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去臍帶血外，應用其他組織的間充干細胞面臨著和應用骨髓間充質干細胞相同的問題，及樣品稀缺，不足以滿足臨場需求。臍帶血是指早產或正常分娩嬰兒臍帶內的血液。已經證實，臍帶血種含有活性很強的干細胞群，包括造血干細胞和間充質干細胞。臍帶血中的間充質干細胞與骨髓干細胞相似，有著相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文獻表明，臍帶血干細胞有著更原始的干細胞特性和更低的免疫原性。同時,應用臍帶血治療糖尿病,神經損傷以及血管壞死等疾病也屢見報道。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法，通過獲取臍帶血，利用特定的細胞粘附蛋白而不是使用成分難以確定的細胞外基質，對其中的間充質干細胞進行分離純化，并配合適當的培養基，實驗對臍帶血的高效擴增。技術方案本發明的高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法具體為a.收集臍帶血樣品所述臍帶血樣品自醫院采集，或自臍帶血庫中獲取的人臍帶血樣品，在無菌條件下獲取正常或早產胎兒的臍帶血，肝素抗凝；b.分離臍帶血中單核細胞成分所述臍帶血血樣品均應經過肝素抗凝，羥甲基纖維素裂解紅細胞，密度梯度離心獲取單核細胞成分之后進行接種；臍帶血間充質干細胞的分離純化過程在分娩后24小時內進行；c.將單核細胞成分接種于包被蛋白基質成分的培養皿包被蛋白基質指層連蛋白和明膠蛋白按體積比I :2混合；d.分離間充質干細胞細胞接種于上述包被的細胞培養板后，使用臍帶血間充質干細胞培養基培養，及時除去未貼壁細胞并更換培養基，此時，臍帶血間充質干細胞得到分離；e.培養和擴增間充質干細胞繼續使用臍帶血間充質干細胞培養基培養，每5-8天換液一次，直至細胞為80-95%融合；細胞用胰酶進行消化，接種于一般培養板，使用臍帶血間充質干細胞培養基繼續培養，2-4天換液一次，直至融合，并進行下一次傳代，實現間充質干細胞的擴增。其中所述臍帶血間充質干細胞培養基其中包括a -MEM, Pen-Strep,b-FGF, EGF, TGF- β ;其中，a -MEM為α -最小必需極限培養基；Pen_Strep為青霉素-鏈霉素，b-FGF為b-成纖維細胞生長因子，EGF為表皮細胞生長因子，TGF-β為轉化生長因子。 該方法包括首先使用同體積a -MEM稀釋抗凝過的臍帶血，與4_6g/L的甲基纖維素按體積比4:1混合，靜置20-40分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心后，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度在1-1. I范圍的淋巴細胞分離液上，在2000-3000轉/分鐘離心15-30分鐘，取界面層，加PBS制成單細胞懸液，離心洗滌。將細胞加入用層連蛋白和明膠蛋白包被的細胞培養板上；細胞在a-MEM中培養，該培養基中含有Pen-Strep，b-FGF, EGF, TGF-β添加成分，細胞達到80-95%融合時，進行傳代；傳代時，使用普通培養皿，并在上述含有添加成分的培養基中進行細胞的擴增。有益效果本發明使用了成分確定的包被成分對細胞培養板進行包被，有效提高了分離的純度和效率。在a-MEM中添加b-FGF，EGF，TGF-β等細胞因子能夠穩定的維持干細胞生長，能夠實現臍帶血間充質干細胞的大量擴增，從而完成了本發明。
通過下面結合附圖的詳細闡述，本發明前述以及其它目的、特征和優點將變得顯而易見，其中圖I :為本發明培養臍帶血間充質干細胞20天后的結果。
具體實施例方式具體而言，為達到本發明所述目的，本發明提出相同濃度的層連蛋白和明膠蛋白按照1:2的體積比混合，可以比較好的分離和純化臍帶血中的間充質干細胞，從而既提高了分離純化效率，也避免了使用化學成分極其復雜的細胞外基質。同時，本發明使用含有a -MEM, Pen-Strep, b-FGF, EGF, TGF-β的培養基，在前期可以配合包被蛋白(層連蛋白和明膠蛋白)維持原代細胞的活性，在后期可以高效擴增臍帶血間充質干細胞。本發明所述的分離和擴增臍帶血間充質干細胞的主要步驟如下在無菌條件下獲取正常或早產胎兒的臍帶血，25_200ml，肝素抗凝。臍帶血間充質干細胞的分離純化過程在分娩后24小時內進行。首先，使用同體積a -MEM稀釋抗凝過的臍帶血，與5g/L的甲基纖維素按4:1混合，靜置30分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心后，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度I. 077的淋巴細胞分離液上，2500rpm離心20min，取界面層，加PBS制成單細胞懸液，離心洗滌。將細胞加入用層連蛋白和明膠蛋白包被的細胞培養板上。細胞在a-MEM中培養，該培養基中含有Pen-Str印，b-FGF, EGF, TGF- β等添加成分。細胞達到90%融合時，進行傳代。傳代時，使用普通培養皿，并在上述含有添加成分的培養基中進行細胞的擴增。現結合以下實例來更加詳細的描述本發明的用于臍帶血中間充質干細胞分離和擴增的方法。提供實例的目的僅在于示例性的闡述名發明，不能將其理解為是對本發明范圍和實質的限制。實施例I :包被細胞培養板將層連蛋白(Laminin;BDBioscience, CA)和明膠蛋白(Gelatin;BDBioscience, CA)按照說明分別稀釋2mg/ml.按照體積比1:2混合后,轉移到細胞培養板,室溫下放置I小時。在無菌環境下，可在4°C存3個月。