重組蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種重組蛋白，包括紅細胞生成素、高糖基化片段、人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及促血小板生成素的羧基末端肽。本發明的重組蛋白具有紅細胞生成素的生物活性，且具有較長的半衰期。
【專利說明】重組蛋白
[0001]【發明所屬的【技術領域】】
[0002]本發明涉及一種重組蛋白，且特別涉及一種具有較長半衰期的高糖基化紅細胞生成素。
【【背景技術】】
[0003]紅細胞生成素(Erythropoietin,簡稱ΕΡ0)是一種糖蛋白質激素,骨髓中血紅細胞前驅的細胞因子。在人體中，可進行紅細胞的制造、荷爾蒙的調節。同時，它也具有其他的生物功能，例如，當神經受到傷害時，紅細胞生成激素也參與傷口愈合過程。
[0004]紅細胞生成作用是指紅細胞的生成，其作用為彌補被破壞的細胞。紅細胞生成是一種受控制的生理機制，使足夠的紅細胞可被運用于適當的組織氧合作用。人類紅細胞紅細胞生成素(hEPO)由腎所產生，為一種體液血漿因子，可刺激紅細胞的生成(Carnot，P and Deflandre，C (1906) C.R.Acad.Sc1.143:432 ；Erslev, AJ(1953B 10d 8:349;Reissmann, RR(1950)Blood 5:372 ；Jacobson, L0, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak,LF(1957)Naturel79:6331-4)。自然生成的EPO可刺激骨髓中紅細胞前驅細胞的分裂及分化，并經由與紅細胞前軀物受體的結合而展現其生物活性(Krantz，BS(1991)Blood 77:419)。
[0005]利用重組體DNA技術已可合成紅細胞生成素(Egrie, JC, Strickland, Tff, Lane,J et al.(1986) Immunobiol.72:213-224),將經選殖的人類EPO基因嵌入，并以中國倉鼠卵巢組織細胞表達。EPO多肽在無糖情形下的分子量是18，236Pa。在完整的EPO分子中，分子量中約有40%為碳水化合物基團，其在蛋白質糖基化作用位置上將蛋白質糖基化(Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A andFukuda, M(1987) J.Biol.Chem.262:12059)。
[0006]因紅細胞生成素`是形成紅細胞所必要的，所以EPO可用來治療紅細胞低下或缺失的血液失調癥。就臨床而言，EPO可用于治療慢性腎衰竭病人(CRF) (Eschbach, Jff, Egri,JC, Downing, MR et al.(1987)NEJM 316:73-78 ；Eschbach, Jff, Abdulhadi，MH, Browne, JKet al.(1989)Ann.1ntern.Med.1ll:992 ；Egrie, JC, Eschbach, Jff, McGuire, T, Adamson,Jff(1988)Kidney Intl.33:262 ；Lim, VS,Degowin RL,Zavala,D et al.(1989)Ann.1ntern.Med.110:108-114)、AIDS 及接受化療的癌癥病人的貧血(Danna, RP, Rudnick, SA, Abels,RI In:MB, Garnick, ed.Erythropoietin in Clinical Applications-An InternationalPerspective.New York, NY:Marcel Dekker ； 1990:p.301-324)。然而，目前 EPO 蛋白質治療的生物利用率，受限于不良的血漿半衰期，以及蛋白酶的降解作用，使其難以獲得良好的臨床效力。
【
【發明內容】
】
[0007]本發明的目的為提供一種具有較長半衰期的高糖基化紅細胞生成素。
[0008]為達上述目的，本發明另提供一種重組蛋白，包括:紅細胞生成素；高糖基化片段；人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及促血小板生成素的羧基末端肽。[0009]本發明更提供一種核苷酸序列，其編碼上述重組蛋白。
[0010]本發明更提供一種細胞，其轉染上述核苷酸序列以表達上述重組蛋白。
[0011]本發明更提供一種組合物，包括上述重組蛋白，以及藥學上可接受的載體或佐劑。
[0012]為了讓本發明的上述和其他目的、特征、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合所附圖示，作詳細說明如下:
