利用CotH的毛霉菌病的免疫療法和診斷的制作方法
【專利摘要】本發明提供了毛霉菌CotH多肽和編碼核酸分子。該毛霉菌CotH多肽和編碼核酸能夠有利地用于診斷、治療或預防真菌病癥，尤其是毛霉菌病。
【專利說明】利用CotH的毛霉菌病的免疫療法和診斷
[0001]本專利申請主張2011年9月15日提交的美國臨時專利申請序列號N0.61/535257的優先權權益，該專利申請的全部內容作為參考并入本文。
[0002]本發明是在NIAID授予的NIH基金號011671和013377的政府支持下做出的。政府對本發明具有一定的權利。
【背景技術】
[0003]本發明總體上涉及用于檢測、治療和預防患者中傳染性疾病的組合物和方法，并且更具體地，涉及靶向引起毛霉菌病的真菌所特有的特異性蛋白或核酸的組合物和方法。
[0004]在250，000種已知的真菌種中，約有180種被認為會在人和動物中引起疾病(霉菌病)。一些真菌能夠在所有暴露的受試者中導致感染，例如，全身性病原體莢膜組織胞楽 菌(Histoplasmacapsulatum)和粗球抱子菌(Coccidioides immitis)。其他真菌，如念珠菌種(Candida)、曲霉菌種(Asergillus)和接合菌(Zygomycetes)是機會致病病原體，其通常僅在受損宿主中引起疾病。毛霉菌目接合菌類的真菌能夠引起毛霉菌病，它是人中潛在的致命性真菌感染。屬于毛霉菌目的真菌分為至少六個科，它們全部都能引起毛霉菌病(Ibrahim 等人,Zygomycosis,第 241-251 頁，ff.E.Dismukes, P.G.Pappas和 J.D.Sobel 主編的 Clinical Mycology, Oxford University Press, New York(2003)；Kwon-Chung, K.J.和 J.E.Bennett, Mucormycosis,第 524-559 頁,Medical Mycology,Lea&Febiger, Philadelphia(1992)和 Ribes 等人，Zygomycetes in Human Disease, ClinMicrobiol Revl3:236-30 1 (2000))。然而，到目前為止屬于毛霉菌科的真菌，并且尤其是米根霉種(the species Rhizopus oryzae)(少根根霉(Rhizopus arrhizus))是最常見的感染原因(Ribes等人，如上)。還報道了由于小克銀漢霉科(Cunninghamellaceaefamily)中小克銀漢霉種(Cunninghamella spp.)的感染所引起的毛霉菌病情況的增加(Cohen-Abbo 等人，Clinical Infectious Diseasesl7:173-77 (1993) ;Kontoyianis 等人，Clinical Infectious Diseases18:925-28 (1994) ；Kwon-Chung 等人，American Journalof Clinical Pathology64:544-48 (1975)和 Ventura 等人，Cancer58:1534-36 (1986))。毛霉菌目的其余四個科是不太常見的疾病病因(Bearer等人，Journal of ClinicalMicrobiology32:1823-24 (1994) ；KamaIam 和 Thambiah, Sabouraudial8:19-20 (1980)；Kemna 等人，Journal of Clinical Microbiology32: 843-45 (1994) ；Lye 等人，Pathology28:364-65 (1996)和 Ribes 等人(如上))。
[0005]毛霉菌病試劑幾乎同等地影響免疫力低下的宿主(Spellberg等人，Clin.Microbiol.Rev.18:556-69 (2005))。毛霉菌病的主要風險因素包括表現為酮癥酸中毒的不受控制的糖尿病(被稱為糖尿病酮癥酸中毒(DKA))、其他形式的代謝性酸中毒、使用皮質類固醇的治療法、器官或骨髓移植、中性白細胞減少、創傷和灼傷、惡性血液病癥和接受血液透析的受試者中的去鐵胺螯合療法。
[0006]最近的報道顯示，與過去二十年相比，所報道的毛霉菌病的病例數目顯著增加(Gleissner 等人，Leuk.Lymphoma45 (7): 1351-60 (2004))。在主要的移植中心，毛霉菌病發病率的上升也已向人們提出警告。例如，在弗雷德哈欽森癌癥中心(FredHutchinsonCancer Center), Marr等人已描述了從1985-1989至1995-1999病例數目翻了超過一番(Marr 等人，Clin.1nfect.Dis.34(7): 909-17 (2002))。類似地，Kontoyiannis 等人已描述了在相似的時間段內移植受試者中毛霉菌病的發病率翻了超過一番(Kontoyiannis等人，Clin.1nfect.Dis.30(6): 851-6 (2000))。考慮到美國老齡化群體中糖尿病、癌癥和器官移植發病率的提高，預期在可預見的將來毛霉菌病發病率將持續不斷升高。
[0007]因此，仍需要能夠降低毛霉菌病病理學的風險并提供無副作用的有效療法的化合物和方法。本發明滿足了這種需要并且也提供了相關優勢。
[0008]發明概述
[0009]根據本發明，提供了毛霉菌CotH多肽和編碼核酸分子。毛霉菌CotH多肽和編碼核酸能夠有利地用于診斷、治療或預防真菌病癥，尤其是毛霉菌病。此外，毛霉菌CotH多肽和編碼核酸可用于產生或篩選能夠改變毛霉菌CotH活性或表達的藥劑，該藥劑能夠進一步用于治療或預防真菌病癥。
[0010]本發明還提供了含有毛霉菌CotH核酸的載體、含有這些載體的宿主細胞、毛霉菌CotH反義核酸和相關組合物。本發明另外還提供了可用于雜交至或擴增毛霉菌CotH核酸的毛霉菌CotH寡核苷酸。還提供了抗毛霉菌CotH的特異性抗體。還提供了含有毛霉菌CotH核酸或毛霉菌CotH特異性抗體的試劑盒。這些試劑盒和試劑可用于診斷由毛霉菌目生物引起的真菌感染。還提供了藥物和疫苗組合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1示出 了預測為細胞表面蛋白的四個開放閱讀框(ORF)的遠端免疫印跡(FAR-western blot)。
[0012]圖2示出了 GRP78結合至米根霉(R.0ryzae)的幼殖體,但不能結合至孢子。
[0013]圖3示出了預測作為GRP78配體的四個糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白的表達。
[0014]圖4A和圖4B示出了與內皮細胞一起培育的米根霉(R.0ryzae)幼殖體中CotH基因的表達。
[0015]圖5示出了 4個假定的GPI錨定蛋白彼此之間的同源性以及CotH3中預測的N-和O-糖基化位點的個數。
[0016]圖6A示出了米根霉(R.0ryzae)粘附至人臍內皮細胞但不能粘附至塑料制品的能力。此外，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不粘附至內皮細胞。圖6B示出了米根霉(R.0ryzae) CotH2和CotH3使得釀酒酵母(S.cerevisiae)能夠結合表達GRP78的內皮細胞。
[0017]圖7示出了 CotH3在多個毛霉菌中是保守的，所述毛霉菌包括米根霉(R.0ryzae) 99-880、米根霉(R.0ryzae) 99-892、毛霉屬菌種(Mucor sp.)、傘狀毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)和小抱根霉(R.microsporus)。
[0018]圖8A和圖8B示出了表達CotH2或CotH3的釀酒酵母(S.cerevisiae)粘附至并侵襲內皮細胞或過表達GRP78的CHO細胞，但不能粘附至并侵襲CHO親代細胞。[0019]圖9示出了來自米根霉(R.0ryzae)的CotHl的氨基酸序列(SEQ ID N0.1)和核酸編碼序列(SEQ ID N0.2)。
[0020]圖10示出了來自米根霉(R.0ryzae)的CotH2的氨基酸序列(SEQ ID N0.3)和核酸編碼序列(SEQ ID N0.4) ο
[0021]圖11示出了來自米根霉(R.0ryzae)的CotH3的氨基酸序列(SEQID N0.5)和核酸編碼序列(SEQ ID N0.6)。
[0022]圖12示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295的氨基酸序列(SEQ ID N0.7)和核酸編碼序列(SEQ ID N0.8)。
[0023]圖13示出了使用具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通過PCR對加入米根霉(R.0ryzae)的綿羊血液中CotH3的檢測。
[0024]圖14示出了使用具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通過PCR對加入毛霉屬菌種(Mucor sp.)或傘狀毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的綿羊血液中CotH3的檢測。
[0025]圖15示出了使用具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通過PCR對加入巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)或小孢根霉(R.microsporus)的綿羊血液中CotH3的檢測。 [0026]圖16示出了使用具有SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的核酸序列的寡核苷酸引物通過PCR在加入煙曲霉(Aspergillus fumigate)或白色念珠菌(Candida albicans)的綿羊血液中未檢測出CotH3。
[0027]圖17 不出了具有來自澄色標樁菌(Stigmatella aurantiaca) (ΖΡ_01460584)的蛋白質(SEQ ID NO:65)的氨基酸序列的任何CotH預測蛋白(在這種情況下，CotH3[R03G_l 1882]SEQ ID NO:5)的最高同源性。
[0028]圖18示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和柄籃狀菌(Talaromyces stipitatus) ATCC10500 (EED23986)蛋白(SEQ ID NO:67)之間的氨基酸序列比對。
[0029]圖19示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei)ATCC18224(XP_002144175)蛋白(SEQ ID NO:68)之間的氨基酸序列比對。
[0030]圖20示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和黑曲霉(Aspergillusniger) (XP_001392236)蛋白(SEQ ID NO:69)之間的氨基酸序列比對。
[0031]圖21示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和構巢曲霉(Aspergillusnidulans) (XP_658934)蛋白(SEQ ID NO:70)之間的氨基酸序列比對。
[0032]圖22示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和玉米黑粉菌(Ustilagomaydis) (XP_760027)蛋白(SEQ IDNO:71)之間的氨基酸序列比對。
[0033]圖23示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和粗球抱子菌(Coccidioides immitis) (XP_001243211)蛋白(SEQ ID NO:72)之間的氨基酸序列比對。
[0034]圖24示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa) (XP_956792)蛋白(SEQ ID NO:73)之間的氨基酸序列比對。[0035]圖25示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans) (XP_775558)蛋白(SEQ ID NO:74)之間的氛基酸序列比對。
[0036]圖26示出了來自米根霉(R.0ryzae)的R03G_16295蛋白(SEQ ID NO:66)和淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans) (EFD65170)蛋白(SEQ ID NO:75)之間的氨基酸序列比對。
[0037]圖27示出了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-880的CotH3的核酸序列(包括來自數據庫的內含子)(SEQ ID NO:9)。
[0038]圖28示出了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-880的CotH3的核酸序列(僅來自數據庫的外顯子)(SEQ ID NO:10)。
[0039]圖29示出了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-880的CotH3的氨基酸序列(預測的氨基酸)(SEQ IDNO: 11)。
[0040]圖30示出了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-880的CotH3的核酸序列(包括來自測序數據的內含子)(SEQ ID NO:12)。
[0041]圖31示出了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-892的CotH3的核酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO:13)。
[0042]圖32示出 了來自米根霉(Rhizopus oryzae) 99-892的CotH3的核酸序列(包括來自測序數據的內含子)(SEQ ID NO:14)。
[0043]圖33示出了來自米根霉(R.0ryzae) 99-892的CotH3的預測氨基酸序列(不包括內含子)(SEQ IDNO:15)。
[0044]圖34示出了來自米根霉(R.0ryzae) 99-892的CotH3的預測氨基酸序列(包括內含子)(SEQ IDNO:16)。
[0045]圖35示出了來自毛霉屬菌種(Mucor sp.) 99-932的CotH3序列的核酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO:17)。
