專利名稱：細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法
技術領域：
本發明涉及自動化顯微注射領域，尤其涉及一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法。
背景技術：
顯微注射(microinjection)技術是在顯微鏡下操作的微量注射技術。可將細胞的某一部分(如細胞核、細胞質或細胞器)或外源物質(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白質、藥物等)通過玻璃毛細管拉成的細針，注射到細胞質或細胞核內。顯微注射技術是研究各種生物分子的作用、制作轉基因動物、克隆動物等的重要技術。顯微注射技術的應用范圍非常廣泛，從輔助(體外)細胞受精技術至分子和細胞基本組分的轉運等都需使用這一技術。傳統的顯微注射技術為手工操作，技術復雜、難度大，需要長時間的練習，才能掌握。手工操作精確度、穩定性較差。工作效率低，工作人員勞動強度高，每次注射的細胞數目有限，不能保證獲得大量的注射細胞，依靠人眼識別和手工操作無法保證細胞的重復注射。在傳統顯微注射技術的基礎上發展而來的機械化顯微注射系統，利用可控視覺系統與機械操作手系統極大的克服了傳統手工的缺點，很大程度上提高了操作精度與穩定性，也進一步提高了工作效率，可以稱為半自動化的顯微注射技術。雖然機械化顯微注射系統是顯微注射技術的一個重要突破點，但是也存在了一些重要的缺陷查找注射的細胞依然是通過人工操作，實驗人員通過在計算機上控制平臺的移動觀察細胞培養皿，選擇感興趣注射的細胞進行注射，待注射結束后只要細胞培養皿有微小偏移或者取下細胞培養皿再次安裝到載物臺，就很難找到注射過的細胞，并且，通過人工的查找需要花費大量的時間。所以說，機械化顯微注射系統離真正的自動化顯微注射技術還相差甚遠。因此，針對上述技術問題，有必要提供一種具有改良結構的基于顯微注射的細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，以克服現有技術中存在的缺陷。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，極大的簡化了對被注射細胞的掃描、查詢與定位操作，為顯微注射技術提供了更加便捷的操作方法，加深了自動化操作程度，進一步提高了工作效率，是自動化顯微注射技術的一個重要組成部分。為實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，所述方法基于細胞注射平臺系統，運用到顯微視覺反饋系統與X/Y精密載物臺系統，所述顯微視覺反饋系統包括倒置生物顯微鏡、CXD攝像頭、計算機，所述CXD攝像頭連接計算機與倒置生物顯微鏡，在顯微鏡下的操作均在計算機上觀察與實行，通過CCD攝像頭將顯微鏡下的操作反饋到計算機屏幕上CCD攝像頭顯示區域上，通過計算機執行區域化掃描、掃描過程中的感興趣點記錄以及掃描完畢后興趣點的追蹤定位，所述X/Y精密載物臺系統設有與計算機連接的X/Y精密載物平臺，所述X/Y精密載物平臺裝載用于顯微注射的細胞培養皿，所述方法具體包括如下步驟( I)將細胞培養皿置于X/Y精密載物平臺上，設置一個坐標原點；(2)設置細胞培養皿逐巾貞掃描的掃描范圍；(3)自動掃描開始，如有感興趣點則暫停掃描，在該幀圖像上選擇感興趣點并且記錄于文件，并且對保存的感興趣點的位置自動編號，該幀圖像上的感興趣點選擇完畢后繼續執行掃描，如沒有感興趣點，則計算機自動執行下一幀圖像的掃描；(4)重復步驟(3)的操作直至整個掃描過程結束或者人工直接結束掃描；(5)執行上述步驟(I) (4)后，若細胞培養皿未被移動過，則操作者直接錄入步 驟(3)中保存的感興趣點的位置編號，便能執行追蹤定位到該些感興趣點，若細胞培養皿被移動過，則操作人員先通過計算機控制X/Y精密載物平臺移動使得平臺回歸到掃描開始設置的坐標原點處，根據坐標原點以及保存的感興趣點文件，錄入保存的感興趣點編號便能執打追S示定位到感興趣點；(6)感興趣點追S示定似結束。