【【具體實施方式】】
[0013]本發明提供一種長效型紅細胞生成素，及其制備與使用方法。
[0014]在一個實施方案中，本發明提供一種重組蛋白，其包括一紅細胞生成素以及一高糖基化片段。[0015]本發明所述的“紅細胞生成素(EPO) ”包括任何來源的EPO蛋白，特別是指人類或動物ΕΡ0。本發明的EPO不限于自然的EPO蛋白，也包括其衍生物、相似物、修飾物、突變物等，只要其具有自然EPO蛋白的活性即可。
[0016]本發明也包括任何具有EPO活性的蛋白質，例如突變或其他修飾蛋白等。可藉由DNA重組技術在CHO、BHK、COS、HeLa或PER.C6或其他適合的細胞株中表達重組ΕΡ0,相關內容可參考美國專利 US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 733，746、US5, 994，122、US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 981，214 及 US5, 272，071。EPO 的制備與治療上應用可參考 US5, 547，933、US5, 621，080，Huang, S.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1984) 2708-2712，Lai, P.H.et al., J.Biol.Chem.261 (1986) 3116-3121, Sasaki, H et al., J.Biol.Chem.262 (1987) 12059-12076。較佳的 EPO 種類為人類 EPO。
[0017]本發明所述的“高糖基化片段”系指具有至少一個糖基的10-30個氨基酸片段。本發明的高糖基化片段具有一個或多個N-或O-連接糖基化位置，可產生一個或多個糖基。例如，SEQ ID N0:l、2 及 / 或 3，或與 SEQ ID NO:1、2、3 所示序列同一性在 65%、70%、80%，優選為90%以上的序列。
[0018]高糖基化與EPO融合形成本發明的重組蛋白，高糖基化片段可位于EPO的氨基端(N端)或羧基端(C端)，且數目并無特別限制。例如，可于EPO的N端及/或C端連接一個或多個相同或不同的高糖基化片段。含有高糖基化片段的EPO具有較長的半衰期，以及較佳的活性。
[0019]上述本發明重組蛋白可更包括人類絨毛膜促性腺激素(human ChorionicGonadotropin, hCG)的羧基末端妝(carboxyterminal peptide)。
[0020]本發明所述的“人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽(以下簡稱CTP) ”是指人類絨毛膜促性腺激素第112-118至145個氨基酸的片段，或具有相同生物活性的變異體或類似物。因可分別從hCG的第112、113、114、115、116、117或118個氨基酸開始，因此CTP可為具有28、29、30、31、32、33或34個氨基酸的片段。
[0021]本發明的CTP包括，但不限于，SEQ ID NO:4，或與SEQID NO:4所示序列同一性在65%、70%、80%，90%，優選為95%以上的序列。
[0022]本發明的CTP可位于EPO的N端或高糖基化片段的C端，且數目并無特別限制。例如，可在EPO的N端或高糖基化片段的C端連接一個或多個相同或不同的hCG的CTP。
[0023]本發明的CTP可作為蛋白質或肽的保護者，抑制蛋白質或肽的分解。在本發明中，hCG的CTP可延長重組蛋白的半衰期，以及增進重組蛋白的效價。
[0024]上述本發明重組蛋白可更包括促血小板生成素(Thrombopoietin, ΤΡ0)的羧基末端肽。
[0025]本發明所述的“血小板生成素的羧基末端肽(以下簡稱TPS) ”是指促血小板生成素第176至353個氨基酸的片段，優選為第337至353個氨基酸的片段，或具有相同生物活性的變異體或類似物。
[0026]本發明的TPS包括，但不限于，SEQ ID NO:5，或與SEQ ID NO:5所示序列同一性在65%、70%、80%，90%，優選為95%以上的序列。
[0027]在一實施例中，本發明的TPS可位于EPO的N端或高糖基化片段的C端，且數目并無特別限制。例如，可在EPO的N端或高糖基化片段的C端連接一個或多個相同或不同的TP S。
[0028]在另一個實施方案中，本發明TP S可位于EPO的N端或CTP的C端，且數目并無特別限制。例如，可在EPO的N端或CTP的C端連接一個或多個相同或不同的TPS。
[0029]本發明TPS可作為蛋白質或肽的保護者，抑制蛋白質或肽的分解。在本發明中，TPS可延長重組蛋白的半衰期，以及促進重組蛋白的效價。