[0046]圖36示出了來自毛霉屬99-932的CotH3的預測氨基酸序列(僅AA外顯子)(SEQID NO:18)。
[0047]圖37示出了來自毛霉屬99-932的CotH3的核酸序列(包括內含子)(SEQ ID NO:19)。
[0048]圖38示出了來自毛霉屬99-932的CotH3的預測氨基酸序列(包括內含子)(SEQID NO:20)。
[0049]圖39不出了來自傘狀毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的核酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ IDN0:21)。
[0050]圖40示出了來自傘狀毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的預測氨基酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO:22)。
[0051]圖41不出了來自傘狀毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)的CotH3的核酸序列(包括內含子)(SEQ ID NO: 23)。
[0052]圖42示出了來自傘狀毛霉菌(Lichtheimiacorymbifera)的CotH3的預測氨基酸序列(包括內含子)(SEQ ID NO:24)。
[0053]圖43不出了來自巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3序列的核酸序列(僅外顯子)(SEQ ID NO:25)。
[0054]圖44不出了來自巴西果小克銀漢霉(Cunninghamellabertholetiae)的CotH3的預測氨基酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO: 26)。
[0055]圖45不出了來自巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3的核酸序列(包括內含子)(SEQ ID NO ,21)。
[0056]圖46不出了來自巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)的CotH3的預測氨基酸序列(包括來自測序數據的內含子)(SEQ ID NO: 28)。
[0057]圖47示出了來自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的核酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO:29)。
[0058]圖48示出了來自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的預測氨基酸序列(僅來自測序數據的外顯子)(SEQ ID NO:30)。
[0059]圖49示出了來自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的核酸序列(包括內含子，僅具有一個內含子)(SEQ ID NO: 31)。
[0060]圖50示出了來自小孢根霉(R.microsporus)的CotH3的預測氨基酸序列(包括內含子)(SEQ ID NO:32)。
[0061]圖5IA和圖51B示出了結合至GRP78的米根霉(R.0ryzae)表面蛋白的遠端免疫印跡(部分A)以及顯示 CotH2和CotH3預測蛋白之間密切同一性以及CotH蛋白從真菌中廣泛存在的第四個鑒別的ORF處偏離(divergence)而無鑒別的功能(即R03G_16295)的樹狀圖(圖52B)。
[0062]圖52A-圖52C示出了對萌發和對宿主細胞相互作用響應的CotH基因和R03G_16295的表達。所有CotH基因均在休眠孢子中表達，但是僅有CotH3在生長在37°C的YPD中的米根霉(R.0ryzae)幼殖體中表達。米根霉(R.0ryzae)幼殖體對內皮細胞的暴露僅引起了 CotH2和CotH3基因的表達，如通過RT-PCR確定的(圖52B)。通過qRT-PCR對米根霉(R.0ryzae)幼殖體在內皮細胞上的CotH基因的基因表達的定量表明相對于非表達的CotHl，CotH3和CotH2的表達分別提高了 16和4倍。在任何測試條件下，R03G_16295不表達。通過維爾克松秩和檢驗，相對于CotHl表達*P〈0.001，和相對于CotHl和CotH2表達**P〈0.001 (圖52C)。三個獨立實驗中N = 9。
[0063]圖53 示出了抗肽 GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO: 39)的抗體識別 CotH2 和 CotH3 但不能識別釀酒酵母(S.cerevisiae)異源表達的CotHl蛋白。將肽偶聯至KLH并用于產生商用兔抗體。用所述抗體對異源表達CotH蛋白的釀酒酵母(S.cerevisiae)染色,然后在通過共聚焦顯微鏡檢查使細胞顯像前用FITC標記的抗兔山羊抗體復染。
[0064]圖54A-圖54C示出了內皮細胞表面GRP78結合至異源表達CotH2或CotH3的釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞但是不能結合異源表達CotHl的細胞，并且表達CotH2或CotH3的釀酒酵母(S.cerevisiae)粘附并侵襲內皮細胞或過表達GRP78的CHO細胞，但是表達CotHl或空質粒的釀酒酵母(S.cerevisiae)不粘附和侵襲。用NHS-生物素標記內皮細胞表面蛋白，然后用含有Ca2+和Mg2+的N-辛基-β -d-果聚糖在PBS中的溶液和蛋白酶抑制劑進行提取。將標記的蛋白(250mg)與酵母細胞(2X108) —起孵育，然后通過用含有Ca2+和Mg2+的PBS大量清洗以除去未結合的蛋白。用6M脲洗脫保持結合在生物上的膜蛋白，在10% SDS-PAGE上分離，并通過用抗GRP78Ab的免疫印跡法鑒別(圖54A)。使用在12mm玻璃蓋玻片上分裂的內皮細胞(圖54B)或者CHO親代細胞或過表達GRP78的那些(圖54C)進行粘附和胞吞(通過差異熒光確定)測定。通過維爾克松秩和檢驗，相對于表達空質粒或CotHl的釀酒酵母(S.cerevisiae)，*P〈0.001，并且相對于CotHl和CotH2表達，#P〈0.001。三個獨立實驗中N = 9。數據表示為中值土四分位間距。
[0065]圖55A 和圖 55B 示出了抗 CotH3Ab (抗肽 GAGKKHNNAKQSWNW (SEQ ID NO: 39))阻斷米根霉(R.0ryzae)的內皮細胞胞吞和通過米根霉(R.0ryzae)的損害。使用在12mm玻璃蓋玻片上分裂的進行粘附和胞吞(通過差異熒光確定)測定，而使用96孔板51Cr釋放法進行損害。在加入米根霉(R.0ryzae)幼殖體之前，將內皮細胞與50 μ g/ml抗CotH3或者與來自接種前的相同兔的血清(對照)一起培育I小時。CotH3和CotH2的阻斷(由于抗體對CotH2蛋白反應)終止了內皮細胞對米根霉(R.0ryzae)的胞吞(數據來源于>700個與約200個內皮細胞/每組/次實驗相互作用的真菌細胞，其中在對照中平均59%的細胞被胞吞)(圖55A)，并且降低了真菌導致內皮細胞損害的能力(圖55B)。通過維爾克松秩和檢驗，與接種前的血清或無血清相比，*P〈0.01。對于胞吞,3個獨立實驗中,η = 6個載玻片每組，對于損害測定，2個獨立實驗中，η = 6孔每組。數據表示為中值土四分位間距。
[0066]圖56Α-圖56C示出了靶向CotH2和CotH3的RNA_i構件抑制兩種基因的表達，并且降低了 CotH2和CotH3在細胞表面上的蛋白質合成并且對米根霉(R.0ryzae)的生長或萌發類型無影響。用靶向CotH2和CotH3表達的RNA-1構件(pRNAi)或用空質粒轉化米根霉(R.0ryzae)。相對于用空質粒轉化的細胞，兩種轉化體顯示出具有>80%的CotH2和CotH3表達的減少，如通過qRT-PCR所確定的(圖56A)。使用抗CotH抗體的流式細胞測試顯示與用空質粒轉化的那些、野生型細胞或陰性對照(即用商品化IgG而不是抗CotH抗體染色的野生型米根霉(R.0ryzae))相比，CotH蛋白在用RNA_i構件轉化的米根霉(R.0ryzae)細胞上的細胞表面表達減少(圖56B)。CotH2和CotH3表達減少的兩種轉化體具有與野生型細胞或用空質粒轉化的細胞相似的生長速率(圖56C)。
[0067]圖57A-圖57C示出了 CotH2和CotH3表達的抑制損害了米根霉(R.0ryzae)侵襲和損害內皮細胞和過表達GRP78的CHO細胞的能力。使用在12mm玻璃蓋玻片上分裂的進行粘附和胞吞(通過差異熒光確定)測定，而使用96孔板51Cr釋放法進行損害。與用空質粒轉化的細胞相比，用RNA-1構件轉化的米根霉(R.0ryzae)幼殖體導致對內皮細胞的侵襲(圖57A)和損害(圖57B)較少。與CHO親代細胞相比，使用靶向CotH2和CotH3的RNA-1的轉化體導致了對過表達GRP78的CHO細胞相當的損害。相反，相比于CHO親代細胞，用空質粒或野生型米根霉(R.0ryzae)轉化的米根霉(R.0ryzae)幼殖體導致對過表達GRP78的CHO細胞顯著更大的損害(圖57C)。通過維爾克松秩和檢驗，與空質粒相比，*P〈0.005，與野生型或空質粒相比，**P〈0.01，并且與CHO親代細胞相比:1:P<0.01。對于胞吞，3個獨立實驗中，n = 6個載玻片每組，對于損害測定，3個獨立實驗中，η = 9孔每組。數據表示為中值土四分位間距。
[0068] 圖58Α-圖58C示出了 CotH2和CotH3表達的抑制減弱了糖尿病酮癥酸中毒小鼠中米根霉(R.0ryzae)的毒力。圖58A示出了用三種菌株之一氣管內感染的小鼠(對于野生型η = 10，或者對于RNA-1或空質粒轉化體η = 9)的存活率。對于野生型、空質粒或RNA_i細胞，吸入接種物分別為2.4X 103、2.8X IO3和2.5 X IO3個孢子。通過對數秩和檢驗，相對于野生型或空質粒感染的小鼠，*P〈0.003。圖58B示出了氣管內感染野生型(1.7X103)、空質粒(3.0X IO3)或RNA-1 (3.1XlO3)細胞的糖尿病酮癥酸中毒小鼠(η = 9每組)的肺和腦的真菌載菌量。在相對于感染的+2天，處死小鼠，并處理它們的器官以用于使用SYBR綠測定的組織真菌載菌量。數據表示為中值土四分位間距。通過維爾克松秩和檢驗，相對于野生型或空質粒感染的小鼠，*Ρ〈0.001。圖58C示出了從野生型、空質粒或RNA-1構件感染的小鼠收獲的肺和腦中CotH基因的體內表達，如使用對每個CotH基因特異的引物通過qRT-PCR所確定的。數據表示為平均值土標準差。相對于野生型或空質粒，*P〈0.001。
[0069]圖59示出了從野生型或者空質粒或RNA-1轉化的米根霉(R.0ryzae)感染的糖尿病酮癥酸中毒小鼠收獲的肺的組織病理學檢查。過碘酸雪夫氏(PAS)染色的切片顯示了來自從野生型或空質粒轉化的米根霉(R.0ryzae)感染的小鼠采集的器官的大量菌絲元素(箭頭)，但是未顯示出用RNA-1構件轉化的米根霉(R.0ryzae)感染的小鼠。
[0070]圖60 示出了用抗肽 GAGKKHNNAKQSWNW (SEQ ID NO: 39) (A)或肽MGQTNDGAYRDPTDNNK (SEQ ID NO:40) (B)的抗CotH抗體的被動免疫保護小鼠不被米根霉(R.0ryzae)感染。在用2.4 X IO3個米根霉(R.0ryzae) 99-880孢子(野生型)氣管內感染前2小時,對糖尿病酮癥酸中毒小鼠給予Img抗CotH IgG或接種前血清(對照)。在相對于感染的+3天，給予第二劑量的多克隆抗體或接種前血清。相對于接受接種前血清的小鼠，*Ρ〈0.03。
[0071]圖61示出了不同真菌種的CotH3分子信標檢測的特異性。在StepOnePlus實時PCR儀(AppliedBiosystems)中產生了擴增圖。x軸是從擴增開始時的時間；y軸是突光的增加(ARn);用加粗水平線顯示閾值熒光(對于水陰性對照樣品，它等于平均值加2倍SD) ο可以從添加IO5個米根霉(R.0ryzae)孢子的水樣品(0.5mL)放大信號,但是添加了白色念珠菌(Candidaalbi cans)或煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的不行。
[0072]圖62示出了添加不同米根霉(R.0ryzae)99-880接種物的水樣品(0.5mL)的CotH3分子信標檢測的靈敏度。在StepOnePlus實時PCR儀(Applied Biosystems)中產生了擴增圖。X軸是從擴增開始時的時間；7軸是熒光的增加(ARn);用加粗水平線顯示閾值熒光(對于水陰性對照樣品，它等于平均值加2倍SD)。
[0073]圖63示出了在血液中米根霉孢子的檢測中CotH3分子信標探查的靈敏度和特異性。在StepOnePlus實時PCR儀(Applied Biosystems)中產生了擴增圖。x軸是從擴增開始時的時間；7軸是熒光的增加(ARn);用加粗水平線顯示閾值熒光(對于水陰性對照樣品，它等于平均值加2倍SD)。血液是接種的對照。R:不同接種量(例如，RlO =用米根霉(R.0ryzae)的 10 個抱子添加 350ml 血液)的米根霉(R.0ryzae) 99-880, A:Α.fumigants,C:白色念珠菌(C.albicans)，每個均以IO5個細胞用于添加350ml血液。
[0074]圖64示出了根霉檢測中CotH3分子信標探查的特異性。在StepOnePlus實時PCR儀(AppliedBiosystems)中產生了擴增圖。x軸是從擴增開始時的時間；y軸是突光的增加(ARn);用加粗水平線顯示閾值熒光(對于水陰性對照樣品，它等于平均值加2倍SD)。血液:未接種的血液樣品；99-892:米根霉(R.0ryzae)99-892 ；ATCC62417:小孢根霉(R.microspores) ATCC62417 ；R1000:米根霉(R.0ryzae) 99-880。所有菌株以 IO3 個孢子用于添加血液(350ml)。
[0075]發明詳述
[0076]本文所公開的組合物和方法至少部分基于對由毛霉菌目真菌獨特表達并且在真菌感染期間可以有利于內皮細胞結合的細胞表面蛋白的鑒別和鑒定。主要由米根霉(Rhizopus oryzae)所引起的毛霉菌病的特征在于血管侵襲(angioinvasion)和血管血栓形成。毛霉菌和內皮細胞之間的相互作用是真菌病癥確立的重要因素。最近鑒別的葡萄糖調節蛋白78(GRP78)是通過米根霉(R.0ryzae)幼殖體介導人臍靜脈內皮細胞的侵襲和后續損害的新型宿主受體，它提供了侵襲期間米根霉(R.0ryzae)及其他毛霉菌種結合的可能革巴標配體(Liu 等人,J.Clin.1nvest.120:1914-24(2010))。
