專利名稱：一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法
技術領域：
本發明屬于有機染料合成及生物細胞標記領域，特別涉及一種結構可設計的陽離子型胺基功能化的方酸菁的合成方法。
背景技術：
菁染料是一類比較特殊的染料，與傳統染料不同，它不能用于織物的染色，因為它在光照下不穩定。事實上，在最初的研究階段，菁染料在很長時間內，都是作為一種感光材料，用作鹵化銀凝膠的增感劑。至今它在感光材料領域的應用仍然占據著重要地位，特別是近年來它作為新型光存儲介質在有機型存儲光盤中得到廣泛應用。例如在CD—ROM光盤感光層材料中，菁染料是目前最常用三種染料之一。為了滿足日新月異的生物分析應用對熒光染料的需求，研究開發出更多的具有良好熒光光譜性能的新型熒光染料，仍然是熒光分析技術發展的關鍵和核心。目前使用比較多的羅丹明類、熒光素類、BODIPY類和菁類等熒光染料，其中有些品種已經商品化。但這些商品化的染料大部分光譜都處在紫外可見區，而生物樣品自身在這個區域有很強的吸收，熒光檢測時會顯現出一定強度的自發熒光，造成強的熒光背景，從而極大地降低了檢測的靈敏度。近紅外熒光染料由于能避開這個問題近年來受到了廣泛的重視。吲哚菁染料是菁染料中光穩定性比較突出的一類，吲哚方酸菁染料又是吲哚菁染料到目前為止光穩定性最好的一類。并 且吲哚方酸菁染料在近紅外區有著強烈而狹窄的吸收和發射光譜，這些特點使得它在光電領域成為研究的熱點。但是，吲哚方酸菁染料易于聚集，水溶性較差等缺點限制了其在生物上的廣泛應用。因此，迫切需求發明新型的可以進行細胞特異性熒光標記的吲哚方酸菁染料，并將其應用于生物醫藥的科研、診斷等領域。
發明內容
本發明的目的在于提供一類光穩定性好、水溶性好、pH敏感性、結構可設計性的胺基功能化吲哚方酸菁染料，具有細胞標記的多功能性。該方法首先通過成熟的合成方法制備具有羧基官能團修飾的吲哚方酸菁染料，然后通過羧基與胺基的縮合反應引入帶有不同胺基官能團的結構，最終得到不同胺基官能團修飾的吲哚方酸菁染料。帶有不同胺基官能團的吲哚方酸菁染料與活體或者固定/死細胞組織一同培養，應用于固定/死細胞的細胞核或者活體細胞的細胞膜的特異性生物標記，以及鑒定活體組織中正在發生凋亡的細胞。一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法，其特征在于，其具體制備步驟為I)將苯肼鹽酸鹽類化合物和3-甲基-2-丁酮加入反應瓶中，摩爾比在1:0. 1-1:6之間，并加入溶劑冰醋酸，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下加熱至回流溫度，反應3-24小時，得到3H-吲哚啉產物；2)將3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化試劑加入反應瓶中，摩爾比在1:0. 1-1:6之間，并加入溶劑乙腈或鄰氯苯或甲苯，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下加熱至回流溫度，反應6-48小時，得到季銨化的吲哚啉衍生物；3)將季銨化的吲哚啉衍生物和方酸加入反應瓶，其摩爾比在1:0. 1-1:3之間，并加入溶劑體積比為正丁醇甲苯吡啶=1:1:1的溶劑，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ；溶液在氮氣氣氛下回流反應3-72小時，得到羧基功能化的吲哚方酸菁；4)將羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二異丙基乙胺(DIPEA)加入反應瓶，其摩爾比在1:2:2-1:10:40之間，并加入N-二甲基甲酰胺(DMF)或三氯甲烷，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下室溫攪拌5-60 min，然后加入帶有伯胺基的反應試劑；該反應試劑與方酸菁的摩爾比在1:1-1:30之間，反應0. 5-12小時得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。當胺基功能化的吲哚方酸菁染料為將叔丁酯Boc保護的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料，還需要進行以下步驟將叔丁酯Boc保護的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料加入反應瓶，并加入溶劑二氯甲烷或氯仿，使得溶液的溶度在10_2_10 mol/L ;然后往溶液中加入三氟乙酸,其與溶劑的體積比為1:1 ;在氮氣氣氛下室溫攪拌2-8小時，得到伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料。所述合成方法合成的染料的應用，其特征在于將胺基功能化的吲哚方酸菁染料稀釋到緩沖液中，放入活體或者固定/死細胞組織中培養一段時間后，該類熒光分子和細胞核里的DNA或細胞膜里的磷脂分子極性頭部相互作用，從而能夠特異性標記活體細胞的細胞膜和固定/死細胞的細胞核；結合這兩種細胞標記特性，該類突光染料成功地標記出活體組織中正在發生細胞凋亡的細胞核。這種標記后的細胞組織可以制備成玻片樣本在熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下拍照分析后，長期冷凍保存。