[0030]本發明的高糖基化片段、CTP與TPS也包括經修飾的高糖基化片段、CTP與TPS。熟悉此【技術領域】人士可以一般傳統的技術對肽或DNA序列進行修飾。例如，蛋白質序列的修飾可包括改變、置換、取代、插入或刪除編碼序列中的一個或多個氨基酸。改變、置換、取代、插入或刪除序列所使用的方法為一般所熟知的技術。序列在改變、置換、取代、插入或刪除后，優選仍保有原始高糖基化片段、CTP與TPS的活性。
[0031]在一個實施方案中，修飾包括，但不限于，N-端修飾、C-端修飾、多肽鏈修飾，如CH2-NH, CH2-S, CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH 或 CF = CH、骨架修飾(backbone modifications)與殘基修飾(residue modification)。妝化合物的制備方法已為熟知，例如，可參照 Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press (1992)。
[0032]在一個實施方案中，多肽中的肽鍵(-C0-NH-)可被取代，例如，可被N-甲基鍵(-N(CH3) -CO-)、酯鍵(-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮甲基(ketomethylen)鍵(-CO-CH2-)、a -aza鍵(_NH_N (R) -CO-)，其中R為任意烷基、羥乙基鍵(一CH (OH) -CH2-)、硫代酰胺(thioamide)鍵(-CS-NH-)、烯雙鍵(-CH = CH-)、酰胺鍵(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R) -CH2-CO-)取代。
[0033]本發明另提供一種重組蛋白，包括紅細胞生成素(EPO);高糖基化片段；人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽(CTP)，以及促血小板生成素的羧基末端肽(TPS)。
[0034]在此重 組蛋白中，EPO的C端連接高糖基化片段，在高糖基化片段的C端連接CTP，在CTP的C端連接TPS。
[0035]在一個實施方案中，高糖基化片段包括，但不限于，SEQ IDN0:1、2及/或3。可在EPO的C端連接一個或多個相同或不同的高糖基化片段。例如，在EPO的C端連接SEQ IDN0:l、2或3，或連接2個以上的SEQ ID NO:1、2及/或3 ;或在EPO的C端依序連接SEQ IDNO: 1、2與3，或依序連接SEQ ID NO: 3、2與I。在一個實施方案中，EPO的C端依序連接SEQID NO:1、2 與 3。[0036]在一個實施方案中，CTP為SEQ ID NO:4。
[0037]在一個實施方案中，TPS為SEQ ID NO:5。
[0038]在一個實施方案中，本發明的重組蛋白包括SEQ ID NO:1、2、3、4與5。在另一個實施方案中，本發明的重組蛋白為SEQ ID N0:6。
[0039]本發明另提供一種核苷酸序列，其編碼本發明的重組蛋白。
[0040]本發明的“核苷酸”是指單鏈或雙鏈的核苷酸序列，其可由RNA序列、cDNA序列、基因序列表示和/或上述的組合。
[0041]在本發明的核苷酸序列可利用PCR技術或其它熟知的技術制備，相關技術可參考，例如，"Current Protocols in Molecular Biology" , eds.Ausubel et al., JohnWiley & Sons,1992。
[0042]本發明的核苷酸序列可插入表達載體以表達重組蛋白。在一個實施方案中，表達載體包括其它額外的多肽，使其可在原核或真核細胞中復制與重組。在另一個實施方案中本發明的表達載體包括轉錄與轉譯的起始序列(如，啟動子或增強子)以及轉錄與轉譯的終止序列(如，聚腺苷酸)。
[0043]可使用各種真核或原核細胞作為宿主表達系統，以表達本發明的核苷酸序列。在一個實施方案中，此表達系統包括，但不限于，各種微生物，例如，細菌、真菌，植物細胞，真核細胞(例如，哺乳動物細胞，CHO細胞)等。
[0044]本發明的表達載體可利用各種方法轉染至細胞中。此方法可參考SambiOOk etal., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,Johnffiley and Sons, Baltimore, Md.(1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRCPress, Ann Arbor, Mich.(1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann ArborMich.(1995), Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths，Boston Mass.(1988)以及 Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，且包括，例如，穩定或暫時性轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染、或感染重組病毒載體。