[0077]根據本發明，提供了編碼本文所公開的毛霉菌CotH多肽及其他多肽或其功能性多肽片段的核酸。 [0078]如本文所使用的，術語“毛霉菌CotH”是指CotH蛋白家族的亞家族成員，其中毛霉菌CotH蛋白包括參與宿主細胞(如內皮細胞)的粘附和侵襲過程的毛霉菌目中真菌所表達的細胞表面蛋白。因為毛霉菌CotH蛋白是毛霉菌所特有的，因此毛霉菌CotH核酸或多肽的存在與否或者毛霉菌CotH核酸或多肽表達的變化可用作毛霉菌種感染(例如，毛霉菌病)的標志物。因此，本發明包括能夠用于篩選真菌病癥和/或開發用于治療真菌病癥的候選藥物的毛霉菌CotH核酸和/或多肽。
[0079]當在本文中用作毛霉菌CotH多肽或其多肽片段的修飾語時，術語“功能性”是指顯示出類似于本文所公開的CotHl、CotH2和CotH3的功能特征的多肽。例如，當CotH3或CotH2在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達時，釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞粘附至并侵襲內皮細胞或過表達GRP78的CHO細胞。因此，毛霉菌CotH的一個功能是前粘附(pro-adherance)和/或前侵襲(pro-1nvasion)功能。在另一個方面,功能性毛霉菌CotH多肽或其片段還可以包括體內或體外結合至GRP78蛋白、其變體或片段。
[0080]當將本文所述的核酸引入到本領域技術人員已知的多種蛋白表達系統中時，這些核酸分子可用于產生本發明的蛋白。另外，能夠用可容易地檢測的取代基標記這些核酸分子或其片段，并用作測定給定樣品中是否存在本發明的毛霉菌CotH基因或mRNA轉錄本和/或存在量的雜交探針。本文所述的核酸分子及其片段還用作用于擴增編碼本文所述的本發明的蛋白的PCR反應中的引物和/或模板。
[0081]術語“核酸”，也稱為多核苷酸，它涵蓋了核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)、探針、寡核苷酸和引物并且可以是單鏈或雙鏈的。DNA可以是互補DNA (cDNA)或基因組DNA，并且可以表示有義鏈、反義鏈或兩者。核酸的實例為RNA、cDNA或編碼毛霉菌CotH多肽的分離的基因組DNA。這些核酸包括(但不限于)包含如2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、
25、27、29或31中所示的基本相同的核苷酸序列的核酸。一般地，本發明的基因組序列包括調控區，如啟動子、增強子，和位于編碼毛霉菌CotH的外顯子之外的內含子，但是不包括不編碼毛霉菌CotH的近端基因(proximal gene)。
[0082]在本說明書和權利要求中術語“分離的”和/或“純化的”作為DNA、RNA、多肽或蛋白質的修飾語的使用是指已通過人產生了處于這種形式的所指明的DNA、RNA、多肽或蛋白質，并因此與它們天然的體內細胞環境分離。
[0083]術語基本相同的核苷酸序列是指與參比多核苷酸具有足夠同一性的DNA，從而它將在中等嚴格雜交條件下雜交至所述參比核苷酸。在一種實施方式中，具有與所述參比核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的DNA編碼了如SEQ IDN0:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、
23、25、27、29或31中任一個所不的基本相同的氨基酸序列。在另一種實施方式中，具有與所述參比核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的DNA相對于所述參比核苷酸序列具有至少65 %的同一'丨生。具有基本相同的核苷酸序列的DNA可以相對于所述參比核苷酸序列具有至少65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90 %的同一性、至少95 %的同一性、至少98 %的同一性或至少99 %的同一性。
[0084]如本文所使用的，核酸的“修飾”還可以包括相對于參比序列的一個或幾個核苷酸的添加、缺失或取代。核酸的修飾可以包括由于遺傳密碼的簡并度而不改變所編碼的氨基酸序列的取代。這些修飾可以對應于故意做出的改變，或者作為核酸復制期間的突變發生。
[0085]所列舉的毛霉菌CotH序列的示例性修飾包括對應于其他物種的同源染色體的序列，所述物種包括毛霉菌目中的種，如傘枝擬青霉(A.corymbifera)、雅致放射毛霉(A.elegans)、淀粉絲菌(A.rouxii)、巴克斯毛霉(B.circina)、B.multispora、布雷絲枝霉(C.brefeldii)、安地卷霉(C.angarensis)、屈彎科克霉(C.recurvatus)、D.fulva、E.anomalus、雅致卷枝霉(H.elegans)、H.assamensis、K.cordensis、M.amphibiorum、寄生疫霉(P.parasitica)、P.agaricina、異常畢赤酵母(P.anomala)、旋枝霉(P.circinans)、內生根毛霉(R.endophyticus)、R.javensis、傘擬小孢霉(S.umbel lata)、大孢聯軛霉(S.megalocarpus)、T.elegans、T.1ndicae-seudaticae、Ζ.californiensis、無接合抱子根霉(R.azygosporus)、R.caespitosus、同合根霉(R.homothallicus)、米根霉(R.0ryzae)、小抱根霉(R.microspores)、小抱根霉須狀變種(R.microsporus var.rhizopodiformis) >希伯來根霉(R.schipperae),或者本文所公開的毛霉菌目的任何其他種。可以通過本領域中已知的方法確定毛霉菌種相應的毛霉菌CotH序列，如通過PCR或通過篩選基因組、cDNA或表達文庫。
[0086]本發明的 毛霉菌CotH的另一種示例性修飾可對應于毛霉菌CotH核苷酸序列的剪接變體形式。另外，核苷酸序列的修飾可以包括一個或多個非天然核苷酸，其具有(例如)對堿基、糖或磷酸酯部分的修飾或者具有修飾的磷酸二酯鍵。這些修飾能夠有利地提高核酸分子的穩定性。
[0087]本發明還涵蓋了不同于 SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、
29或31中所示核酸但具有相同表型的核酸。表型相似的核酸也稱為功能等效核酸(functionally equivalent nucleic acid)。如本文所使用的,短語功能等效核酸涵蓋了其特征為微小并且非結果序列變化的核酸，它將以基本相同的方式起作用以產生和本文所公開的核酸相同的蛋白產物。具體地，功能等效核酸編碼了與本文所公開的核酸所編碼的那些相同或者具有保守氨基酸變化的多肽。例如，保守變化包括用另一種非極性殘基取代非極性殘基，或者用類似的帶電殘基取代帶電殘基。這些變化包括技術人員所認識到的不會顯著改變蛋白質三級結構的那些。
[0088]本文還提供了編碼毛霉菌CotH多肽的核酸，根據遺傳密碼的簡并性，所述核酸在指定的雜交條件下不必需雜交至本發明的核酸。如本文所使用的，術語簡并是指至少一個核苷酸與參比核酸不同但是編碼了與參比核酸相同的氨基酸的密碼子。編碼本發明的毛霉菌CotH多肽的核酸可以由編碼與 SEQ ID N0:l、3、5、ll、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列基本相同的核苷酸組成。
[0089]在一種實施方式中，本發明提供了編碼如本文所公開的多肽的分離的核酸，所述多肽包括毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。本發明還提供了編碼毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段的分離的核酸，其包括選自下列的核酸:(a)編碼 SEQ ID N0:l、3、5、ll、15、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 中所示的氨基酸序列的核酸，或(b)在低、中等或高嚴格條件下雜交至(a)的核酸的核酸，其中所述核酸連續編碼生物學活性毛霉菌CotH多肽，或(c)相對于以上(a)或(b)簡并的核酸，其中所述核酸編碼生物學活性毛霉菌CotH多肽。在一個方面，本發明所述的核酸在高嚴格條件下雜交。
[0090]雜交是指核酸互補鏈通過類似于染色體DNA中天然存在的鍵的氫鍵的彼此結合，例如，正義鏈:反義鏈或探針:靶標-核酸。本領域技術人員能夠容易地改變用于將給定探針與靶標-DNA雜交的嚴格性水平。
[0091]短語“嚴格雜交”在本文中用于表示多聚核酸雜交物穩定的條件。如本領域技術人員已知的，雜交物的解鏈溫度(Tm)反映了雜交物的穩定性。一般地，雜交物的穩定性是鈉離子濃度和溫度的函數。通常，雜交反應是在較低的嚴格性條件下進行的，然后在不同但更高的嚴格性下清洗。對雜交嚴格性的提及涉及這些清洗條件。
[0092]如本文所使用的，短語“中等嚴格雜交”是指允許靶標核酸與互補核酸結合的條件。雜交的核酸一般將具有至少約60%的同一性，至少約75%的同一性，或至少約85%的同一性；或至少約90%的同一性。中等嚴格條件是相當于在50%甲酰胺、5X登哈特溶液(Denhart's solution)、5XSSPE、0.2% SDS 中于 42EC 進行雜交，隨后在 0.2XSSPEj0.2%SDS中于42EC進行洗滌的條件。
[0093]短語“高嚴格雜交”是指僅允許在0.018M NaCl中于65EC形成穩定雜交物的那些核酸序列雜交的條件，例如，如果雜交物在0.018M NaCl中于65EC是不穩定的，那么它在高嚴格條件下將是不穩定 的，如本文所考慮的。可以通過(例如)在50%甲酰胺、5X登哈特溶液(Denhart' ssolution)、5 X SSPE、0.2% SDS 中于 42EC 雜交，隨后在 0.1 X SSPE和 0.1%SDS中于65EC洗滌來提供高嚴格條件。
[0094]短語“低嚴格雜交”是指相當于在10%甲酰胺、5X登哈特溶液(Denhart’ssolution)、6X SSPE、0.2% SDS 中于 22EC進行雜交，隨后在 I X SSPE，0.2% SDS 中于37EC進行洗滌的條件。登哈特溶液含有1%聚蔗糖(Ficoll)、1%聚乙烯吡咯烷酮和1%牛血清白蛋白(BSA)。20 X SSPE (氯化鈉、磷酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化鈉、0.2M磷酸鈉和0.025M(EDTA)。其他適合的中等嚴格和高嚴格雜交緩沖液和條件對于本領域技術人員是熟知的并且描述于(例如)Sambrook 等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ;和 Ausubel 等人，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)。編碼多妝的核酸在中等嚴格或高嚴格條件下雜交至基本整個序列或大部分序列，例如，通常SEQ IDN0:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或 31 中所示的核酸序列的至少 15-30 個核苷酸。
[0095]本發明還提供了在中等嚴格條件下雜交至毛霉菌CotH核酸分子的毛霉菌CotH核苷酸序列的修飾，所述核酸分子例如SEQ IDNO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸分子。還提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修飾，其中所述修飾具有與毛霉菌CotH核苷酸序列至少65 %的同一性。本發明還提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修飾，所述修飾具有至少65 %的同一性、至少70 %的同一性、至少75 %的同一性、至少80 %的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性、至少98%的同一性或至少99%的同一性。本發明還提供了毛霉菌CotH核苷酸序列的修飾，其中所述修飾的核酸所編碼的氨基酸序列具有與SEQ IDNO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性、至少98%的同一性或至少99%的同一1f生。
[0096]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。可以通過比較每條序列中可以出于比較的目的進行比對的位置來確定同源性。當所比較的序列中的位置被相同的堿基或氨基酸所占據，那么該分子在該位置是同源的。序列間的同源性程度是所述序列共有的匹配或同源位置的個數的函數。“不相關”或“非同源”序列與本發明所述序列之一共有小于40%的同一性，或者作為另外一種選擇小于25%的同一I"生。
[0097]多核苷酸或多核苷酸區(或者多肽或多肽區)對另一條序列具有一定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99% )的“序列同一性”是指當比對時，所比較的兩條序列中相同的堿基(或氨基酸)的百分比。可以使用本領域中已知的軟件程序(例如，Ausubel等人中所述的那些，如上)確定這種比對和百分比同源性或序列同一性。優選地，將缺省參數用于比對。使用缺省參數，一種比對程序是BLAST。具體地，程序是使用以下缺省參數的 BLASTN 和 BLASTP:Genetic code = standard ；filter = none ；strand=both ；cutoff = 60 ；expect = 10 ；Matrix = BL0SUM62 !Descriptions = 50sequences ；sort by = HIGHSC0RE ；Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStrans Iat ions+SwissProte in+SPupdate+PIR。這些程序的詳細內容可見于國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)。生物學相當的多核苷酸是具有指定百分比同源性并 且編碼具有相同或相似生物活性的多肽的那些。
[0098]分離編碼毛霉菌CotH多肽的核酸的一種方式是利用本領域公知的方法用天然或人工設計的核酸探針探查cDNA文庫或基因組文庫。對于該目的來說，來源于毛霉菌CotH基因的核酸探針是特別有用的。通過本領域中熟知的方法，編碼毛霉菌CotH多肽的DNA和cDNA分子可用于從多種毛霉菌種來源中獲得互補基因組DNA、cDNA或RNA，或用于通過篩選cDNA或基因組文庫來分離相關cDNA或基因組克隆(參見，例如，Sambrook等人，如上，1989 ；Ausubel 等人，如上，1999)。
