專利名稱：一種根據像素計算dna片段大小的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種根據像素計算DNA片段大小的方法。
背景技術：
在分子生物學實驗中，檢測DNA片段的大小或比較群體間PCR擴增產物的多態性時，利用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳對其進行監測是一項基礎性的、常用實驗技術。相對于瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠的孔徑較小，對于較小的DNA分子有更好的分辨效果，可用于5-500bp的DNA分子，由于本實驗主要用于定量計算，對于DNA分離的要求較高，因此選用聚丙烯酰胺凝膠電泳。通常無論是普通的瓊脂糖凝膠電泳，還是分辨率較高的聚丙烯酰胺凝膠電泳，人們普遍通過用DNA片段與各種分子量標記(Marker)進行比較后，估計或計算目標DNA片段的大小。若目標DNA片段的大小與所使用的DNA-marker中所具有的某一條帶非常接近時，能大概估計出目標DNA片段的大小，但是，若想得到更為精確的目標條帶的大小，僅僅靠估計是很難做到的。而且通過Marker目測估計目標片段大小存在隨意性大，重復性差等特點。目前關于線性雙鏈DNA條帶的泳距與其長度間的關系的研究較少，而且主要有3種觀點:①DNA分子長度的常用對數與泳距成反比DNA分子的長度與泳距成反比DNA分子長度與泳距呈反向邏輯斯蒂增長關系。但是這些算法均因非線性回歸算法復雜，且每塊凝膠結果都需要單獨回歸分析運算，使得其應用受到很大限制。而且在應用這些算法進行計算的過程中，測量泳距所用的方法有:用尺子量出DNA片段的泳距，用掃描儀掃描膠后，再用作圖工具測量出泳距，和用像素較高的相機照下膠后再用作圖工具測量出泳距，而且無論是哪一種方法，其測量泳距的最小精度的單位為毫米。這很容易造成I毫米泳距的差異可能導致DNA片段的大小達到幾個甚至幾十個bp的差異。加大了DNA片段大小的誤差，造成DNA片段大小不準確
發明內容
本發明提供了一種根據像素計算DNA片段大小的方法，旨在解決現有技術提供的計算DNA片段大小的方法，誤差大，不精確的問題。本發明的目的在于提供一種根據像素計算DNA片段大小的方法，該方法包括以下步驟:步驟一，將全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的條帶作為未知條帶，并對前5條的DNA條帶進行分析；步驟二，分別用7%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染進行染色；步驟三,拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距,將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計。進一步，在步驟一中，全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段時，條帶大小分別為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp 和 lOOObp。進一步,在步驟一中，DL2000Marker上的條帶作為未知條帶時,條帶大小分別為100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp 和 2000bp。進一步，7%聚丙烯酰胺凝膠的配方為:尿素7.2g、ddH2031.25ml、10XTBE6ml、40% Acr-bisl0.5ml、10%過硫酸銨 0.6ml、TEMED27y I。進一步，在步驟二中，電泳條件為:室溫、恒電壓120V、電泳時間3小時。進一步,在步驟三中，拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距時,用鼠標點在有DNA片段的條帶正中，便可得出條帶在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠標點在電泳的起始點，得出起始點處在PHOTOSHOP中的像素值，兩者之差便是泳距的大小。本發明提供的根據像素計算DNA片段大小的方法，首先將全式金TRANSDLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的條帶作為未知條帶，并對前5條的DNA條帶進行分析；然后分別用7%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染進行染色；最后在拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距,將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計，該計算DNA片段大小的方法，誤差小，結果的精確度高，實用性強，具有較強的推廣與應用價值。
圖1是本發明實施例提供的根據像素計算DNA片段大小的方法的實現流程圖；圖2是本發明實施例提供的根據像素計算DNA片段大小時二次和三次多項式擬合的函數圖象示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。圖1示出了本發明實施例提供的根據像素計算DNA片段大小的方法的實現流程。該方法包括以下步驟:步驟SlOl，將全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的條帶作為未知條帶,并對前5條的DNA條帶進行分析；步驟S102，分別用7%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染進行染色；步驟S103,拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距,將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計。在本發明實施例中，在步驟SlOl中，全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA 片段時，條帶大小分別為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp 和 1000bp。在本發明實施例中，在步驟SlOl中，DL2000Marker上的條帶作為未知條帶時，條帶大小分別為 100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp 和 2000bp。在本發明實施例中，7%聚丙烯酰胺凝膠的配方為:尿素7.2g、ddH2031.25ml、10XTBE6ml,40% Acr-bisl0.5ml、10%過硫酸銨 0.6ml、TEMED27y I。在本發明實施例中，在步驟S102中，電泳條件為:室溫、恒電壓120V、電泳時間3小時。