步驟4)中所述的胺基功能化的吲哚方酸菁染料的結構式為
權利要求
1.一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法，其特征在于，其具體制備步驟為 1)將苯肼鹽酸鹽類化合物和3-甲基-2-丁酮加入反應瓶中，摩爾比在1:0.1-1:6之間，并加入溶劑冰醋酸，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下加熱至回流溫度，反應3-24小時，得到3H-吲哚啉產物； 2)將3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化試劑加入反應瓶中，摩爾比在1:0.1-1:6之間，并加入溶劑乙腈或鄰氯苯或甲苯，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下加熱至回流溫度，反應6-48小時，得到季銨化的吲哚啉衍生物； 3)將季銨化的吲哚啉衍生物和方酸加入反應瓶，其摩爾比在1:0.1-1:3之間，并加入溶劑體積比為正丁醇甲苯吡啶=1:1:1的溶劑，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下回流反應3-72小時，得到羧基功能化的吲哚方酸菁； 4)將羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二異丙基乙胺(DIPEA)加入反應瓶，其摩爾比在1:2:2_1:10:40之間，并加入N-二甲基甲酰胺(DMF)或三氯甲烷，使得溶液的濃度在10_2-10 mol/L ;溶液在氮氣氣氛下室溫攪拌5-60 min，然后加入帶有伯胺基的反應試劑；該反應試劑與方酸菁的摩爾比在1:1-1:30之間，反應O. 5-12小時得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。
2.根據權利要求1所述的一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法，其特征在于 當胺基功能化的吲哚方酸菁染料為將叔丁酯Boc保護的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料，還需要進行以下步驟 將叔丁酯Boc保護的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料加入反應瓶，并加入溶劑二氯甲烷或氯仿，使得溶液的溶度在10_2_10 mol/L ;然后往溶液中加入三氟乙酸,其與溶劑的體積比為1:1 ;在氮氣氣氛下室溫攪拌2-8小時，得到伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料。
3.根據權利要求1或2所述合成方法合成的染料的應用，其特征在于 將胺基功能化的吲哚方酸菁染料稀釋到緩沖液中，放入活體或者固定/死細胞組織中培養一段時間后，該類熒光分子和細胞核里的DNA或細胞膜里的磷脂分子極性頭部相互作用，從而能夠特異性標記活體細胞的細胞膜和固定/死細胞的細胞核；結合這兩種細胞標記特性，該類熒光染料成功地標記出活體組織中正在發生細胞凋亡的細胞核。這種標記后的細胞組織可以制備成玻片樣本在熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下拍照分析后，長期冷凍保存。
4.根據權利要求1所述的一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法，其特征在于，步驟4)中所述的胺基功能化的吲哚方酸菁染料的結構式為
全文摘要
本發明公開了一類水溶性吲哚方酸菁多功能細胞熒光染料的合成方法。該類染料通過多步化學合成，最終使吲哚方酸菁含有帶陽離子型的胺類官能團，提高了方酸菁的水溶性和生物相容性。該類熒光分子能與細胞核內的DNA或細胞膜中的磷脂分子相互作用，從而特異性標記活細胞的細胞膜和固定/死細胞的細胞核。結合這兩種細胞標記特性，該類熒光染料成功地標記出活體組織中正在發生凋亡的細胞的細胞核。本方法合成工藝成熟、操作簡單，產品具有安全無毒、分子可設計性強、水溶性優異、光穩定性好、pH敏感等優點，可作為多功能細胞熒光標記分子，應用于生物醫藥領域的科學研究、診斷和生產。
文檔編號C12Q1/68GK103030989SQ20121053080
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者尹梅貞, 李 杰, 郭坤茹, 楊萬泰, 孫盟盟, 沈杰 申請人:北京化工大學