[0045]本發明另提供一種組合物，包括上述的重組蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0046]本發明所述的“藥學上可接受的載體或賦形劑”是指不會刺激個體組織，且不會抑制給予藥物或化合物的生物活性及特性的載體、賦形劑或佐劑。載體包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、或可溶于有機介質與水性介質的生物相溶性聚合物。賦形劑包括，但不限于，碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類和淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油與聚乙二醇。
[0047]本發明的組合物可用于治療貧血患者。貧血患者包括，但不限于，慢性腎功能不全患者、終末期腎臟病患者、接受透析的患者、慢性腎功能衰竭患者、艾滋病患者，癌癥患者、化療患者，以及預定接受非心臟、非血管外科手術的貧血患者。
[0048] 在給予貧血患者治療有效量的本發明組合物后,可有效地增加貧血患者的血球容積比，且于本發明的高糖基化紅細胞生成素在個體中具有較長的半衰期。本發明的高糖基化紅細胞生成素具有比市售紅細胞生成素(如，KprcxE^ArancspA:)更長的半衰期，例如，本發明高糖基化紅細胞生成素的半衰期是市售紅細胞生成素的I倍以上，優選2倍以上，更優選3倍以上。在另一個實施方案中，本發明的高糖基化紅細胞生成素具有比市售紅細胞生成素(如，EpreX? 及 Aranesp? )更高的 AUC 值(area under curve)。
[0049]本發明所述的“治療有效量”一般是指約I至100001.U./kg個體重量，優選約50至20001.U./kg個體重量，更優選約50至6001.U./kg個體重量，最優選約50至3001.U/kg個體重量。
[0050]本發明的組合物可在任何所需的頻率或間隔給藥。給藥的方式，例如，可為每兩周三次，每周一次，每兩周一次，每三周一次，每月一次，每五周一次，每六周一次，或更頻繁或不頻繁的間隔，或在任何所需的頻率，或任何的時間間隔組合。本發明的活性成份的劑量可依照個體的種類，個體的大小、疾病的嚴重性等做適當的調整。例如，若個體為接受化療的癌癥患者，則給藥頻率可為每三周一次，以配合化療的時程(化療大都每三周一次)。
【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0051]圖1:顯示本發明EPO-NNCT基因片段的設計。
[0052]圖2:顯示本發明EPO-NNCT與市的活性比較。
[0053]圖3:顯示本發明EP0-NNCT、市售Eprex?以及Eprex?藥物動力特性(ρκ)的比較(靜脈注射)。
[0054]圖4:顯示本發明EP0-NNCT、市售Eprex?以及Eprex?藥物動力特性(PK)的比較(皮下注射)。
【【具體實施方式】】
[0055]實施例1.宿主表達細胞
[0056]本實施例的宿主表`達細胞使用缺少二氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢細胞(CH0dfhr-)，其購買自臺灣食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(CCRC，60133)。將CHO dfhr-細胞培養于 IMDM培養基(Isocoves Modified Dulbecco’s Medium IMDM ；GibcoCat.12200-36)中，其中含有10 %的胎牛血清(Gibco Cat.10091148)、次黃嘌呤與胸腺嘧啶(Gibco, Cat.11067-030)、以及 2mM 的 L-麩酰胺(Gibco Cat.25030-081)。Dhfr (-)標志被用來表達及篩選。藉由使用二氫葉酸還原酶抑制劑“甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)”(Sigma Cat n0.M8407)使dhfr基因表達。當dfhr基因表達時，其他鄰近基因也被一起表達，選擇表達量高的細胞株，將細胞培養于37°C，5% CO2的培養箱中(Mode13326，Formascientific)。