在本發明實施例中，在步驟S103中，拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距時，用鼠標點在有DNA片段的條帶正中，便可得出條帶在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠標點在電泳的起始點，得出起始點處在PHOTOSHOP中的像素值，兩者之差便是泳距的大小。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。材料與方法:全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段(條帶大小分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp 和 IOOObp)和 DL2000Marker(100bp、250bp、500bp、750bp、lOOObp和2000bp)上的條帶作為未知條帶，并對前5條的DNA條帶進行分析。并分別用7%聚丙烯酰胺凝膠(配方:尿素7.2g、ddH2031.25mlU0XTBE6ml,40 %Acr-bisl0.5ml、10%過硫酸銨0.6ml、TEMED27 μ I)，電泳后采用銀染進行染色。電泳條件為:室溫、恒電壓120V、電泳時間3小時整。拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距,在讀取泳距時，用鼠標點在有DNA片段的條帶正中，便可得出條帶在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠標點在電泳的起始點，得出起始點處在PHOTOSHOP中的像素值，兩者之差便是泳距的大小，將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計。結果:利用PHOTOSHOP量取的個條帶和其對應的泳距分別為:IOObp-1784像素、200bp-1161 像素、300bp-795 像素、400bp_606 像素、500bp_447 像素、700bp_304 像素、1000bp-203 像素。由于7%聚丙烯酰胺對500bp以上的條帶分辨率較差，500bp以上的條帶在7%的聚丙烯酰胺凝膠上的遷移距離已經非常接近。可以看出500bp的條帶和IOOObp的條帶距離僅相差243像素。在此區間內，由于像素距離讀取而產生的誤差將對最終結果產生很大的影響。因此，如果需對500bp以上的條帶進行分析，可采用低濃度膠分離DNA片段后再進行分析。故在本實驗中舍去750bp和IOOObp兩條帶，并將剩余的5組數據輸入SPSS進行回歸分析其結果如表一所示。其中各種擬合模型的擬合公式如下:線性:Y = b0+bl*t二次多項式: Y = b0+bl*t+b2*t2復合:Y = 1O=Kblt增長:Y =對數:Y = b0+bl*ln (t)三次多項式:Y = b0+bl*t+b2*t2+b3*t3S:Y = e(b0+bl/t)指數:Y = b0*e(bm)倒數(反比例):Y= b0+bl/t 冪函數:Y = b0*tblLogistic:Y = I/((1/u)+b0*blt)(其中 u 為函數的上限)表一.模型匯總和參數估計值
權利要求
1.一種根據像素計算DNA片段大小的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟一，將全式金TRANS DLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的條帶作為未知條帶，并對前5條的DNA條帶進行分析； 步驟二，分別用7%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染進行染色； 步驟三，拍照后用Adobe Photoshop7.0讀取泳距，將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟一中，全式金TRANSDLlOOOMarker作為已知大小的DNA片段時，條帶大小分別為IOObp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp和IOOObp。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟一中，DL2000Marker上的條帶作為未知條帶時，條帶大小分別為 100bp、250bp、500bp、750bp、IOOObp 和 2000bp。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，7%聚丙烯酰胺凝膠的配方為:尿素7.2g、ddH2031.25ml、10XTBE6ml、40% Acr-bisl0.5ml、10%過硫酸銨 0.6ml、TEMED27y I。
5.按權利要求1所述的方法，其 特征在于，在步驟二中，電泳條件為:室溫、恒電壓120V、電泳時間3小時。
6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟三中，拍照后用AdobePhotoshop7.0讀取泳距時，用鼠標點在有DNA片段的條帶正中，便可得出條帶在PHOTOSHOP中的像素值，然后再用鼠標點在電泳的起始點，得出起始點處在PHOTOSHOP中的像素值，兩者之差便是泳距的大小。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，提供了一種根據像素計算DNA片段大小的方法，首先將全式金TRANS DL1000Marker作為已知大小的DNA片段和DL2000Marker上的條帶作為未知條帶，并對前5條的DNA條帶進行分析；然后分別用7％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染進行染色；最后在拍照后用AdobePhotoshop7.0讀取泳距，將條帶大小和其對應的泳距輸入SPSS的兩列作為自變量和因變量，將數據區選中后依次點擊分析、回歸、曲線估計，該計算DNA片段大小的方法，誤差小、精確度高，實用性強，具有較強的推廣與應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103088126SQ20121059587
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者劉林, 李成云, 張波, 楊靜, 杜云龍, 朱有勇, 蘭茗清 申請人:云南農業大學