優選的，在上述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法中，所述步驟(I)中所述的坐標原點的確定具體包括步驟在細胞培養皿的中心做好微型標記；計算機控制X/Y精密載物平臺移動，使得細胞培養皿中心的微型標記“+s與計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域中心的標記重合，所述兩個字標記重合的地方即為坐標原點。優選的，在上述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法中，所述步驟(3)中掃描的相鄰兩幀圖像之間的停頓時間為2 3秒，此停頓時間便于操作人員觀察該幀圖像上是否有感興趣點。優選的，在上述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法中，所述X/Y精密載物平臺的移動精度為微米級，其移動范圍覆蓋整個細胞培養皿。從上述技術方案可以看出，本發明實施例的方法克服了傳統的人工繁瑣、無規則以及無記憶功能的缺陷，極大的簡化了對被注射細胞的掃描、查詢與定位操作，為顯微注射技術提供了更加便捷的操作方法，加深了自動化操作程度，進一步提高了工作效率。與現有技術相比，本發明的有益效果是( I)帶記憶性、可編輯性、重復性操作。(2)能夠實現對組織切片，病理切片等的數字自動化掃描。(3)克服了傳統的在顯微鏡下無規則的人工操作。(4)結合自動化微納操作技術，提高了在顯微鏡下的工作效率。(5)能夠實現對掃描過的組織切片，病理切片等局部的準確定位，快速定位于標記處，方便實驗人員觀察。(6)能夠實現對培養皿中細胞的準確定位，有利于快速的進行細胞篩選，并且能夠很好的結合自動化顯微注射技術。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的有關本發明的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖I是本發明細胞培養皿的掃描以及感興趣點的記錄流程圖；圖2是本發明興趣點的追蹤定位流程圖；圖3是本發明具體實施例中定義掃描范圍進行逐幀掃描與興趣點的保存示意圖；
圖4是本發明具體實施例中最終得到的整個自定義掃描范圍的全景圖像；圖5是本發明細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法的流程圖。
具體實施例方式本發明公開了一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，該方法克服了傳統的人工繁瑣、無規則以及無記憶功能的缺陷，極大的簡化了對被注射細胞的掃描、查詢與定位操作，為顯微注射技術提供了更加便捷的操作方法，加深了自動化操作程度，進一步提高了工作效率，是自動化顯微注射技術的一個重要組成部分。該細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法基于細胞注射平臺系統，運用到顯微視覺反饋系統與X/Y精密載物臺系統，所述顯微視覺反饋系統包括倒置生物顯微鏡、CCD攝像頭、計算機，所述CCD攝像頭連接計算機與倒置生物顯微鏡，在顯微鏡下的操作均在計算機上觀察與實行，通過CCD攝像頭將顯微鏡下的操作反饋到計算機屏幕上CCD攝像頭顯示區域上，通過計算機執行區域化掃描、掃描過程中的感興趣點記錄以及掃描完畢后興趣點的追蹤定位，所述X/Y精密載物臺系統設有與計算機連接的