天山雪蓮SikTrxh基因在植物抗逆中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種天山雪蓮SikTrxh基因在培育抗逆植物中的應用，本發明從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，利用上述基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗逆轉基因植物。本發明從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，并在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗逆性，通過該基因的過量表達，使植物對低溫、干旱、鹽以及氧化脅迫的抵抗性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒直接相關的基因，并將其用于農作物品種改良，具有重要的學術和經濟價值。
【專利說明】天山雪蓮SikTrxh基因在植物抗逆中的應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到SikTrxh基因，構建組成型植物表達載體，轉化植物，并對抗逆效果進行評價，增強植物的抗逆性。
【背景技術】:
[0002]低溫、干旱和鹽等非生物脅迫是影響作物產量和品質的重要因素。植物遭受非生物脅迫時會產生大量的活性氧(ROS)，直接損害植物細胞，使膜系統破壞，細胞脫水，從而影響細胞代謝。通常植物會通過調節自生抗氧化酶類來消除或減緩過多的ROS帶來的損害，而機體內的硫氧還蛋白也是消除細胞過多ROS的重要成員(Xu WS, Ngo L, Perez G,Dokmanovic M，Marks PA(2006).1ntrinsicapoptotic and thioredoxin pathways inhuman prostate cancer cell response to histone deacetylase inhibitor.Proc NatlAcad Sci USA，103:15540-15545)。
[0003]目標蛋白氧化還原的調節，越來越多的通過巰基二硫化的轉變而改變。硫氧還蛋白(Thioredoxins，Trxs)是一類廣泛存在于生物體內的小分子穩定類蛋白，在進化中形成高度保守的氧化還原位點WCGPC，通過這兩個Cys殘基參與氧化還原反應(HolmgrenA (1989).Thioredoxin and ghtaredoxinsystems.J Biol Chem，264:13963-13966)。高等植物包含兩類硫氧還蛋白系統:鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白系統(FTR/Trx)和NADP/硫氧還蛋白系統(NTR/Trx)。前者是定位在葉綠體，由核編碼的硫氧還蛋白f和m組成，通過FTR提供電子將硫氧還蛋白還原；后者由硫氧還蛋白h組成，在非光合組織中通過NTR提供電子還原硫氧還蛋白(Buchanan, BB (1991).Regulation of CO2 assimilation inoxygenicphotosynthesis:the ferredoxin/thioredoxin system.Perspective on its discovery,present status andfuture development.Arch Biochem Biophys，288:1-9)。對擬南芥完整的基因組測序顯示，高等植物硫氧還蛋白屬于多基因家族，根據氨基酸序列同源性將硫氧還蛋白分為六大類(Trxf，Trxh, Trxm, Trxo, Trxx 和 Trxy)。Trxf，Trxm, Trxx 和 Trxy 定位在葉綠體，通過調節碳代謝相關酶活來參與磷酸戊糖和C4途徑(Gelhaye E，Rouhier N，Navrot N，Jacquot J P (2005).The plant thioredoxin system.Cell Mol LifeSci,62:24-35)。而Trxo定位在線粒體，具有調節線粒體的基本功能(Balmer，Y.，Vensel，I H.，Tanaka，C.K.，Hurkman, W.J.，Gelhaye, E.，Rouhier，N.，J acquot，J.P.，Manieri，W.，Schiirmann, P., Droux, M.，et al.，(2004).Thioredoxin links redox to the regulationof fundamental processes of plant mitochondria.PNAS,101(8):2642-2647)。