[0099]本發明還提供了包含SEQ IDNO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或 31或其反義鏈的15至300個連續核苷酸的毛霉菌CotH寡核苷酸。如本文所使用的，術語“寡核苷酸”是指包含來自參比核苷酸序列的至少15個連續核苷酸的核酸分子，并且所述核酸分子可以包括來自參比核苷酸序列的至少16、17、18、19、20或至少25個連續核苷酸，并且通常包括至少 30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、多至350個連續核苷酸。參比核苷酸序列可以是有義鏈或反義鏈。因此，在本發明的一個方面，CotH寡核苷酸可以包含以下核酸序列ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC (SEQ ID NO: 33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO: 34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA (SEQ ID NO: 36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC (SEQ ID NO: 37)或本文所公開的寡核苷酸。
[0100]本發明所述的毛霉菌CotH寡核苷酸含有參比毛霉菌CotH核苷酸序列的至少15個連續核苷酸，它能夠在中等嚴格雜交條件下雜交至毛霉菌CotH，并因此能夠有利地用作(例如)探針以檢測樣品中的毛霉菌CotH DNA或RNA，和檢測其剪接變體；作為測序或PCR引物；作為反義試劑以阻止細胞中毛霉菌CotH RNA的轉錄；或在本領域技術人員所知的其中與毛霉菌CotH核酸分子的雜交是所期望的其他應用中使用。
[0101]本發明所述的分離的毛霉菌CotH核酸分子可以在多種診斷和治療應用中使用。例如，本發明所述的分離的毛霉菌CotH核酸分子可以用作探針，如上所述；用作毛霉菌CotH多肽重組表達的模板；或者用于篩選測定以鑒別結合毛霉菌CotH的細胞分子。
[0102]用于產生本發明的毛霉菌CotH核酸分子的另一種有用的方法包括使用PCR和毛霉菌CotH寡核苷酸擴增所述核酸分子，并且可選地通過凝膠電泳純化所得產物。PCR或RT-PCR可用于產生具有任何所需核苷酸邊界的毛霉菌CotH核酸分子。通過選擇具有一個或多個添加、缺失或取代的適合的寡核苷酸引物，可以將所需的修飾引入到所述核酸序列中。能夠從來自所關心的任何細胞、組織或物種的少至單個基因或mRNA拷貝開始，指數擴增這些核酸分子。
[0103]因此，本發明提供了用于檢測樣品中毛霉菌CotH核酸的方法。根據需要，檢測樣品中毛霉菌CotH核酸的方法可以是定性的或定量的。例如，根據用于雜交的測定形式和探針或者選擇用于應用的引物對，根據需要，可以確定毛霉菌CotH的存在、豐度、完整性或結構。
[0104]基于使用分離的毛霉菌CotH核酸分子的特異性雜交，對于檢測毛霉菌CotH核酸有用的測定在本領域中是熟知的并且包括(例如)原位雜交，根據所使用的測定形式，它可以用于檢測核酸分子改變的染色體位置、改變的基因拷貝數和RNA豐度。其他雜交測定包含(例如)RNA印跡和RNA酶保護測定，它可以用于確定不同RNA剪接變體的豐度和完整性，和DNA印跡，它可以用于確定DNA的拷貝數和完整性。可以用任何適合的可檢測部分標記毛霉菌CotH雜交探針，如放射性同位素、熒光物質、化學發光標志物、生物素或本領域中已知的通過分析法可檢測的其他可檢測部分。
[0105]基于使用兩種或更多種毛霉菌CotH寡核苷酸來擴增毛霉菌CotH核酸，對檢測樣品中毛霉菌CotH核酸有用的測定在本領域中也是公知的，并且包括(例如)定性或定量聚合酶鏈反應(PCR);反轉錄PCR(RT-PCR);單鏈構象多態性(SSCP)分析，基于在非變性凝膠電泳上產生改變的電泳遷移率的單鏈DNA 二級結構的差異，它可以容易地鑒別DNA中單個點突變；和結合的PCR、轉錄和翻譯測定，如蛋白截短檢測，其中通過電泳凝膠上改變的蛋白質產物確定了 DNA中的突變。另外，可以對擴增的毛霉菌CotH核酸測序以檢測突變和突變熱點，并且可以開發用于大規模篩選樣品以鑒別這些突變的特異性測定。
[0106]本發明還提供了通過本發明的毛霉菌CotH核酸所編碼的分離的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。例如，本發明提供了包含如SEQ ID NO:1、3、5、11、15、
16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的相同或基本相同的氨基酸序列的多肽。還提供了由包含如 SEQ IDNO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或31 所示的相同或基本相同的核苷酸序列的核苷酸序列所編碼的毛霉菌CotH多肽。
[0107] 如本文所使用的，術語基本相同的氨基酸序列是指相對于參比氨基酸序列具有至少約65%的同一性并且保留了相當的參比氨基酸序列所定義的蛋白功能和生物活性特征的氨基酸序列。在一個方面，具有基本相同的氨基酸序列的蛋白質將具有至少65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少95%的同一性、至少98%的同一性或至少99%的同一性。然而，已認識到含有小于所述序列同一性水平的作為剪接變體出現的或者通過保守氨基酸取代或通過簡并密碼子取代修飾的多肽或編碼核酸也涵蓋在本發明的范圍內。
[0108]術語毛霉菌CotH還涵蓋了其功能性片段或多肽類似物。術語“功能性片段”是指全長毛霉菌CotH蛋白的一部分的肽片段，只要所述部分具有作為相應全長蛋白質的特征的如本文所定義的生物活性。例如，在本發明的方面中，本發明的功能性片段可以結合至GRP78蛋白，或者更具體地，本發明的功能性片段可以結合至上皮細胞所表達的GRP78蛋白。因此，本發明還提供了本發明的毛霉菌CotH蛋白的功能性片段，它可以使用結合和常規方法鑒別，如本文所述的生物測定。
[0109]如本文所使用的，當用于表示毛霉菌CotH時，術語“多肽”旨在表示具有兩種或更多種氨基酸的肽或多肽。術語多肽類似物包括具有與本文具體所述的序列基本相同的氨基酸殘基序列的任何多肽，其中一個或多個殘基已被功能相似的殘基保守取代，并且其顯示了在功能上模擬如本文所述的毛霉菌CotH的能力。毛霉菌CotH多肽的“修飾”還涵蓋了毛霉菌CotH多肽氨基酸序列的保守取代。所編碼的氨基酸的保守取代包括(例如)屬于以下組的氨基酸:(I)非極性氨基酸(Gly、Ala、Val、Lei^P lie) ； (2)極性中性氨基酸(Cys、Met、Ser、Thr、Asn和Gln) ； (3)極性酸性氨基酸(Asp和Glu) ； (4)極性堿性氨基酸(Lys>Arg和His);和(5)芳香族胺基酸(Phe> Trp> Tyr和His)。只要所述多肽保留了如本文所述的其功能的一些或全 部，那么毛霉菌CotH多肽內也包括了其他微小的修飾。
[0110]本發明的功能性片段或多肽類似物的氨基酸長度可以在本發明的毛霉菌CotH的約5個氨基酸多至全長蛋白序列的范圍內。在某些實施方式中，氨基酸長度包括(例如)至少約10個氨基酸、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約75、至少約100、至少約150、至少約200、至少約250或更多個氨基酸長度，多至全長毛霉菌CotH蛋白序列。所述功能性片段可以是毛霉菌CotH多肽的連續氨基酸序列，其包括 SEQ ID NO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 所示的連續氨基酸序列。
[0111]在另一種實施方式中，本發明提供了本文所公開的毛霉菌CotH多肽的免疫原性片段。本發明所述的免疫原性片段可以包括免疫原性表位，其可以使用本領域中熟知的實驗方法來鑒別。另外，還可以使用計算模型來鑒別免疫原性表位。參見，例如，Tong等人(Brief Bioinform.8(2):96-108(2006))和 Ponomarenko 等人(2008) “B-cell epitopeprediction”, Structural Bioinformatics, Bourne PE 和 Gu J 主編,Wiley-Liss ;第 2 版，第849-879頁。一旦鑒別了對抗完整蛋白的抗體具有反應性的表位，那么可以通過在每個位置的氨基酸取代和/或在C和/或N末端的延伸來測試所述多肽的特異性。這些具有表位的多肽通常含有至少6至14個氨基酸殘基，并且可以(例如)通過使用本領域中熟知的方法的多肽合成或通過將已有的蛋白斷裂來產生。因此，在本發明的一些方面，本文所公開的毛霉菌CotH多肽的免疫原性片段可以包括氨基酸序列GAGKKHNNAKQSWNW (SEQ ID NO:39)或 MGQTNDGAYRDPTDNNK(SEQ ID NO:40)。
[0112]相對于用作依照本發明的免疫原的分子，本領域技術人員將認識到可以將所述蛋白質截短或斷裂而不會損失作為免疫原性疫苗的基本質量。例如，可以通過從C末端截短將蛋白質截短以產生N末端片段，同時保持了所述分子作為免疫原的功能性。類似地，可以通過從N末端截短來產生C末端片段，同時保持了所述分子作為免疫原的功能性。依照本發明，可以根據本文所提供的教導和指導做出其他修飾以產生其他多肽功能性片段、免疫原性片段、它們的變體、類似物或衍生物，從而實現本文所述的天然蛋白質的治療有用的性質。
[0113]因此，如本文所使用的，術語“免疫原性片段”是指T細胞和/或B細胞抗原受體識別的蛋白質部分。所述免疫原性部分一般包含至少5個氨基酸殘基，或可替代地至少6個，或可替代地至少7個，或可替代地至少8個，或可替代地至少9個，或可替代地至少10個，或可替代地至少11個，或可替代地至少12個，或可替代地至少13個，或可替代地至少14個，或可替代地至少15個，或可替代地至少16個，或可替代地至少17個，或可替代地至少18個，或可替代地至少18個，或可替代地至少19個，或可替代地至少20個，或可替代地至少25個，或可替代地至少30個，或可替代地至少50個，或可替代地至少100個本文所公開的CotH多肽的氨基酸殘基。可替代地，所述免疫原性部分可以包含至多5個氨基酸殘基，或可替代地至多6個，或可替代地至多7個，或可替代地至多8個，或可替代地至多9個，或可替代地至多10個，或可替代地至多11個，或可替代地至多12個，或可替代地至多13個，或可替代地至多14個，或可替代地至多15個，或可替代地至多16個，或可替代地至多17個，或可替代地至多18個，或可替代地至多18個，或可替代地至多19個，或可替代地至多20個，或可替代地至多25個，或可替代地至多30個，或可替代地至多50個，或可替代地至多100個本文所公開的CotH多肽的氨基酸殘基。在一些方面，免疫原性部分可以含有小的N和/或C末端片段(例如，5-30個氨基酸，優選10-25個氨基酸)。
[0114]多肽的修飾還可以包括其衍生物、類似物和功能性模擬物，只要這些多肽表現出毛霉菌CotH的生物活性。例如，衍生物可以包括多肽的化學修飾，如烷基化、酰基化、氨甲酰化、碘化或使多肽衍生化的任何修飾。這些衍生化分子包括(例如)其中自由氨基已衍生化形成胺鹽酸鹽、對 甲苯磺酰基、芐氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或醛基的那些分子。自由羧基能夠衍生化形成鹽、甲酯和乙酯或者其他類型的酯或酰肼。自由羥基能夠衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以衍生化形成N-咪唑-芐基組氨酸(N-1m-benzylhistidine)。作為衍生物或類似物,還包括含有二十種標準氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的那些肽，所述衍生物例如4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸或羧基谷氨酸，并且可以包括未通過肽鍵連接的氨基酸。只要維持毛霉菌CotH活性，則本發明的多肽還包括相對于序列如本文所示的多肽序列具有一個或多個殘基添加和/或缺失的任何多肽。
[0115]本發明提供了分離的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。本發明的毛霉菌CotH多肽可以通過本領域中熟知的多種方法分離，例如，重組表達系統、沉淀、凝膠過濾、離子交換、反相和親和色譜法等。其他熟知的方法描述于Deutscher等人，Guide toProteinPurification:Methods in Enzymology, Vol.182, (Academic Press, (1990))。作為另外一種選擇，可以使用熟知的重組方法獲得本發明的分離的多肽(參見，例如，Sambrook等人，同上，1989 ；Ausubel等人，同上，1999)。本領域技術人員可以選擇用于本發明多肽的生物化學純化的方法和條件，并且通過(例如)免疫學測定或功能性測定來監控純化。
[0116]制備本發明多肽的方式的實例是使用本領域中熟知的方法在適合的宿主細胞(如細菌細胞、酵母細胞、兩棲動物細胞(如卵母細胞)或哺乳動物細胞)中表達編碼毛霉菌CotH的核酸，并且再次使用如本文所述的熟知的純化方法回收所表達的多肽。可以直接從已用如本文所述的表達載體轉化的細胞中分離本發明的多肽。還可以將本發明的重組表達的多肽表達為具有適當親和標記的融合蛋白，所述標記如谷胱甘肽S轉移酶(GST)或多組氨酸，并親和純化。還可以通過化學合成產生本發明的多肽、生物學功能性片段及其功能等效物。例如，可以使用Applied Biosystems, Inc.430A或431A型自動肽合成儀(FosterCity, CA)并使用該生產商所提供的化學品產生合成多肽。
[0117]本發明還提供了單獨或彼此結合地含有可接受的載體和任何分離、純化的毛霉菌CotH成熟蛋白或其功能性多肽片段的組合物。這些多肽或蛋白可以重組得到，化學合成或純化自天然來源。如本文所使用的，術語“可接受的載體”包括任何標準藥物載體，如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳化液，如油水乳化液，和多種類型的潤濕劑。
[0118]因此，本發明提供了藥物組合物，其包含可藥用載體和化合物，所述化合物選自如本文所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、如本文所述的反義核酸或如本文所述的抗毛霉菌CotH抗體。本發明還提供了通過施用治療有效量的藥物組合物來治療或預防對其有需要的受試者中毛霉菌病的方法，所述藥物組合物包含可藥用載體和化合物，所述化合物選自如本文所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、如本文所述的反義核酸或如本文所述的抗毛霉菌CotH抗體。本發明還提供了通過施用治療有效量的如本文 所公開的疫苗組合物來治療或預防對其有需要的受試者中毛霉菌病的方法。