X/Y精密載物平臺，所述X/Y精密載物平臺裝載用于顯微注射的細胞培養皿，所述方法具體包括如下步驟( I)將細胞培養皿置于X/Y精密載物平臺上，設置一個坐標原點；(2)設置細胞培養皿逐巾貞掃描的掃描范圍；(3)自動掃描開始，如有感興趣點則暫停掃描，在該幀圖像上選擇感興趣點并且記錄于文件，并且對保存的感興趣點的位置自動編號，該幀圖像上的感興趣點選擇完畢后繼續執行掃描，如沒有感興趣點，則計算機自動執行下一幀圖像的掃描；(4)重復步驟(3)的操作直至整個掃描過程結束或者人工直接結束掃描；(5)執行上述步驟(I) (4)后，若細胞培養皿未被移動過，則操作者直接錄入步驟(3)中保存的感興趣點的位置編號，便能執行追蹤定位到該些感興趣點，若細胞培養皿被移動過，則操作人員先通過計算機控制X/Y精密載物平臺移動使得平臺回歸到掃描開始設置的坐標原點處，根據坐標原點以及保存的感興趣點文件，錄入保存的感興趣點編號便能執打追S示定位到感興趣點；(6)感興趣點追S示定似結束。所述步驟(I)中所述的坐標原點的確定具體包括步驟在細胞培養皿的中心做好微型標記；計算機控制X/Y精密載物平臺移動，使得細胞培養皿中心的微型標記“+”與計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域中心的標記“+”重合，所述兩個“~p5字標記重合的地方即為坐標原點。所述步驟(3)中掃描的相鄰兩幀圖像之間的停頓時間為2 3秒，此停頓時間便于操作人員觀察該幀圖像上是否有感興趣點。所述X/Y精密載物平臺的移動精度為微米級，其移動范圍覆蓋整個細胞培養皿。下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行詳細的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。請參閱圖I、圖2及圖5所示,本發明細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法的關鍵所在為選取細胞培養皿上的一個點作為基準點，通過計算機輔助設計，能夠精確獲取細胞培養皿上的任何點的位置，并且能夠準確的定位于感興趣點，以及能夠 自動化逐幀掃描整個細胞培養皿，達到圖像的無縫拼接。本發明也可用于病理切片的自動化掃描，將整個載玻片全方位信息快速的掃描，整個掃描過程全自動化，突破了傳統的在顯微鏡下人工的掃描模式，使醫生脫離在顯微鏡下繁瑣的人工觀察過程，掃描的圖片存儲為數字化信息，免去了切片在運輸過程中易碎的特點，便于醫生之間、醫生與病人之間的遠程交流。本發明主要涉及兩個功能，分別為I.用戶可選區域的細胞培養皿自動化逐幀掃描以及掃描過程中的感興趣點(即感興趣細胞的位置)的記錄；2.掃描結束后，感興趣點精確的追蹤定位。本發明基于細胞注射平臺系統，運用到視覺系統與精密載物臺系統，視覺系統為由C⑶攝像頭分別連接顯微鏡與計算機而組成，精密載物臺系統為X/Y 二維精密載物平臺，通過CXD攝像頭反饋顯微鏡下的操作于計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域，通過計算機執行區域化掃描，掃描過程中的感興趣點記錄以及掃描完畢后興趣點的追蹤定位。如圖I及圖5所示，功能I的具體要素與實現方式X/Y精密載物平臺裝載用于顯微注射的細胞培養皿，其移動精度為O. 01微米，其移動范圍覆蓋整個細胞培養皿。細胞培養皿自動掃描過程分為設置坐標原點、開始掃描、暫停/繼續掃描、結束掃描。其中，坐標原點的設置為通過在計算機上操作與觀察X/Y精密載物平臺的移動，當事先在細胞培養皿上做好的微型標記“+” (可用顯微切割等方法)與計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域的標記重合的時候，兩個字標記重合的位置即為坐標原點(0，O)。