[0004]Trxh主要定位在細胞質，但也發現存在于線粒體、內質網和細胞核MarcusF，Chamberlain SH, ChuC，Masiarz FR，Shin S，Yee BC, Buchanan BB (1991).Plant thioredoxin h:an animal-like thioredoxinoccurring in multiple cellcompartments.Arch Biochem Biophys, 287:195-198 ；Ishiwatari Y，Honda C，KawashimaI，Nakamura S，Hirano H，Mori S，Fujiwara T，Hayashi H，Chino M(1995)Thioredoxin his oneof the major proteins in rice phloem sap.Planta，195:456-463 ;Serrato AJ,Cejudo F J (2003).Type-hthioredoxins accumulate in the nucleus of developingwheat seedt issues suffering oxidative stress.Planta，217:392-399)。早期認為Trxh對種子的萌發和幼苗的發育起到重要作用(Marx C，Wong JH，BuchananBB (2003).Thioredoxin and germinating barley:targets and protein redox changes.Planta,216:454-460)，在大多數植物中也可做為信號蛋白(Schobert C，Baker L，SzederkenyiJ，Grossmann P，Komor E，HayashiH，Chino M，Lucas WJ (1998).1dentificationof immunologicalIy related proteins in sieve-tube exudatecoIlected frommonocotyledonous and dicotyledonous plants.Planta，206:245-252)。近年來隨著分子生物學的發展，研究證明植物硫氧還蛋白是氧化脅迫應答中的關鍵因素，而活性氧(ROS)可以誘導植物硫氧還蛋白基因的表達。例如擬南芥在氧化脅迫條件下，AtTrxh5的表達明顯增加(Laloi C，DominiqueMO, Marco Y，Meyer Y，Reichheld JP (2004).TheArabidopsis cytosolic thioredoxin h5 geneinduction byoxidative stress and itsW-box-mediated response to pathogen elicitor.Plant Physiol，134:1006-1016)。甲基紫精處理水稻幼苗也增加了 OsTrxh的轉錄水平(Tsukamoto SiMorita SiHira no EiYokoiHiMasumura T，Tanaka K (2005).A novel cis-element tha is respon-sive to oxidativestress regulat es three antioxidantdefense genes in rice.Plant Physiol,137(I):317-327) o AtTrxt^可做為分子伴侶增強擬南芥熱休克(PariiSK，Jung YJ，Lee JR，Le eYM, Jang HH, Lee SS, Park JH, Kim SY, Moon JC, Lee SY, et al (2009).Heat-shock andredox-dependent functional switching of an h-type Arabidopsis thioredoxin froma disulfidereductase to a molecular chaperone.Plant Physiol，150:552-561)。擬南芥中還存在一類基質蛋白CDSP32，它包含2個硫氧還蛋白活性位點，在質體抵抗氧化脅迫中起重要作用(Broin M，Cuine S，Eymery F，Rey P (2002).The plastidic 2-cysteineperox-1redoxin is a target for a thioredoxin involved in theprotection of thephotosynthetic apparatus against oxidative damage.Plant Cell，14: 1417-1432)。此外，硫氧還蛋白還參與調節SOD、CAT、GLP等酶活，保護植物減緩氧化脅迫的損傷。在體外，OsTRXhl也同樣具有活性，它能夠對過氧化氫敏感的Trx缺失酵母突變體重新獲得抗性(Zhang CJ, Zhao BC, GeWN, Zhang YF, Song Y，Sun DY，and Guo Y (2011).An ApoplasticH-Type Thioredoxin Is Involved in theStress Response through Regulation of theApoplastic Reactive Oxygen Species in Rice.Plant Physiology, 157:1884-1899)。
[0005]作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar.et Kir)，又名天山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫3~5°C，最低月平均溫-19~_21°C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。
[0006]天山雪蓮經過長期的自然選擇，形成了穩定的特殊結構、功能和遺傳基因，產生了適應極端環境條件下的生理和生化機制，這種與環境相適應的機制，與一般的耐冷、抗寒應答性的適應機制不同，主要表現在其低溫條件下能夠正常的生長發育，而一般的抗寒性植物在相應的低溫條件下，生長發育受到抑制。近年來植物抗寒基因工程得到迅速發展，并研究出了多種轉基因抗寒植物，為培育抗寒植物開辟了新途徑。雪蓮生活在極端環境中，是一種極好的抗寒基因的資源，至今，國內外對雪蓮硫氧還蛋白的研究還未見文獻報道。利用這種具有特色稀有植物，從中篩選、克隆出與抗寒乃至更多抗逆直接相關的基因，揭示雪蓮適應性的機制，研究其遺傳基礎，充分發掘其潛在的基因資源，并將其用于表作物品種改良，具有巨大的學術和經擠價值。