[0119]還提供了具有能夠與編碼毛霉菌CotH多肽的mRNA的全長或任意部分特異性結合從而防止所述mRNA翻譯的序列的反義核酸。所述反義核酸可以具有能夠與編碼毛霉菌CotH多肽的cDNA的序列的任意部分特異性結合的序列。如本文所使用的，短語特異性結合涵蓋了核酸序列識別互補核酸序列并通過互補堿基對之間氫鍵的形成與之形成雙螺旋部分的能力。反義核酸的實例是包含核苷酸化學類似物的反義核酸。
[0120]本發明提供了通過重組表達抑制編碼這些多肽的mRNA翻譯的毛霉菌CotH反義核酸或使用合成的反義核酸組合物(在下文稱為SANC)來調節毛霉菌CotH多肽表達水平的方式。構建了設計用于識別和選擇性結合至mRNA的合成寡核苷酸或其他反義核酸化學結構從而與毛霉菌CotH編碼鏈的全長或部分互補，所述毛霉菌CotH編碼鏈包括SEQ ID NO:
2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或 31 中所示的核苷酸序列。
[0121]SANC設計在血流中是穩定的以用于通過注射施用于受試者，或者在實驗室細胞培養條件下是穩定的。根據SANC的物理和化學性質，SANC設計能夠穿過細胞膜以進入到細胞的細胞質中，這使得它能夠(例如)通過設計小的疏水性SANC化學結構或者根據識別并將SANC轉運到細胞中的特異性轉運系統而穿過細胞膜。另外，通過靶向SANC從而被僅在所選細胞群體內結合并吸收SANC的特異性細胞吸收機制所識別，可以將SANC設計成僅施用至某些所選的細胞群體。在具體的實施方式中，SANC是反義寡核苷酸。
[0122]例如，SANC可以設計結合至僅在某些細胞類型中存在的受體，如以上所討論的。SANC還設計成識別并選擇性結合至靶標mRNA序列，所述序列對應于包含在SEQ ID NO:2、4、
6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31所示的序列內的序列。SANC設計使靶標mRNA序列失活，所述失活是通過與之結合并通過(例如)RNA酶I消化引起mRNA降解，或者是通過與翻譯調節因子或核糖體結合的干擾或包含其他化學結構(如降解或化學修飾靶標mRNA的核糖酶序列或反應性化學基團)來抑制mRNA靶標序列翻譯。已顯示當針對mRNA靶標時，SANC能夠勝任這些性質(參見Cohen等人，TIPS, 10:435(1989)和ffeintraub, Sc1.American, January(1990), pp.40)。
[0123]本文還提供了組合物，其包含對于通過進入細胞并特異性結合至編碼毛霉菌CotH多肽的mRNA以防止翻譯從而減少毛霉菌CotH多肽表達有效的量的本發明所述的反義核酸和能夠穿過細胞膜的可接受的疏水性載體。適合的疏水性載體描述于(例如)美國專利N0.5334761 ；4889953 ；4897355等。能夠穿過細胞膜的可接受的疏水性載體還可以包含結合至對所選細胞類型特異的受體并借此被所選細胞類型的細胞吸收的結構。
[0124]反義核酸組合物對于抑制編碼本發明多肽的mRNA的翻譯是有用的。合成寡核苷酸或其他反義化學結構設計結合至編碼毛霉菌CotH多肽的mRNA并抑制mRNA的翻譯，并且作為抑制組織樣品或受試者中毛霉菌CotH相關基因表達的組合物是有用的。
[0125]本發明還提供了通過在適合于毛霉菌CotH表達的條件下培養含有毛霉菌CotH核酸的細胞來表達毛霉菌CotH多肽的方法。因此，提供了通過在適合的宿主細胞中表達編碼毛霉菌CotH的核酸序列來重組產生本發明的毛霉菌CotH的方法。適合產生本文所述的毛霉菌CotH的重組DNA表達系統是本領域熟知的(參見，例如，Ausubel等人，如上，1999)。例如，可以將上述核苷酸序列引入到載體中以用于進一步操作。如本文所使用的，載體是指重組DNA或RNA質粒或含有用于將異源DNA引入到細胞中以用于它的表達或復制的分離的元件的病毒。
[0126]本發明還提供了含有本發明所述的毛霉菌CotH核酸的載體。適合的表達載體是本領域中熟知的并且包括能夠表達操縱性連接至調控序列或元件(如能夠調節該核酸的表達的啟動子區或增強子區)的核酸的載體。適合的表達載體包括在真核細胞和/或原核細胞中可復制的那些和仍保持游離的那些或整合至宿主細胞基因組的那些。
[0127]術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”表示通過它可以將核酸引入到宿主細胞的載體。載體可以用于增殖或攜帶核酸或用于編碼序列的多肽表達。多種載體在本領域中是已知的并且包括(例如)質粒、噬菌體和病毒。示例性載體可見于,例如，Sambrook等人，如上；Ausubel等人，如上。
[0128]根據調控性質，啟動子或增強子可以是組成型的或調控的。調控序列或調控元件操縱性地連接至本發明的核酸，從而使得所述核酸和所述調控序列之間的物理和功能關系允許所述核酸的轉錄。
[0129]適合于在原核或真核細胞中表達的載體對于本領域技術人員來說是熟知的(參見，例如，Ausubel等人，如上，1999)。用于在真核細胞中表達的載體可以包括(例如)調控元件，其包括SV40早期啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)類固醇可誘導啟動子、莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)啟動子等。本發明所述的載體對于亞克隆和擴增毛霉菌CotH核酸分子和對于重組表達毛霉菌CotH多肽是有用的。本發明的載體可以包括(例如)病毒載體，如噬菌體、桿狀病毒或反轉錄病毒；粘粒或質粒；并且具體對于克隆大核酸分子，細 菌人工染色體載體(BAC)和酵母人工染色體載體(YAC)。這些載體是可商購的，并且它們的使用在本領域中是熟知的。本領域技術人員將了解或可以容易地確定用于在具體的宿主細胞中表達的適合的啟動子。[0130]本發明還提供了含有本發明的毛霉菌CotH核酸的重組細胞。重組細胞是通過向宿主細胞引入含有毛霉菌CotH核酸分子的載體產生的。將重組細胞轉導、轉染或遺傳修飾。可以用于表達重組毛霉菌CotH分子的示例性宿主細胞包括哺乳動物原代細胞；既定的哺乳動物細胞系，如COS、CHO、HeLa, NIH3T3、HEK293和PC12細胞；兩棲動物細胞，如非洲爪蛙胚胎和卵母細胞；和其他脊椎動物細胞。示例性宿主細胞還包括昆蟲細胞如果蜆(Drosophila),酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces Pombe)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)和原核細胞如大腸桿菌(Escherichia coli)。
[0131]在一種實施方式中，本發明提供了具有免疫原性量的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或所述多肽的變體的疫苗組合物。所述疫苗組合物還可以包含佐劑。本發明的疫苗組合物的制劑在通過刺激特異性體液(中和抗體)和效應細胞介導的抗毛霉菌CotH多肽免疫應答來引起受試者中保護性免疫中是有效的。本發明所述的疫苗組合物還在真菌感染(如(例如)毛霉菌病)的治療或預防中使用。
[0132]本發明所述的疫苗將含有免疫保護量的毛霉菌CotH多肽抗原，并且它是通過本領域中公知的方法制備的。疫苗的制備一般性地描述于(例如)M.F.Powell和M.J.Newman主編，〃Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach),，’Plenum Press (1995)；A.Robinson, M.Cranage 和 M.Hudson 主編，“Vaccine Protocols (Methods in MolecularMedicine), ” Humana Press (2003)；和 D.0hagan 主編，“Vaccine Ajuvants: PreparationMethods and Research Protocols(Methods in Molecular Medicine), ”HumanaPress (2000)。
[0133]毛霉菌CotH多肽及其肽片段或變體可以包含免疫原性表位，并且可以使用本領域中已知且描述于(例如)Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3998 (1984)中的方法來鑒別所述免疫原性表位。簡言之，可以合成覆蓋靶標多肽(即毛霉菌CotH)整個氨基酸序列的數以百計的重疊短肽(例如，六肽)。當肽仍連接在用于它們合成的固體載體上時，使用多種抗血清通過ELISA法測試所述肽的抗原性。可以通過已知技術獲得抗毛霉菌CotH蛋白的抗血清，Kohler和Milstein，Nature256:495-499 (1975)，并且可以將其人源化以減少抗原性，參見，例如，美國專利N0.5693762，或者在留下未重排人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠中產生，參見，例如，美國專利N0.5877397。一旦鑒別了對抗完整蛋白的抗體具有六肽反應性的表位，就可以通過在每個位置的氨基酸取代和/或在C和/或N末端的延伸來進一步測試所述肽的特異性。這些具有表位的多肽通常含有至少6至14個氨基酸殘基，并且可以(例如)通過使用本領域中熟知的方法的多肽合成或通過將毛霉菌CotH多肽斷裂來產生。相對于用作依照本發明的免疫原的分子，本領域技術人員將認識到可以將毛霉菌CotH多肽截短或斷裂而不會損失作為免疫原性疫苗的基本質量。例如，可以通過從C末端截短將毛霉菌CotH多肽截短以產生N末端片段，同時保持了所述分子作為免疫原的功能性。類似地，可以通過從N末端截短來產生C末端片段，同時保持了所述分子作為免疫原的功能性。依照本發明，可以根據本文所提供的教導和指導做出其他修飾以產生其他毛霉菌CotH多肽功能性片段、免疫原性片段、它們的變體、類似物或衍生物，從而實現本文所述的天然蛋白質的治療有用的性質。
[0134] 本發明所述的疫苗組合物還含有常規的藥物載體。適合的載體對于本領域技術人員是熟知的。這些疫苗組合物可以制備成液體單位劑量形式。本領域技術人員可以容易地選擇其他任選的組分，例如，藥品級穩定劑、緩沖劑、防腐劑、賦形劑等。然而，在使用之前，所述組合物可以冷凍干燥和復原。作為另外一種選擇，所述疫苗組合物可以以適合于所選施用形式(例如，鼻內施用、口服施用等)的任何方式制備。充分考慮pH、等滲性、穩定性等，藥物可用的疫苗的制備在本領域的技術范圍內。
[0135]如果疫苗還包含佐劑物質，則本發明所述的疫苗組合物的免疫原性可以進一步提高。實現疫苗的佐劑效果的多種方法是已知的。一般原理和方法詳細描述于"The Theoryand Practical Application of Adjuvants' 1995, Duncan E.S.Stewart-Tull 主編，Johnffiley&Sons Ltd, ISBNO-471-95170-6 以及 〃Vaccines:New Generationn ImmunologicalAdjuvants", 1995, Gregoriadis G 等人主編，Plenum Press, New York, ISBN0-306-45283-9,兩篇文獻均作為參考并入本文。
[0136]優選的佐劑有利于通過抗原遞呈細胞(APC)(如樹突狀細胞)的疫苗分子吸收，并且激活了這些細胞。非限制性實例選自免疫靶向佐劑；免疫調節佐劑，如毒素、細胞因子和分枝桿菌衍生物；油制劑;聚合物;膠束形成佐劑；皂苷；免疫刺激復合基質(ISCOMd^S質)；粒子；DDA(雙十八烷基二甲基溴化銨)；鋁佐劑；DNA佐劑；和包囊佐劑。脂質體制劑也已知會賦予佐劑作用，并因此根據本發明包括了脂質體佐劑。
[0137]除了對真菌感染(如毛霉菌病)敏感的受試者接種疫苗外,本發明的疫苗組合物可以用于免疫治療性地治療患有多種真菌感染的受試者。因此，含有與佐劑結合的本文所述的一種或多種毛霉菌CotH多核苷酸、多肽和/或抗體組合物并且起到預防或治療使用目的疫苗也在本發明的范圍內。在一種 實施方式中，本發明的疫苗將誘導身體自身的免疫系統去找到并抑制毛霉菌CotH分子。
[0138]如本文所使用的，術語“疫苗”是指可以施用于受試者以保護個體抵抗傳染病的組合物。疫苗通過引起或提高動物中對傳染病的免疫應答來保護不受疾病影響。受使用本發明所述疫苗的治療法的作用的示例性傳染病是毛霉菌病。當受試者受(例如)毛霉菌CotH或其免疫原性部分或片段的攻擊時，疫苗介導的保護可以是在宿主中引起的體液和/或細胞免疫。
[0139]術語“佐劑”旨在表示一般通過與抗原一起遞送到抗原位點處或附近并具有提高對抗原的免疫應答的能力的組合物。通過免疫介導的保護的提高來顯示提高免疫應答的能力。可以通過(例如)抗體抗抗原的滴度的提高來確定體液免疫的提高。可以通過(例如)陽性皮試、細胞毒T細胞測定、用于IFN- Y或IL-2的ELISP0T測定來測量細胞免疫的提高。佐劑在本領域中是熟知的。示例性佐劑包括(例如)弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁佐劑、MF59和QS21。
[0140]如本文所使用的，術語“治療”旨在表示指示真菌病癥的臨床癥狀的改善。臨床癥狀的改善包括(例如)與治療前水平相比或與患有真菌病癥的個體相比，受治療的個體中真菌病癥的至少一種癥狀的減少或減輕。術語“治療”還旨在包括與真菌病癥有關的病理病癥、慢性并發癥或機會致病菌真菌感染的嚴重性的降低。以下對于毛霉菌病舉例說明了這些病理學病癥、慢性并發癥或機會致病菌感染。毛霉菌病及其他這些病理學病癥、慢性并發癥和機會致病菌感染還可見于(例如)Merck Manual,第16版，1992和Spellberg等人，Clin.Microbi0.Rev.18:556-69(2005)。[0141]如本文所使用的，術語“預防”旨在表示指示真菌病癥的臨床癥狀的預防。這種預防包括(例如)在發展出明顯病癥癥狀之前或在病癥診斷之前在具有真菌感染風險的個體中維持正常的生理學指示物。因此，術語“預防”包括個體的預防性治療以保護他們不會發生真菌病癥。個體中真菌病癥的預防還旨在包括抑制或中止真菌病癥的發展。抑制或終止所述病癥的發展包括(例如)抑制或終止異常生理學指征或臨床癥狀的發生，如以上所述和/或在本領域中公知的那些。因此，真菌病癥的有效預防將包括在對真菌病癥易感的個體中正常體溫、體重、心理學狀態的維持以及病變或不具有其他病理表現。對真菌病癥易感的個體包括免疫受損的個體，例如，但不限于，患有AIDS、氮血癥、糖尿病、糖尿病性酮酸中毒、嗜中性白血球減少癥、支氣管擴張、肺氣腫、TB、淋巴瘤、白血病或燒傷的個體，或者經歷化療、骨髓、干細胞和/或固體器官移植的個體或者具有對真菌病癥敏感史的個體。抑制或終止病癥的發展還包括，例如，抑制或終止與真菌病癥有關的一種或多種病理學病癥、慢性并發癥或對機會致病菌感染的敏感性的發展。