[0057]實施例2.pND/EPO-NNCT表達載體的構建
[0058]利用組合式PCR (assembly PCR)，將 EP0-NNCT 基因片段(SEQ ID NO:6)插入pcDNA3.1/Neo (+) /DHFR載體，形成pND/EPO-NNCT載體。此表達載體包含作為篩選標志的抗新霉素基因(neomycin-resistance gene)。EP0-NNCT的基因片段如圖1所示，其中EPO為紅細胞生成素，NI為高糖基化片段I (SEQ ID NO:1)，N2為高糖基化片段2 (SEQ ID NO:2),N3為高糖基化片段3 (SEQ ID NO:3)，CTP為人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽(SEQ IDNO:4)，TPS為促血小板生成素的羧基末端肽(SEQ ID NO:5)。
[0059]實施例3.重組細胞株的建立
[0060]將含有人類EPO-NNCT基因的載體以電脈沖法(PA4000 PulseAgileKelectroporator, Cyto Pulse Sciences)轉染至CHOdhfr-細胞內。首先將細胞以膜蛋白酶處理后，將細胞懸浮于CP-T緩沖液(Cyto pluse Cat.CP-T)中使細胞密度為3xl06細胞/ml。將200 μ I的細胞懸浮液(6χ105細胞)與10 μ g的pND/BMP2混合后進行電脈沖處理，將經電脈沖處理的細胞培養于不含篩選物質的完全培養基(含10%胎牛血清及HT補充物(HT Supplement)之MDM)使細胞恢復成長。培養于不含篩選物質的培養基48小時后，將細胞移至含有MDM、10%胎牛血清、L-麩酰胺及5nM甲氨蝶呤的含篩選物質的完全培養基中。在培養2周后，將細胞株移至96孔盤中，并利用ELISA定量分析篩選出高表達rhBMP-2的細胞株。將篩選出的細胞培養于篩選培養基中。將細胞稀釋至I細胞/100 μ I的濃度后移至96孔盤中培養至生長成細胞叢。利用ELISA檢測并定量ΒΜΡ-2蛋白，再依據ELISA的結果篩選出高產量細胞并逐步增加MTX濃度從0.005,0.01,0.02至0.05 μ Μ。
[0061]實施例4.批次培養
[0062]將實施例3所獲得的高產量細胞進行批次培養。使用50ml攪拌式培養槽，接種4xIO5細胞/ml的細胞在無血清的培養基中培養一個批次，且每天記錄細胞生長狀況及收集培養基以進行定量，在給予0.02 μ M MTX的條件下，其產量可達140.69 μ g/ml，如表一所示。
[0063]表一、批次培養結果
[0064]
【權利要求】
1.一種重組蛋白，包括: 紅細胞生成素； 聞糖基化片段； 人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽，以及 促血小板生成素的羧基末端肽。
2.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述紅細胞生成素的羧基端連接所述高糖基化片段。
3.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述高糖基化片段的羧基端連接所述人類絨毛膜促性腺激素羧基末端肽。
4.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述人類絨毛膜促性腺激素羧基末端肽的羧基端連接所述促血小板生成素的羧基末端肽。
5.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述高糖基化片段包括SEQID N0:l、2及/或3，或同一性在90%以上的序列。
6.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽為SEQID NO:4，或同一性在90%以上的序列。
7.權利要求1所述的重組蛋白，其中所述人類絨毛膜促性腺激素的羧基末端肽為SEQID NO:5，或同一性在90%以上的序列。
8.權利要求1所述的重`組蛋白，其中所述重組蛋白為SEQIDNO:6，或同一性在90%以上的序列。
9.一種核苷酸序列，其編碼權利要求1所述的重組蛋白。
10.一種細胞，其包括權利要求9所述的核苷酸序列，且表達權利要求1所述的重組蛋白。
11.權利要求10所述的細胞，其中所述細胞為CHO細胞。
12.—種組合物，包括權利要求1所述的重組蛋白，以及藥學上可接受的載體或佐劑。
【文檔編號】C12N5/10GK103864913SQ201210551666
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優先權日:2012年12月18日
【發明者】彭文君, 楊淑萍, 彭宏智, 陳郁鴻 申請人:聯亞生技開發股份有限公司