【發明內容】
:
[0007]在前期的研究中，我們利用GateWay技術構建的低溫脅迫下天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫，從天山雪蓮文庫中篩選克隆到了天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh。為了研究該基因的功能，我們構建了該基因的植物表達載體，并將此基因導入煙草中，提高植物的抗逆性。
[0008]本發明的一個目的是為植物抗逆育種提供有價值的天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh，其發明目的還在于構建植物表達載體:PBI121-SikTrxh，在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性、抗旱性和耐鹽性，通過該基因的過量表達，使植物的抗逆脅迫性能得到提高，最終獲得抗寒性、抗旱性和耐鹽性能力明顯增強的植物。
[0009]本發明的目的是通過以下過程和方法實現的:
[0010]本發明所述的從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因，其序列為〈210>1。
[0011]本發明的從天山雪蓮中克隆SikTrxh基因的過程如下:
[0012]提取經低溫處理的天山雪蓮RNA，并以RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用Primer5.0設計分別帶有 BamHI和SacI的PCR引物Pl和P2進行擴增，得到目的基因；
[0013]構建SikTrxh基因植物表達載體pBI121_SikTrxh ；
[0014]利用上述基因構建植物表達載體，通過農桿菌介導法遺傳轉化獲得轉基因植物:
[0015]將生長在光照培養室中2個月的對照植株和2種不同株系的轉基因植株，經低溫、干旱、鹽脅迫處理，分別剪取葉片進行相關生理指標的測定，所有實驗每個指標重復測定3次。
[0016]低溫脅迫試驗中，隨著溫度的下降，轉SikTrxh基因煙草的相對電導率、MDA含量始終低于對照組煙草，且上升趨勢小于對照組煙草，傷害率較對照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現明顯的上升趨勢。轉SikTrxh基因煙草在低溫脅迫下表現出較強的抗寒性。
[0017]在200mmol.T1NaCl脅迫中，轉SikTrxh基因煙草的相對電導率、MDA含量始終低于對照組煙草，且上升趨勢小于對照組煙草，傷害率較對照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現明顯的上升趨勢。轉SikTrxh基因煙草在鹽脅迫下表現出較強的抗鹽性。
[0018]干旱脅迫試驗中，轉SikTrxh基因煙草的相對電導率、MDA含量始終低于對照組煙草，且上升趨勢小于對照組煙草，傷害率較對照低；S0D、CAT、APX酶活力呈現明顯的上升趨勢。轉SikTrxh基因煙草在干旱脅迫下表現出較強的抗旱性。
[0019]轉天山雪蓮硫氧還蛋白基因SikTrxh煙草的抗逆功能研究表明，轉基因煙草對低溫、高鹽和干旱都表現出了較強的抗性水平。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]圖1 是天山雪蓮 SikTrxh 基因 PCR 擴增圖 Figl:SikTrxh gene PCR amplified
[0021]圖 2 是 pGM-SikTrxh PCR 鑒定圖Fig2:PCR identification ofpGM-SikTrxh
[0022]圖 3 是 SikTrxh 進化分析圖Fig3:Phylogenetic analysis SikTrxh
[0023]圖 4 是 pBI121-SikTrxh PCR 鑒定Fig4:PCR identification ofpBI121-SikTrxh
[0024]圖 5 是 pBI121_SikTrxh 酶切鑒定Fig5 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_SikTrxh
[0025]圖 6 是轉化 GV3101PCR 鑒定Fig6:PCR identification ofpBI121-SikTrxh-GV3101
[0026]圖7 是轉化煙草 PCR 檢測Fig7:PCR identification oftransformed tobacco
[0027]圖8 是轉基因煙草 RT-PCR分析Fig8:RT_PCR analysis on transgenictobacco
[0028]圖9是低溫、鹽和干旱脅迫下煙草葉片相對電導率 Fig9:Change of relativeelectric conductivity intobacco leaves under low temperature， salt and droughtstress
[0029]圖10是低溫、鹽和干旱脅迫下煙草葉片MDA含量 Fig.10:Change of MDAcontent in tobaccoleaves under low temperature， salt and drought stress