設置完畢坐標原點后，操作人員設置掃描范圍，掃描過程為逐幀掃描，不存在重復掃描，每一幀圖像拼合即為設置的掃描范圍。掃描的相鄰兩幀圖像之間的停頓為2 3秒，此停頓時間便于操作人員觀察該幀圖像上是否有感興趣點如有感興趣點則暫停掃描，在該幀圖像上選擇感興趣點并且記錄于文件，并且對保存的感興趣點自動編號，該幀圖像上的感興趣點選擇完畢后繼續執行掃描，如沒有感興趣點，則待暫停時間經過后，計算機自動執行下一幀圖像的掃描，重復以上的操作直至整個掃描過程結束或者人工直接結束掃描。圖I為具體的圖像的逐幀掃描以及興趣點的記錄操作流程圖。如圖2及圖5所示，功能2的具體要素與實現方式
在細胞培養皿掃描過程中保存的興趣點，計算機對這些保存的點的位置自動編號，操作者錄入點的編號，便能執行追蹤定位到該點，本發明能夠精確的定位到任意保存過的感興趣點。鑒于在細胞培養皿上有做好的微型標記以及計算機屏幕上C⑶攝像頭顯示區域的標記，掃描結束后無論操作者如何移動培養皿，操作人員通過計算機移動X/Y精密載物平臺使得上述的兩個重合，使得平臺回歸到掃描開始設置的坐標原點處，根據坐標原點以及保存的感興趣點文件，錄入保存的感興趣點編號便能定位到該點于計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域的“+”標記處，而且無論顯微鏡在何種放大倍數下切換(特定觀察需要)，不影響細胞定位的準確性。圖2為追蹤定位保存過的感興趣點的具體操作流程圖。下面結合具體的實施例對本發明的方法進行具體的闡述。步驟一自定義掃描范圍，掃描過程中保存每一幀圖像，掃描過程中遇到感興趣點暫停掃 描，保存感興趣點。首先，放置樣品于X/Y精密載物平臺，對齊樣品中心的微型標記“+”與計算機上攝像頭顯示區域中心“+”，使兩個微型標記中心重合，并且保持兩個之間無夾角，固定好樣品防止掃描過程中的松動；然后，定義中心重合的兩個“+”為坐標原點。具體掃描方向如圖3所示，定義掃描范圍為3X3，也即一共9幀圖像，開始掃描，任意兩幀圖像之間預留2_3秒時間為實驗人員提供觀察時間，觀察該幅圖像是有感興趣點，如果有感興趣點則暫停掃描，選取感興趣點(一幅圖像可以選取多個點)，選取結束后繼續掃描下一幀圖像。該實施例中在每一副圖像中選取任意一點作為興趣點。在選取完第九點以后，掃描結束。掃描過程中對保存的每幀圖像自動編號，依據掃描范圍順序拼接每一幀圖像，最終得到整個自定義掃描范圍的全景圖像，如圖4所示，圖4即為最終得到整個自定義掃描范圍的全景圖像。另外，在掃描過程中選取興趣點的同時，已經自動保存選取的興趣點的位置信息。步驟二對于在步驟一中掃描過的樣品，在后續的實驗中有可能已經從載物臺取下該樣品，或者樣品已經脫離了原來的位置，現對保存的感興趣點回歸定位。首先，依然對齊樣品中心的微型標記“+”與計算機上攝像頭顯示區域中心使兩個微型標記“+”中心重合，并且保持兩個“+”之間無夾角，固定好樣品防止掃描過程中的松動；然后，定義中心重合的兩個為坐標原點，錄入步驟一中保存的興趣點的位置信息；最后，輸入要定位的點的序號，載物臺自動移動使得選取的點定位于計算機攝像頭顯示區域的“+”字標記處，完成定位。本發明實施例的方法克服了傳統的人工繁瑣、無規則以及無記憶功能的缺陷，極大的簡化了對被注射細胞的掃描、查詢與定位操作，為顯微注射技術提供了更加便捷的操作方法，加深了自動化操作程度，進一步提高了工作效率。與現有技術相比，本發明的有益效果是( I)帶記憶性、可編輯性、重復性操作。(2)能夠實現對組織切片，病理切片等的數字自動化掃描。(3)克服了傳統的在顯微鏡下無規則的人工操作。