[0142]在本文中“受試者”、“個體”或“患者”可互換使用，并且是指脊椎動物，優選地哺乳動物，更優選地人。哺乳動物包括(但不限于)鼠、大鼠、兔、猴、牛、羊、豬、犬、貓、農畜、運動動物、寵物、馬和靈長類，具體地人。
[0143]如本文所使用的，術語“真菌病癥”是指真菌疾病、感染或定殖，其包括淺部真菌病(即，皮膚、毛發、指甲和粘膜的真菌疾病；例如，癬或酵母感染)、皮下真菌病(即皮下組織、筋膜和骨的真菌疾病；例如，足分枝菌病、著色真菌病或孢子絲菌病)和全身性真菌病(即一般由吸入病因霉菌所產生的空氣傳播的孢子所造成的深層真菌感染；例如，接合菌病、曲霉病、隱球菌病、念珠菌病、組織胞漿菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、鐮刀菌病(明色絲菌病)、芽生菌病、青霉病或孢子絲菌病)。 [0144]如本文所使用的，術語“接合菌病”旨在表示由接合菌綱的真菌(包括毛霉菌目和蟲霉目)所造成的真菌病癥。蟲霉目是造成被稱為蟲霉病的皮下和粘膜皮膚感染的原因，它在很大程度上使發展中國家具有免疫能力的宿主痛苦。接合菌病也被稱為毛霉菌病，并且這兩個術語可互換使用以表示相似類型的真菌感染。
[0145]如本文所使用的，術語“毛霉菌病”旨在表示由毛霉菌目真菌所引起的真菌病癥。毛霉菌病是危急生命的真菌感染，它幾乎同樣地影響了發展中國家和工業化國家中免疫能力受損的宿主。將屬于毛霉菌目的真菌分為至少6類，它們全部可以導致皮膚和深層感染。相比于任何其他科，從患有毛霉菌病的患者中更經常分離出屬于毛霉菌科的種。在毛霉菌科中，米根霉(少根根霉)是常見的感染原因。引起相似感染譜的毛霉菌科的其他示例性種包括(例如)小抱根霉須狀變種(Rhizopusmicrosporus var.rhizopodiformis)、傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)、Apophysomyces elegans、毛霉菌種(Mucor species)、微小根毛霉(Rhizomucor Pusillus)和小坎寧安霉種(Cunninghamella spp)(小克銀漢霉科(Cunninghamellaceae family))。毛霉菌病在本領域中是熟知的并且包括,例如,鼻腦毛霉菌病、肺毛霉菌病、胃腸毛霉菌病、播散性毛霉菌病、骨毛霉菌病、縱隔毛霉菌病、氣管毛霉菌病、腎毛霉菌病、腹膜毛霉菌病、上腔靜脈毛霉菌病或外耳炎毛霉菌病。
[0146]目前，將屬于毛霉菌目的真菌分為棄霉科(Choanephoraceae);小克銀漢霉科(Cunninghamellaceae);毛霉科(Mucoraceae) ；Mycotyphaceae 科(Mycotyphaceae)；Phycomycetaceae 科(Phycomycetaceae);水玉霉科(Pilobolaceae)；瓶霉科(Saksenaeaceae);共頭霉科(Syncephalastraceae)；和 Umbelopsidaceae 科(Umbelopsidaceae)。這些真菌科分別由一個或多個屬組成。例如，屬于毛霉菌目毛霉菌科的真菌進一步分類為以下屬:犁頭霉屬(例如，傘枝擬青霉(A.corymbifera));放射毛霉屬(例如，雅致放射毛霉(A.elegans));淀粉霉屬(例如，淀粉絲菌(A.rouxii));囊托霉(Apophysomyces);巴克斯霉屬(例如，巴克斯毛霉(B.circina)) ;Benjaminiella 屬(例如，B.multispora);絲枝霉屬(例如，布雷絲枝霉(C.brefeldii));卷霉屬(例如，安地卷霉(C.angarensis));科克霉屬(例如，屈彎科克霉(C.recurvatus)) ；Dicranophora屬(例如，D.fulva) ;Ellisomyces屬(例如，E.anomalus);卷枝霉屬(例如，雅致卷枝霉(H.elegans));生絲毛霉屬(例如，H.assamensis) ;Kirkomyces 屬(例如，K.cordensis)；毛霉屬(例如,M.amphibiorum);寄生霉屬(例如，寄生疫霉(P.parasitica)) ；Phi1phora屬(例如，P.agaricina) ;Pilaira屬(例如，P.anomala);小梨形菌屬(例如，旋枝霉(P.circinans));根毛霉屬(例如，內生根毛霉(R.endophyticus)) ;Rhizopodopsis 屬(例如，R.javensis);根霉屬；擬小孢霉屬(例如，傘擬小孢霉(S.umbel lata));聯軛霉屬(例如，大孢聯軛霉(S.megalocarpus));枝霉屬(例如，T.elegans) ;Thermomucor 屬(例如，T.1ndicae-seudaticae);和接霉屬(例如，Z.californiensis)。根霉屬(例如)包括無接合抱子根霉(R.azygosporus) ;R.caespitosus ;同合根霉(R.homothallicus);米根霉(R.0ryzae);小抱根霉(R.microsporus)、小抱根霉須狀變種(R.microsporus var.rhizopodiformis)和希伯來根霉(R.schipperae)種。
[0147]如本文所使用的，術語“免疫原性的量”是指本發明的多肽或其片段或變體的特定表位可以引起宿主針對所述多肽或表達所述多肽的傳染物的免疫應答的有效量。這個量通常在20 μ g到IOmg抗原每劑量疫苗的范圍內并取決于要治療的受試者，受試者免疫系統合成抗體的能力和所需的保護程度。所需的免疫原的精確量可以通過多種方法來計算，如(例如)抗體滴度。術語有效量是指化合物或組合物足以提供所需效果的量。因此，如用于描述疫苗，有效量是指化合物或組合物(例如，抗原)足以產生或引起保護性免疫應答的量。相對于免疫組合物 的有效量是足以引起免疫應答的量，而不管所述應答是否是保護性的。
[0148]“治療有效量”將基于多肽、多核苷酸、抗體、抗體片段或組合物、疾病及其嚴重程度和要治療的患者的年齡、體重等而改變，所有這些均在主治臨床醫師的技術范圍內。已考慮與沒有進行治療的相比，治療有效量的一種或多種本文所述的多核苷酸、多肽、抗體、抗體片段或組合物將改變患者中真菌病原體的滲透通過以及內皮細胞的損害。照此，真菌的病理發生會減少。治療有效量與具有生物學作用的量(“生物學有效量”)是可區分的。本發明的多肽、多核苷酸、抗體、抗體片段或組合物可以具有一種或多種體外或甚至體內生物學作用，如降低毛霉菌CotH多肽的功能。然而，生物學作用可能不會導致任何如本文所述的臨床可測量的治療作用，如通過主治臨床醫師技術范圍內的方法所確定的。
[0149]在一種實施方式中，可以使用本領域熟知的適合的載體將編碼本發明的毛霉菌CotH多肽的核酸體內或體外遞送到哺乳動物細胞中。適合于將毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段遞送至哺乳動物細胞的載體包括病毒載體如反轉錄病毒載體、腺病毒、腺病毒相關病毒、慢病毒、皰疹病毒和非病毒載體，如質粒載體。這些載體對于提供治療或免疫原性量的毛霉菌CotH多肽是有用的(參見，例如，1995年3月21日授權的美國專利申請N0.5399346)。當靶向肌肉細胞、骨髓細胞或B細胞時，毛霉菌CotH多肽或核酸的治療性遞送可以是特別有用的，借此提供所編碼的毛霉菌CotH多肽用于發展免疫應答。這種提供通常在本領域中作為DNA疫苗是已知的。
[0150]病毒基系統提供了能夠將相對高水平的異源核酸引入到多種細胞中的優勢。用于將本發明的編碼毛霉菌CotH蛋白的核酸引入到哺乳動物細胞中的適合病毒載體在本領域中是熟知的。這些病毒載體包括，例如，單純皰疹病毒載體(Geller 等人，Science, 241:1667-1669 (1988));牛痘病毒載體(Piccini 等人，Meth.Enzymology, 153:545-563 (1987));巨細胞病毒載體(Mocarski 等人，Viral Vectors.Y.Gluzman 和 S.H.Hughes, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, pp.78-84));莫洛尼小鼠白血病病毒載體(Danos 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 85:6460-6464(1988) ；Blaese 等人，Science, 270:475-479 (1995) ；Onodera 等人，J.Virol.，72:1769-1774 (1998));腺病毒載體(Berkner, Biotechniques, 6:616-626 (1988) ；Cotton 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:6094-6098 (1992) ；Graham 等人，Meth.Mol.Biol., 7:109-127 (1991) ；Li 等人，Human Gene Therapy, 4:403-409(1993) ； Zabner等人，Nature Genetics, 6:75-83 (1994));腺病毒相關病毒載體(Goldman 等人,HumanGene Therapy, 10:2261-2268(1997) ；Greelish 等人，Nature Med.，5:439-443(1999)；Wang 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 96: 3906-3910 (1999) ；Snyder 等人，NatureMed.，5:64-70 (1999) ；Herzog 等人，Nature Med.，5:56-63 (1999));反轉錄病毒載體(Donahue 等人，Nature Med., 4:181-186 (1998) ；Shackleford 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 85:9655-9659 (1988);美國專利 N0.4405712,4650764 和 5252479 和 WIPO 公開W092/07573、W090/06997、W089/05345、W092/05266 和 W092/14829 ;和慢病毒載體(Kafri等人，Nature Genetics, 17:314-317 (1997))。
[0151]對于核酸的毛霉菌CotH多肽的治療性施用有用的載體可以含有提供操縱性連接的核酸的組織特異性或可誘導表達的調控元件。本領域技術人員可以容易地確定允許毛霉菌CotH多肽或核酸在所需組織或細胞中表達的適當的組織特異性啟動子或增強子。任何多種可誘導啟動子或增強子還可以包括在用于毛霉菌CotH多肽或核酸的可調控表達的載體中。這些誘導系統包括,例如，四環素誘導系統(Gossen&Bizard, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:5547-5551(1992) ；Gossen 等人，Science, 268:1766-1769(1995) ；Clontech, PaloAlto, CA);重金屬誘導的金屬硫蛋白啟動子；對蛻皮激素或相關類固醇響應的昆蟲類固醇激素，如米樂甾酮(No 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 93:3346-3351 (1996) ;Yao 等人，Nature, 366:476-479 (1993) ；Invitrogen, Carlsbad, CA);通過類固醇(如糖皮質激素和雌激素)誘導的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV) (Lee等人，Nature，294:228-232 (1981));和通過溫度改變可誘導的熱沖擊啟動子。
[0152]對于治療性施用特別有用的誘導系統使用了可誘導啟動子，可以調節所述啟動子從而對施用于個體的給定水平的藥物響應來遞送一定水平的治療性產品并且在不存在所述藥物時所述治療性產品很少表達或不表達。一個這種系統使用了修飾的腺病毒載體中的通過抗孕酮(如米非司酮)可誘導的Gal4融合蛋白(Burien等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，96:355-360 (1999))。另一種這種誘導系統使用藥物雷帕霉素來誘導腺病毒相關病毒載體中含有FKBP12和FRAP的雷帕霉素結合域的轉錄激活因子的重建(Ye等人，Science, 283:88_91 (1999))。應理解可以將誘導系統的任意組合合并在任何適合的載體中，包括本文所公開的那些。這種可調控的誘導系統是有利的，這是因為可以通過施用于所述個體的藥物的量來控制治療性產品的表達水平，或者如果需要，可以通過終止所述藥物的施用來終止治療性產品的表達。
[0153]本發明另外提供了分離的抗毛霉菌CotH抗體，所述抗體對毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段具有特異反應性。例如，本發明的抗毛霉菌CotH抗體可以對具有氨基酸序列 GAGKKHNNAKQSWNW (SEQ ID NO:39)或 MGQTNDGAYRDPTDNNK (SEQ ID NO:40)的多肽具有特異反應性。抗毛霉菌CotH抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本發明還提供了產生對毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段具有特異反應性的單克隆抗體的細胞系。
[0154]因此，本發明提供了特異性結合毛霉菌CotH多肽的抗體。如本文所使用的，術語“抗體”以其最廣泛的含義用于包括多克隆和單克隆抗體以及這些抗體的抗原結合片段。對于本發明的抗毛霉菌CotH抗體，術語“抗原”表示天然或合成的毛霉菌CotH多肽或其片段。抗毛霉菌CotH抗體或這種抗體的抗原結合片段的特征在于對毛霉菌CotH多肽或其肽部分具有至少約IXlO5M-1的特異結合活性。因此，抗毛霉菌CotH抗體的Fab、F (ab’)2、Fd和Fv片段保留了對毛霉菌CotH多肽的特異結合活性，并且它們包括在抗體的定義內。本領域技術人員可以容易地確定毛霉菌CotH多肽的特異結合活性，例如，通過將抗毛霉菌CotH抗體對毛霉菌CotH多肽的結合活性與非毛霉菌CotH多肽的對照多肽相比較。制備多克隆或單克隆抗體的方法對于本領域技術人員來說是熟知的(參見，例如，Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)) ?