[0030]圖11是低溫、 鹽和干旱脅迫下煙草葉片SOD酶活性、APX酶活性和CAT酶活性Fig.11:Changesof SOD activity, APX activity and CAT activity in tobacco leavesunder low temperature, salt and droughtstress
[0031]圖12是pBI121_SikTrxh的植物表達載體構建流程圖
[0032]圖1 中:
[0033]1:陰性對照；2:SikTrxh ；M:Marker I
[0034]圖2 中:
[0035]1-8:pGM-SikTrxh ；9:陰性對照；10:陽性對照；M =Marker I
[0036]圖4 中:
[0037]1:陽性對照；2:pBI121-SikTrxh ；M =Marker I
[0038]圖5 中:
[0039]1,2:pBI121-SikTrxh ；3:陰性對照；M =Marker I
[0040]圖6 中:
[0041]1-12:pBI121-SikTrxh-GV3101 ；13:陽性對照；14:陰性對照；M =MarkerIII
[0042]圖7 中:
[0043]1-8:煙草DNA PCR產物；9:陽性對照；10:空白煙草對照；M =MarkerIII
[0044]圖8 中: [0045]1:陽性對照；2:空白煙草對照；4，5，6，8，10:煙草cDNA PCR產物；M =MarkerIII【具體實施方式】:
[0046]實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京康為世紀公司生產；M_MLV酶購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、pGM_T、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購于TIANGEN公司；BamH1、SalI等限制性內切酶為Fermentas公司原裝；IPTG、X-gaI及抗生素、植物激素購自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養基的各種試劑均為國產分析純。具體實驗操作依據[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實驗指南》。
[0047]實施例1:從天山雪蓮中克隆到SikTrxh基因
[0048]1.1天山雪蓮總mRNA的提取
[0049]1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的槍頭、離心管均使用0.1 %的DEPC處理，高壓滅菌；
[0050]2)取植物幼嫩葉片約0.1g于研缽中，加液氮充分研磨至粉末狀；
[0051]3)將粉末分裝至1.5mL的小離心管中，加入1ml的TRNzol提取試劑，充分快速混勻，室溫放置3-5min。
[0052]4) 10000rpm,4°C離心5min,吸上清至一新的離心管,加入200 μ I氯仿,劇烈振蕩混勻；
[0053]5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管后，加入600 μ I預冷的異丙醇，于-2011C沉淀30min ；
[0054]6) 10000rpm，4°C離心10min后，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉淀，即為總 RNA。
[0055]7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉淀2次后，吸干液體，吹干后加入30 μ IddH20 (DEPC處理)溶解，保存于_20°C備用。
[0056]1.2cDNA第一鏈的合成
[0057]在DEPC 處理的 0.2ml 離心管中加入 RNA 5 μ 1，Oligo dT 2 μ 1，ddH20 5 μ I 后，在75°C水浴IOmin后迅速置于冰上2min。然后在離心管中加入dNTP(2.5mmol/L) 2ul,Rnase Inhibitor I μ 1，M-MLV-RT 反轉錄酶 I μ 1，DEPC ddH20 5ul,42°C lhr,70°C 15min后，-20°C保存。
[0058]1.3cDNA第二鏈的合成及擴增
[0059]在PCR反應管中加入cDNA第一鏈反應產物，用Pl和P2為引物進行擴增，同時以去離子水為模板作為陰性對照進行擴增。
[0060]P1 為:5 ’ -GGATCC AAAATGGCGGAAGAAGGA-3，
[0061]BamHI
[0062]P2:為:5，-GAGCTC GGAAACACATAAGTTGCT-3 ’
[0063]Sacl
[0064]PCR 反應體系(20 μ I)為:
[0065]
【權利要求】
1.一種從天山雪蓮中克隆的SikTrxh基因，其序列為〈210>1，其特征在于該基因編碼區全長354bp，編碼117個氨基酸。
2.根據權利要求1所述核苷酸序列構建的植物表達載體。
3.根據權利要求1所述核苷酸序列的用途，其特征在于利用上述基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得的抗逆轉基因植物 。
【文檔編號】C12N9/02GK103882036SQ201210556121
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】祝建波, 劉超, 王愛英, 沈海濤, 馮玉杰 申請人:石河子大學