(4)結合自動化微納操作技術，提高了在顯微鏡下的工作效率。(5)能夠實現對掃描過的組織切片，病理切片等局部的準確定位，快速定位于標記處，方便實驗人員觀察。(6)能夠實現對培養皿中細胞的準確定位，有利于快速的進行細胞篩選，并且能夠很好的結合自動化顯微注射技術。對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
權利要求
1.一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，其特征在于所述方法基于細胞注射平臺系統，運用到顯微視覺反饋系統與X/Y精密載物臺系統，所述顯微視覺反饋系統包括倒置生物顯微鏡、CXD攝像頭、計算機，所述CXD攝像頭連接計算機與倒置生物顯微鏡，在顯微鏡下的操作均在計算機上觀察與實行，通過CXD攝像頭將顯微鏡下的操作反饋到計算機屏幕上CCD攝像頭顯示區域上，通過計算機執行區域化掃描、掃描過程中的感興趣點記錄以及掃描完畢后興趣點的追S示定位，所述X/Y精S載物臺系統設有與計算機連接的X/Y精密載物平臺，所述X/Y精密載物平臺裝載用于顯微注射的細胞培養皿，所述方法具體包括如下步驟 (1)將細胞培養皿置于X/Y精密載物平臺上，設置一個坐標原點； (2)設置細胞培養皿逐幀掃描的掃描范圍； (3)自動掃描開始，如有感興趣點則暫停掃描，在該幀圖像上選擇感興趣點并且記錄于文件，并且對保存的感興趣點的位置自動編號，該幀圖像上的感興趣點選擇完畢后繼續執行掃描，如沒有感興趣點，則計算機自動執行下一幀圖像的掃描； (4)重復步驟(3)的操作直至整個掃描過程結束或者人工直接結束掃描； (5)執行上述步驟(I) (4)后，若細胞培養皿未被移動過，則操作者直接錄入步驟(3)中保存的感興趣點的位置編號，便能執行追蹤定位到該些感興趣點，若細胞培養皿被移動過，則操作人員先通過計算機控制X/Y精密載物平臺移動使得平臺回歸到掃描開始設置的坐標原點處，根據坐標原點以及保存的感興趣點文件，錄入保存的感興趣點編號便能執行追足示定位到感興趣點； (6)感興趣點追蹤定位結束。
2.根據權利要求I所述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，其特征在于步驟(I)中所述的坐標原點的確定具體包括步驟 在細胞培養皿的中心做好微型標記； 計算機控制X/Y精密載物平臺移動，使得細胞培養皿中心的微型標記與計算機屏幕上CXD攝像頭顯示區域中心的標記重合，所述兩個字標記重合的地方即為坐標原點。
3.根據權利要求I所述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，其特征在于所述步驟(3)中掃描的相鄰兩幀圖像之間的停頓時間為2 3秒，此停頓時間便于操作人員觀察該幀圖像上是否有感興趣點。
4.根據權利要求I所述細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，其特征在于所述X/Y精密載物平臺的移動精度為微米級，其移動范圍覆蓋整個細胞培養皿。
全文摘要
一種細胞培養皿自動化掃描記錄與興趣細胞跟蹤定位的方法，該方法基于細胞注射平臺系統，通過計算機執行區域化掃描、掃描過程中的感興趣點記錄以及掃描完畢后興趣點的追蹤定位，該方法選取細胞培養皿上的一個點作為基準點，通過計算機輔助設計，能夠精確獲取細胞培養皿上的任何點的位置，并且能夠準確的定位于感興趣點，以及能夠自動化逐幀掃描整個細胞培養皿，達到圖像的無縫拼接，該方法克服了傳統的人工繁瑣、無規則以及無記憶功能的缺陷，極大的簡化了對被注射細胞的掃描、查詢與定位操作，為顯微注射技術提供了更加便捷的操作方法，加深了自動化操作程度，進一步提高了工作效率。
文檔編號C12N15/89GK102965395SQ20121047600
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者汝長海, 陳瑞華, 錢馳 申請人:蘇州大學