專利名稱：具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑的制備方法及合成阿糖胞苷單酯的微生物方法
技術領域：
本發明屬于生物催化劑領域，涉及一種具有高區域選擇性酰化反應的細胞催化劑的方法。
背景技術：
目前阿糖胞苷酯類衍生物的合成采用化學合成法或者離體酶法。為克服化學制備方法環境不友好、選擇性差、副產物多等缺點，自上個世紀末人們開始研究利用酶法進行核苷單酯的合成。然而，盡管酶法合成具有區域選擇性高、反應條件溫和、環境友好等優點，其在工業應用上卻遭遇成本高、催化劑穩定性差等諸多瓶頸問題。全細胞是生物催化劑的一種，作為酶的天然載體，可以省去酶分離純化及固定化等步驟，從而大大地降低生產成本。此外，整細胞可為酶提供良好的環境，使酶不至于在非水介質中快速失活。然而，迄今為止， 利用高區域選擇性微生物細胞催化阿糖胞苷單酯的合成的研究尚未見報道。微生物全細胞一步法制備阿糖胞苷單酯，是綠色的生物反應途徑，為阿糖胞苷單酯的工業化生產提供了新思路。
發明內容
本發明針對現有用于核苷類似物酯合成的催化劑的不足，目的在于提供具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑的制備方法及合成阿糖胞苷單酯的微生物方法。所述的微生物全細胞催化劑制備方法簡單易操作，原材料價廉易購買，不涉及酶的分離純化。本發明合成的微生物全細胞催化劑區域選擇性達到96%以上且催化轉化率在70%以上，克服了傳統化學方法的選擇性低、易生成副產物等缺點。與酶制劑相比，微生物細胞催化劑具有價廉、易獲取、在非水介質中穩定性高的優點。本發明通過如下技術方案實現。一種具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，該方法是將初始菌株突光假單胞菌fluorescens GIM1. 209種子液接種至含產酶誘導劑的液體培養基中，接種量為1°/Tl2%，2(T40°C搖瓶培養24 72 h，離心收獲濕菌體，經蒸餾水或緩沖液洗滌兩次后，真空冷凍干燥12-18 h制成微生物全細胞催化劑。所制得的微生物全細胞催化劑區域選擇性在96%以上且催化轉化率在70%以上，具有高區域選擇酰化活性。進一步優化的,所述產酶誘導劑包括Tween 80> Tween 85> Span 60> Span 80中的一種或兩種。進一步優化的，以液體培養基總體積為基準，所述液體培養基的成分為2(T40g/L 產酶誘導劑，O. 5 50 g/L 酵母膏，O. 2 4 g/L MgSO4·7Η20, 2 15 g/L (NH4)2SO4,1 g/LK2HPO4,液體培養基pH為6. 8-7. 5。進一步優化的，所述緩沖液為pH 5. 5^7. 5的檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液。本發明的合成阿糖胞苷單酯的微生物方法，具體是以阿糖胞苷和羧酸酯為底物，以權利要求I所制得的微生物全細胞為催化劑，以吡啶-己烷、吡啶-異丙醚為反應介質發生酯合成反應，得到阿糖胞苷單酯產物。進一步優化的，底物中阿糖胞苷含量為1(T50 mmol/L，羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為15:1飛0:1，全細胞催化劑的用量為2(Tl00 g/L反應體系，合成反應溫度為2(Γ60 V,反應過程振蕩速度60 rpnT240 rpm，反應時間在12-72 h，可得到阿糖胞苷單酯。本發明與現有的技術相比具有如下的優點
I.采用微生物全細胞催化劑來高效催化合成阿糖胞苷5'-單酯合成，具有較之以前技術更高的區域選擇性，及產物結構易控、反應副產物少等優點，并克服了化學催化劑環境不友好，產物純度低，易生成副產物等缺點。 2.微生物全細胞催化劑制備過程易操作、制備成本低。3. 一步法催化阿糖胞苷單酯合成，無須基團保護和去保護、反應過程簡單易控、產物容易分離。·4、在所限定的工藝條件下所制得的微生物全細胞催化劑區域選擇性在96%以上且催化轉化率在70%以上，具有最佳的催化阿糖胞苷酰化反應效果。
具體實施例方式 為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，需要說明的是，這些實施例并不構成對本發明保護范圍的限制。實施例I
將經培養的fluorescens GIM1. 209種子液轉接至含Tween 80產酶誘導劑液體培養基中培養。液體培養基成分為20 g/L Tween 80，0.5 g/L酵母膏，O. 2 g/L MgS04*7H20，2 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7· O。20°C搖瓶培養 24h 后離心收集濕菌體，PH5. 5檸檬酸鹽緩沖液洗滌兩次，真空冷凍干燥12 h后得全細胞催化劑。將所制備的細胞催化劑(用量為5 g/L)加入阿糖胞苷含量為25 mmol/L，羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為15:1的己烷吡啶中，合成反應溫度為60 °C，反應過程振蕩速度60 rpm，反應時間在24 h，可得到阿糖胞苷單酯。該催化劑的催化阿糖胞苷酰化反應的區域選擇性為96%，催化轉化率為75%。實施例2
將經培養的fluorescens GIM1. 209種子液轉接至含Tween 85產酶誘導劑液體培養基中培養。液體培養基成分為30 g/L Tween 85，40 g/L酵母膏，4 g/LMgSO4*7H20 ,15 g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7· 0。40°C搖瓶培養 72h 后離心收集濕菌體，pH5. 5檸檬酸鹽緩沖液洗滌兩次，真空冷凍干燥24 h后得全細胞催化劑。將所制備的細胞催化劑(用量為50 g/L)加入阿糖胞苷含量為50 mmol/L，羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為18:1的己烷-吡啶中，合成反應溫度為60 °C，反應過程振蕩速度60 rpm，反應時間在24 h，可得到阿糖胞苷單酯。該催化劑的催化阿糖胞苷酰化反應的區域選擇性為97%，催化轉化率為74%。實施例3