[0155]另外，本發明的抗體可以是天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括，例如，單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體和人源化抗體及其抗原結合片段。可以使用固相肽合成構造，可以通過重組產生或者可以通過(例如)由可變重鏈和可變輕鏈組成的組合篩選文庫(如通過Huse等人所述(Huse等人,Science246:1275-1281 (1989)))獲得這些非天然存在的抗體。制備(例如)嵌合抗體、人源化抗體、CDR接枝抗體、單鏈抗體和雙功能抗體的這些及其他方法對于本領域技術人員來說是熟知的(Winter和Harris, Immunol.Todayl4:243-246 (1993) ；ffard 等人，Nature341:544-546 (1989) ；Harlow 和 Lane,如上，1988) ；HiIyard 等人，ProteinEngineering:A practical approach (IRL Pressl992)；Borrabeck, AntibodyEngineering,第 2 版，(Oxford University Pressl995))。
[0156]可以使用毛霉菌CotH 免疫原，如具有 SEQ ID NO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、
26、28 、30或32所示的氨基酸序列的分離的毛霉菌CotH多肽或其免疫原性片段(其可以從天然來源制備或通過重組產生)或毛霉菌CotH多肽的肽部分來產生抗毛霉菌CotH抗體。如果抗原肽可以用于產生毛霉菌CotH特異性抗體，則毛霉菌CotH多肽的這些肽部分是功能性抗原片段。可以通過將半抗原與載體分子，如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍素(KLH)偶聯來使得非免疫原性或弱免疫原性毛霉菌CotH多肽或其部分具有免疫原性。因此，在本發明的一些方面，本文所公開的CotH多肽的免疫原性片段可以結合至載體分子，如，但不限于KLH或BSA。多種其他載體分子和用于將半抗原偶聯至載體分子的方法在本領域中是熟知的(參見，例如，Harlow和Lane，如上，1988)。還可以通過將所述肽部分表達為與(例如)谷胱甘肽S轉移酶(GST)、多聚組氨酸等的融合蛋白來產生免疫原性毛霉菌CotH多肽片段。用于表達肽融合蛋白的方法對于本領域技術人員來說是熟知的(Ausubel等人，如上)。
[0157]本發明還提供了檢測樣品中毛霉菌目生物存在的方法，該方法是通過將樣品與毛霉菌CotH特異性抗體接觸并檢測抗體與樣品的特異性結合的存在，借此檢測樣品中毛霉菌CotH多肽的存在進行的。毛霉菌CotH特異性抗體可以在診斷方法和系統中使用以檢測樣品中存在的毛霉菌CotH的水平。如本文所使用的，術語“樣品”旨在表示包含或可能包含毛霉菌CotH核酸或多肽的任何生物流體、細胞、組織、器官或其部分。該術語包括存在于個體中的樣品以及得自或來源于所述個體的樣品。例如，樣品可以是通過活組織檢查獲得的樣品的組織切片或者是放置在或適應于組織培養的細胞。樣品還可以是亞細胞部分或提取物，或者是粗的或基本純化的核酸或蛋白質制備物。
[0158]毛霉菌CotH特異性抗體還可以用于本發明的毛霉菌CotH的免疫親和或親和色譜法純化。另外，在本文中考慮了用于檢測細胞中本發明的毛霉菌CotH蛋白的存在的方法，其包括在允許抗體與毛霉菌CotH多肽結合的條件下將細胞與特異性結合至毛霉菌CotH多肽的抗體接觸，檢測結合至毛霉菌CotH多肽的抗體的存在，并借此檢測細胞中本發明的多肽的存在。就這些多肽的檢測而言，所述抗體可以用于體外診斷或體內成像方法。
[0159]用于樣品中靶標毛霉菌CotH多肽的體外檢測的免疫學程序包括使用可檢測的抗體的免疫測定。這些免疫測定包括，例如，免疫組織化學、免疫熒光、ELISA測定、放射免疫測定、FACS分析、免疫沉淀、免疫印跡分析、Pandex微量熒光測定、凝集測定、流式細胞術和血清診斷測定，它們在 本領域中是公知的(Harlow和Lane,如上，1988 ；Harlow和Lane, UsingAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999))。
[0160]通過本領域中熟知的多種方式可以使抗體是可檢測的。例如,可以直接將可檢測的標志物連接到抗體上或者使用(例如)識別毛霉菌CotH特異性抗體的第二試劑間接連接。有用的標志物包括(例如)放射性核苷酸、酶、結合蛋白，如生物素、熒光團、發色團和化學發光標記物。
[0161]如本文所使用的，術語標記物以及在它們多種語法形式中的指示方式表示直接或間接參與可檢測信號產生的單個原子和分子。任何標記物或指示方式可以與本發明的核酸探針、所表達的蛋白質、多肽片段或抗體分子有關。這些原子或分子可以單獨使用或與其他試劑一起使用。這些標記物本身在臨床診斷化學中是熟知的。
[0162]標記方式可以是熒光標記劑，所述熒光標記劑化學結合至抗體或抗原而不發生變性從而形成作為有用的免疫熒光示蹤劑的熒色物(染料)。免疫熒光分析技術的說明可見于 DeLuca, ^Immunof luorescence Analysis' Antibody As a Tool, Marchalonis 等人主編,John ffiley&Sons, Ltd.，pp.89-231 (1982)，該文獻作為參考并入本文。
[0163]在一種實施方式中，指示組是酶，如辣根過氧化酶(HRP)、葡萄糖氧化酶等。在另一種實施方式中，使用放射性元素作為標記劑。標記物與底物的連接，即核酸探針、抗體、多肽和蛋白質的標記在本領域中是熟知的。例如，可以通過培養基中所提供的放射性標記的氨基酸的代謝摻入來標記本發明的抗體。參見，例如，Galfre等人，Meth.Enzymol.，73:3-46(1981)。通過活化的官能團的蛋白質結合或偶聯的傳統方法是特別適用的。參見，例如，Aurameas 等人，Scand.J.1mmunol., Vol.8, Supp1.7:7-23 (1978)，Rodwell等人，Biotech.,3:889-894(1984)和美國專利 N0.4493795。[0164]本發明的核酸、寡核苷酸，包括反義寡核苷酸、含有本發明的核酸的載體、轉化的宿主細胞、多肽及其組合以及本發明的抗體，可以用于篩選化合物以確定化合物是否起到本發明多肽的可能的激動劑或拮抗劑的作用。這些篩選測定提供了有關本發明的多肽的功能和活性的信息，它可以導致能夠與一種或多種類型的多肽、肽或蛋白質特異性相互作用的化合物的鑒別和設計。
[0165]因此，本發明提供了鑒別結合至毛霉菌CotH多肽的化合物的方法。本發明的蛋白質可以在競爭性結合測定中使用。這種測定可以接受多個化合物的快速篩選以確定能夠結合至毛霉菌CotH多肽的化合物(如果有)。隨后，可以對發現結合的那些化合物進行更詳細的測定，以進一步確定這些化合物是否作為本發明的毛霉菌CotH多肽的調節劑、激動劑或拮抗劑。結合至和/或調節本發明的毛霉菌CotH多肽的化合物可以用于治療通過本發明的毛霉菌CotH多肽介導的多種病理。
[0166]鑒別與蛋白結合域相互作用的細胞蛋白質的多種結合測定是本領域中已知的，并且包括(例如)酵母雙雜交篩選測定(參見，例如，美國專利N0.5283173、5468614和5667973 ；Ausubel 等人，如上，1999 ；Luban 等人，Curr.0pin.Biotechnol.6:59-64(1995))和使用細胞提取物的親和柱色譜法。通過合成或表達含有多個毛霉菌CotH序列或缺失的多肽片段，可以容易地鑒別毛霉菌CotH的結合界面。
[0167]在本發明的另一種實施方式中，提供了鑒別調節本發明的毛霉菌CotH多肽活性的化合物的生物測定。根據該方法，在(例如)存在對毛霉菌CotH信號通路響應的報告基因構建體的情況下，使本發明的多肽與“未知”或測試物質接觸，在與“未知”或測試物質接觸后監控所述多肽的活性，并且將導致報告基因構建體表達的那些物質鑒別為毛霉菌CotH多肽的功能性配體。這些報告基因測定和系統對于本領域技術人員來說是公知的(Ausubel等人，如上，1999)。 另外，可以使用毛霉菌CotH的啟動子區來產生報告基因構建體并且篩選提高或降低毛霉菌CotH基因啟動子活性的化合物。這些化合物還可以用于改變毛霉菌CotH的表達。
[0168]根據本發明的另一種實施方式，重組表達本發明的多肽的轉化的宿主細胞可以與測試化合物接觸，并且然后可以通過比較毛霉菌CotH介導的響應(例如，通過在存在和不存在測試化合物的情況下報告基因的表達或者通過比較測試細胞或對照細胞對化合物的存在的響應)來評價它的調節作用。
[0169]如本文所使用的，調節本發明多肽活性的化合物或信號是指改變毛霉菌CotH多肽活性從而使得本發明多肽的活性在存在所述化合物或信號時與不存在所述化合物或信號時相比不同的化合物或信號。具體地，這些化合物或信號包括激動劑和拮抗劑。激動劑涵蓋了激活毛霉菌CotH蛋白表達或生物活性的化合物或信號。作為另外一種選擇，拮抗劑包括干擾毛霉菌CotH表達或生物活性的化合物或信號。通常，拮抗劑的作用觀察為阻止激動劑誘導的蛋白的激活。拮抗劑包括競爭性和非競爭性拮抗劑。
[0170]鑒別調節毛霉菌CotH多肽表達的化合物的測定可以包括檢測毛霉菌CotH多肽豐度對所述細胞與調節毛霉菌CotH活性的化合物接觸響應的變化。用于檢測多肽表達變化的測定包括(例如)使用毛霉菌CotH特異性毛霉菌CotH抗體的免疫測定，如免疫印跡法、免疫熒光法、免疫組織化學法和免疫沉淀測定，如以上所述的。
[0171]如本領域技術人員所理解的，用于鑒別調節毛霉菌CotH活性的化合物的測定方法通常需要與對照進行比較。一種類型的“對照”是與暴露于所述化合物的測試細胞或試驗培養物基本相同地處理的細胞或培養物，其區別在于“對照”細胞或培養物不暴露于所述化合物。另一種類型的“對照”細胞或培養物可以是與測試細胞相同的細胞或培養物，除了“對照”細胞或培養物不表達毛霉菌CotH多肽之外。因此，將轉染細胞對化合物的響應與相同反應條件下“對照”細胞或培養物對相同化合物的響應或缺少響應相比較。
[0172]本發明還提供了通過將毛霉菌CotH多肽與有效調節量的調節毛霉菌CotH活性的試劑接觸來調節毛霉菌CotH多肽介導的活性的方法。毛霉菌CotH活性可以是(例如)與GRP78的結合。本發明還提供了調節與細胞粘附的水平的方法。
[0173]在一些實施方式中，本發明提供了檢測樣品中毛霉菌CotH核酸分子的方法。本發明的這些方法可以包括以下步驟:將樣品與本文所公開的兩種或更多種寡核苷酸接觸，擴增核酸分子，并且檢測所述擴增。應理解用于擴增核酸的方法對于本領域技術人員來說是公知，可以容易地選擇所述方法并將其應用于本發明所述的方法。例如，在一些方面，使用聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增。在本發明的一些方面，在本發明所述的方法中使用的兩種或更多種寡核苷酸中的至少一種包括具有以下核酸序列的寡核苷酸:ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO:36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC (SEQ ID NO:37)，或者本文所公開的任何寡核苷酸。
[0174]本發明還提供了通過檢測來自患者的樣品中是否存在毛霉菌目生物來診斷受試者中毛霉菌病感染的方法。所述方法可以包括以下步驟:(a)提供來自受試者的測試樣品；(b)使所述樣品與可以在適合的條件下結合本發明的核酸或多肽的試劑接觸，其中所述條件允許所述試劑與所述核酸或多肽特異性結合；和(C)將測試樣品中特異性結合的量與對照樣品中特異性結合 的量相比較，其中與對照樣品相比，測試樣品中特異性結合的量的增加或減少是對毛霉菌病感染的診斷。在本發明的一些方面，所述試劑選自如本文所述的抗毛霉菌CotH抗體或CotH寡核苷酸。
[0175]根據本發明的另一種實施方式，提供了診斷系統，優選地以試劑盒形式提供，其包含處于適合的包裝材料中的至少一種本發明的核酸或抗體。含有核酸的診斷試劑盒來源于本文所述的毛霉菌CotH編碼核酸。在一種實施方式中，例如，所述診斷核酸來源于 SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或 31 中的任一種并且可以是本發明的寡核苷酸。在本發明的一些方面，至少一種寡核苷酸包括選自下列的核酸序列:ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC (SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA (SEQ ID NO:36)、AAACGTACCTGCTGACCGAATC (SEQ ID NO:37)，或者本文所公開的任何寡核苷酸。本發明的診斷系統對于測定基因組DNA或mRNA中編碼毛霉菌CotH的核酸存在與否是有用的。