實施例2 :分離和擴增臍帶血間充質干細胞 將在無菌條件下采集的臍帶血以體積比1:1與細胞在a -MEM混合稀釋，與5g/L的甲基纖維素按4:1混合，靜置30分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心后，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度I. 077的淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque上，2500rpm離心20min,取界面層，加PBS制成單細胞懸液，離心洗滌。因為Ficoll-Hypaque的比重為I. 077g/ml,其比單核細胞重但比紅細胞輕，因此可以將單核細胞與殘留的紅細胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細胞。將獲取的單核細胞用PBS稀釋，2000rpm，離心lOmin，去掉上清液，并加入新的PBS打散，稀釋。以同樣的條件再洗滌一次，可見沉積于離心管底部的細胞。隨后，使用添加10%胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基均勻打散收集到的細胞。臍帶血間充質干細胞培養基是指在添加l%Pen-Strep,50ng/ml b-FGF, IOng/mlEGF, 10ng/ml TGF-β等生長因子的a-MEM培養基。細胞打散后，接種于實施例I制備的細胞培養板，7天后更換培養基。洗滌培養板，除去未貼壁細胞。繼續使用添加10%胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，每7天換液一次，直至細胞接近90%融合。將90%融合細胞用胰酶進行消化，接種于一般培養板,使用10%胎牛血清的臍帶血間充質干細胞培養基培養，3天換液一次。直至融合，并進行下一次傳代。實施例3 :培養的間充質干下表的細胞表面抗原表征為了確定上述所的細胞具有間充質干細胞表面抗原的特征，使用FACs對細胞表面進行分析。結果顯示于表I。表I
權利要求
1.一種高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法，其特征在于該方法為 a.收集臍帶血樣品所述臍帶血樣品自醫院采集，或自臍帶血庫中獲取的人臍帶血樣品，在無菌條件下獲取正常或早產胎兒的臍帶血，肝素抗凝； b.分離臍帶血中單核細胞成分所述臍帶血血樣品均應經過肝素抗凝，羥甲基纖維素裂解紅細胞，密度梯度離心獲取單核細胞成分之后進行接種；臍帶血間充質干細胞的分離純化過程在分娩后24小時內進行； c.將單核細胞成分接種于包被蛋白基質成分的培養皿包被蛋白基質指層連蛋白和明膠蛋白按體積比1:2混合； d.分離間充質干細胞細胞接種于上述包被的細胞培養板后，使用臍帶血間充質干細胞培養基培養，及時除去未貼壁細胞并更換培養基，此時，臍帶血間充質干細胞得到分離； e.培養和擴增間充質干細胞繼續使用臍帶血間充質干細胞培養基培養，每5-8天換液一次，直至細胞為80-95%融合；細胞用胰酶進行消化，接種于一般培養板，使用臍帶血間充質干細胞培養基繼續培養，2-4天換液一次，直至融合，并進行下一次傳代，實現間充質干細胞的擴增。
2.根據權利要求I所述的高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法，其特征在于其中所述臍帶血間充質干細胞培養基其中包括α-MEM，Pen-Strep, b_FGF，EGF, TGF-β ；其中，a -MEM為a-最小必需極限培養基；Pen-Strep為青霉素-鏈霉素，b_FGF為b_成纖維細胞生長因子，EGF為表皮細胞生長因子，TGF-β為轉化生長因子。
3.根據權利要求I所述的高效分離和擴增人臍帶血間充質干細胞的方法，其特征在于該方法包括首先使用同體積a -MEM稀釋抗凝過的臍帶血，與4_6g/L的甲基纖維素按體積比4:1混合，靜置20-40分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心后，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度在1-1. I范圍的淋巴細胞分離液上，在2000-3000轉/分鐘離心15-30分鐘，取界面層，加PBS制成單細胞懸液，離心洗滌。將細胞加入用層連蛋白和明膠蛋白包被的細胞培養板上；細胞在a-MEM中培養，該培養基中含有Pen-Str印，b-FGF，EGF，TGF-β添加成分，細胞達到80-95%融合時，進行傳代；傳代時，使用普通培養皿，并在上述含有添加成分的培養基中進行細胞的擴增。
全文摘要
本發明涉及對在細胞治療中最為理想的臍帶血間充質干細胞進行高效分離擴增的方法。已經證明臍帶血中含有分化能力較高，免疫排斥反應較小的間充質干細胞。臍帶血銀行的建立為實現自體細胞移植提供基礎。但是，由于臍帶血中間充質干細胞含量極低(1×108個單核細胞中僅含有0.5-30個)，因此如何高效分離和擴增這些細胞成為了阻礙臍帶血間充質干細胞向臨床轉化的難題。目前，多利用該細胞在培養皿的吸附能力，對臍帶血間充質干細胞進行分離，但是成功率低，并且在擴增過程中難以保持干細胞特性。本發明包括利用蛋白成分對培養皿進行包被，配合添加多種生長因子的培養基，構建臍帶血間充質干細胞擴增環境，實現了該細胞的高效擴增和分離。
文檔編號C12N5/0775GK102876630SQ20121043752
公開日2013年1月16日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者孫博, 肖忠黨 申請人:東南大學