將經培養的fluorescens GIM1. 209種子液轉接至含Span 60產酶誘導劑液體培養基中培養。液體培養基成分為25 g/L Span 60，30 g/L酵母膏，2 g/LMgSO4*7H20 ,10g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7. 0。30 °C搖瓶培養 48 h 后離心收集濕菌體，pH 5. 5磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，真空冷凍干燥24 h后得全細胞催化劑。將所制備的細胞催化劑(用量為100 g/L)加入阿糖胞苷含量為2 mmol/L，羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為50:1的己烷-異丙醚中，合成反應溫度為20 °C，反應過程振蕩速度100 rpm，反應時間在12h，可得到阿糖胞苷單酯。該催化劑的催化阿糖胞苷酰化反應的區域選擇性為97%，催化轉化率為74%。實施例4
將經培養的fluorescens GIM1. 209種子液轉接至含Span 80產酶誘導劑液體培養基中培養。液體培養基成分為25 g/L Span 80，30 g/L酵母膏，2 g/LMgSO4*7H20 ,10g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7. 0。30 °C搖瓶培養 48 h 后離心收集濕菌體，pH 5. 5磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，真空冷凍干燥24 h后得全細胞催化劑。將所制備的細胞催化劑(用量為55 g/L)加入阿糖胞苷含量為20 mmol/L，羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為35:1，合成反應溫度為35 °C，反應過程振蕩速度2 40 rpm，反應時間在36 h，可得到阿糖胞苷單酯。該催化劑的催化阿糖胞苷酰化反應的區域選擇性為96%，催化轉化率為76%。實施例5
將經培養的fluorescens GIM1. 209 種子液轉接至含 Tween 85 和 Span80產酶誘導劑液體培養基中培養。液體培養基成分為30 g/L Span 80和Tween 85混合物，30 g/L 酵母膏，2 g/L MgSO4·7Η20，10g/L (NH4)2SO4, I g/L K2HPO4, pH 為 7· 0。30 V搖瓶培養72h后離心收集濕菌體，pH 5. 5磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，真空冷凍干燥24 h后得全細胞催化劑。將所制備的細胞催化劑(用量為60 g/L)加入阿糖胞苷含量為30 mmol/L,羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為40:1，合成反應溫度為40 °C，反應過程振蕩速度200 rpm,反應時間在72 h，可得到阿糖胞苷單酯。該催化劑的催化阿糖胞苷酰化反應的區域選擇性為97. 5%，催化轉化率為76%。
權利要求
1.一種具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，其特征在于將初始菌株突光假單胞菌fluorescens GIM1. 209種子液接種至含產酶誘導劑的液體培養基中，接種量為1% 12%，2(T40°C搖瓶培養24 72 h，離心收獲濕菌體，經蒸餾水或緩沖液洗滌兩次后，真空冷凍干燥12-18 h制成微生物全細胞催化劑。
2.根據權利要求I所述具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，其特征在于所述產酶誘導劑包括Tween 80、Tween 85、Span 60、Span 80中的一種或兩種。
3.根據權利要求I所述具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，其特征在于以液體培養基總體積為基準，所述液體培養基的成分為2(T40g/L產酶誘導劑，0. 5^50g/L 酵母膏，0.2 4 g/L MgSO4-7H20, 2 15 g/L (NH4)2SO4,1 g/L K2HPO4，液體培養基 pH 為6.8~7. 5。
4.根據權利要求I所述具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，其特征在于所述緩沖液為PH 5. 5^7. 5的檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求I所述的具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑制備方法，其特征在于所制得的微生物全細胞催化劑區域選擇性在96%以上且催化轉化率在70%以上，具有高區域選擇酰化活性。
6.一種合成阿糖胞苷單酯的微生物方法，其特征在于以阿糖胞苷和羧酸酯為底物，以權利要求I所制得的微生物全細胞為催化劑，以吡啶-己烷、吡啶-異丙醚為反應介質發生酯合成反應，得到阿糖胞苷單酯產物。
7.根據權利要求6所述的一種合成阿糖胞苷單酯的微生物方法，其特征在于底物中阿糖胞苷含量為10飛0 mmol/L,羧酸酯與阿糖胞苷的摩爾比為15: f 50:1，全細胞催化劑的用量為20 100 g/L反應體系，合成反應溫度為20 60 °C，反應過程振蕩速度60 rpnT240 rpm，反應時間在12-72 h，可得到阿糖胞苷單酯。
全文摘要
本發明涉及具有高區域選擇性酰化活性的細胞催化劑的制備方法及合成阿糖胞苷單酯的微生物方法，制備方法是將初始菌株熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensGIM1.209種子液接種至含20～40g/L產酶誘導劑的液體培養基中，20～40℃搖瓶培養24～72h后離心收獲瓶內菌體，蒸餾水或緩沖液洗滌兩次后真空冷凍干燥12h以上制成全細胞催化劑。所制備的細胞催化劑具有高區域選擇性酰化反應活性，區域選擇性高于93%，能夠適用于胞苷單酯的制備，具有比酶催化劑成本低，效率高的優點。
文檔編號C12R1/39GK102952770SQ20121044819
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者李曉鳳, 吳暉, 趙光磊, 余以剛, 盧志洪 申請人:華南理工大學