[0176]適合的診斷系統包括以足以進行至少一種測定的量作為單獨包裝的化學試劑的至少一種本發明的核酸或抗體。對于含有本發明的核酸的診斷試劑盒，所述試劑盒通常含有兩種或更多種核酸。當所述診斷試劑盒將在PCR中使用時，所述試劑盒將含有可以用作PCR引物的至少兩種寡核苷酸。本領域技術人員可以容易地將本發明的核酸探針和/或引物或本發明的抗體與用于實踐如本文所述的本發明方法的適合的緩沖液和溶液結合來合并到試劑盒形式。含有毛霉菌CotH抗體的試劑盒可以含有提供進行測定(例如，ELISA或其他免疫測定)的適合條件的反應混合物以用于確定樣品中毛霉菌CotH多肽的表達水平，并且所述試劑盒可以含有對照樣品，所述對照樣品含有已知量的毛霉菌CotH多肽以及(如果需要)對抗毛霉菌CotH抗體特異的第二抗體。
[0177]本發明的試劑盒的內容物，例如，毛霉菌CotH核酸或抗體包含在包裝材料中，優選地以提供無菌、無污染的環境。另外，包裝材料含有顯示可以如何使用試劑盒內材料來檢測特定毛霉菌CotH序列或毛霉菌CotH多肽的存在與否或者診斷與毛霉菌病有關的病癥的存在或易患性的說明。使用說明通常包括描述試劑濃度或者至少一種測定方法參數的明確表達，如要混合的試劑和樣品的相對量、試劑/樣品混合物的維持時間、溫度、緩沖條件等。
[0178]應理解在本文所提供的本發明的定義內還提供了基本上不影響本發明的多個實施方式的活動的修改。因此，以下實施例旨在說明但不限制本發明。
[0179]實施例1
[0180]細胞表面CotH3蛋白有利于在內皮細胞的真菌侵襲期間結合至宿主GRP78
[0181]從米根霉(R.0ryzae)幼殖體的原生質體的上清液收集細胞壁材料。通過使用抗Grp78Ab的遠端免疫印跡分析分離結合至rGrp78的米根霉(R.0ryzae)配體并通過MALD1-TOF-MS/MS分析鑒別(圖1)。簡言之，切下所關心的蛋白質斑點并送至UCLA ff.M.Keck蛋白質組學中心進行鑒定，該鑒定是在配備有Eksigent (Dublin, CA)NanoLiquid 色譜-1D plus 系統和 Eksigent 自動取樣器的 Thermo LTQ-Orbitrap XL 質譜儀(San Jose, CA)上進行的。將斑點內的蛋白質膠內胰蛋白酶消化，如Shevchenko等人所述(Shevchenko 等人，(1996).Proc Natl Acad Sci U S A93:14440-14445 ；Shevchenko 等人,Anal.Chem., 68 (5): 850-8 (1996)) ? 將洗脫的月太加載到 CVCMicrotech (Fontana, CA) 35mm 長，100 μ m ID 的 C18 預捕集柱上，并用 100% 緩沖液 A (含有0.1%甲酸的2%乙腈)以5μ 1/min的流速清洗10分鐘。使用300nl/min的流速,將肽在 15cm New Objective ProteoPep IntegraFrit 柱(Woburn, MA)上分離。使用了以下洗脫梯度:0-15分鐘，0-30%緩沖液B (含有0.1%甲酸的98%乙腈)，15-20min30_80%緩沖液B，和20-22分鐘80%緩沖液B。然后，將柱用緩沖液A再平衡13分鐘。使用2300V的電噴霧電離電壓，45V的毛細管電壓，130V的管鏡電壓和200°C的毛細管溫度，將洗脫分析物以正離子模式噴霧到LTQ-Orbitrap MS中。進行了信息關聯采集(Information dependentacquisition)，其中使用60K分辨率的FTMS掃描在300-1600的m/z范圍內選擇了 6個最強烈的離子，并使用歸一化碰撞能源為35的寬帶碰撞誘導裂解和LTQ檢測對它們進行MS-MS。從進一步的MS-MS的60秒的一段時間內排除了峰。
[0182]使用Matrix Science MASCOT Daemon 搜索引擎(Boston, MA)，對米根霉(Rhizopusoryzae)99-880 數據庫(http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/rhizopus_oryzae/multihome.html)查詢所得的MS/MS光譜。使用了以下查詢參數:肽容差:±1(^111，1^/^容差:±0.3Da，最大漏切位點:2，固定修飾:羧甲基(C)和可變修飾:脫酰胺(ND)和氧化(M)。在特定項目內鑒別的蛋白質包括具有排名第I的最少兩種唯一的肽的那些和離子得分P〈0.05的那些。
[0183]通過RT-PCR檢測了與內皮細胞培育的米根霉(R.0ryzae)中假定配體的表達(圖4)。通過在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中異源表達配體確認了配體與GRP78的相互作用(圖6)，并且將它對內皮細胞和過表達GRP78的CHO細胞的粘附和侵襲與用空質粒轉化的釀酒酵母(s.cerevisiae)(對照)相比較(圖8)。
[0184]三種ORF與來自幾株菌的與孢壁形成有關的CotH蛋白家族具有同源性:
[0185]〇R03G_05018，CotHl
[0186]O R03G_08029, CotH2
[0187]O R03G_11882, CotH3
[0188]第四種0RF(R03G_16295)廣泛存在于其他病原真菌中，但是看起來這些ORF中無一編碼具有鑒別功能的蛋白。已鑒別的CotH多肽及其他細菌CotH蛋白之間的序列比較顯不了極小的序列同一'I"生(圖17和表1)。
[0189]表1.根霉菌屬CotH和細菌CotH的序列相似性(不同大小)
[0190]
【權利要求】
1.一種編碼毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段、或其功能性片段的分離的核酸。
2.一種編碼毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段、或其功能性片段的分離的核酸，包含選自下列的核酸: (a)編碼SEQ IDNO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 中所示的氨基酸序列的核酸，或 (b)在中等嚴格條件下雜交至所述核酸的核酸，其中所述核酸連續編碼生物學活性的毛霉菌CotH多肽，或 (c)相對于上述(a)或(b)簡并的核酸，其中所述核酸編碼生物學活性的毛霉菌CotH多肽。
3.根據權利要求2所述的核酸，其中，所述核酸在高嚴格條件下雜交。
4.根據權利要求2所述的核酸，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO: 1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列具有至少65%,70%,75%,80%,85%,90 %、95 %、98 %或99 %的序列同一性。
5.根據權利要求2所述的核酸，其中，所述氨基酸序列由SEQIDN0:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的氨基酸序列或其修飾組成。
6.根據權利要求2所述的核酸，其中，所述核酸是cDNA。
7.含有根據權利要 求2所述的核酸的載體。
8.含有根據權利要求2所述的核酸的重組細胞。
9.一種 CotH 寡核苷酸，包含 SEQ ID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或31或其反義鏈的15至300個連續核苷酸。
10.根據權利要求9所述的CotH寡核苷酸，其中，寡核苷酸包含ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC (SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34),GATGACAATTATATTCCCAGC (SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA (SEQ ID NO:36)或AAACGTACCTGCTGACCGAATC(SEQ ID NO:37)的核酸序列。
11.一種反義核酸，能夠特異性結合至由權利要求2所述的核酸編碼的mRNA。
12.一種用于檢測是否存在毛霉菌CotH核酸序列的試劑盒，所述核酸序列包含根據權利要求9所述的至少一種寡核苷酸。
13.根據權利要求12所述的試劑盒，其中，所述至少一種寡核苷酸包含選自ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ ID NO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC (SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA (SEQ ID NO:36)或AAACGTACCTGCTGACCGAATC (SEQ ID NO:37)的核酸序列。
14.一種分離的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段。
15.根據權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽與SEQID NO: 1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 中所示的氨基酸序列具有至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99% 的序列同一性。
16.根據權利要求15所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽包含SEQID NO:1、3、5、11、15、16、18、20、22、24、26、28、30 或 32 的氨基酸序列。
17.根據權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述功能性片段結合至GRP78。
18.根據權利要求17所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述功能性片段結合至內皮細胞表達的GRP78。
19.根據權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽是由包含與SEQID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29 或 31 中所示的核酸序列具有至少 65%,70%,75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列所編碼的。
20.根據權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽是由包含SEQID NO:2、4、6、9、10、12-14、17、19、21、23、25、27、29或31中所示的核酸序列的核苷酸序列所編碼的。
21.根據權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述免疫原性片段基本上由氨基酸序列 GAGKKHNNAKQSWNW(SEQ ID NO:39)或 MGQTNDGAYRDPTDNNK (SEQ ID NO:40)組成。
22.根據權利要求21所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述免疫原性片段結合至載體蛋白。
23.根據權利要求22所述的毛霉菌CotH多肽，其中，所述多肽所述載體蛋白是鑰孔血藍素(KLH)。
24.一種表達毛霉菌CotH多肽的方法，所述方法包括在適合于所述毛霉菌CotH表達的條件下培養權利要求8所述的細胞。
25.一種分離的抗毛霉菌CotH抗體，其與權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽具有特異反應性。
26.根據權利要求25所述的抗體，其中，所述抗體是單克隆抗體。
27.產生根據權利要求26所述的單克隆抗體的細胞系。
28.根據權利要求25所述的抗體，其中，所述抗體是多克隆抗體。
29.根據權利要求25所述的抗體，其中，所述抗體與基本上由氨基酸序列GAGKKHNNAKQSffNW (SEQ ID NO:39)或MGQTNDGAYRDPTDNNK (SEQ ID NO:40)組成的多肽具有特異反應性。
30.一種組合物，包含對抑制毛霉菌CotH多肽表達有效的量的根據權利要求11所述的反義核酸和能夠將所述反義核酸遞送至細胞的可接受的載體。
31.一種用于鑒別編碼毛霉菌CotH多肽的核酸的方法，包括使含有核酸的樣品與權利要求9所述的一種或多種寡核苷酸接觸和鑒別雜交至所述寡核苷酸的核酸，其中所述接觸是在高嚴格雜交條件下實施的。
32.—種檢測樣品中毛霉菌CotH核酸分子的方法，包括使所述樣品與權利要求9所述的兩種或更多種寡核苷酸接觸，擴增核酸分子，和檢測所述擴增。
33.根據權利要求32所述的方法，其中，所述擴增是利用聚合酶鏈反應進行的。
34.根據權利要求32所述的方法，其中，所述兩種或更多種寡核苷酸中的至少一種包含 ATGAAATTATCTATTATATCCGCTGCC(SEQ ID NO:33)、GCTGGGAATATAATTGTCATCGA(SEQ IDNO:34)、GATGACAATTATATTCCCAGC(SEQ ID NO:35)、GAGTAGACGTAATTAGATCCAA(SEQ ID NO:36)或 AAACGTACCTGCTGACCGAATC (SEQ ID NO: 37)的核酸序列。
35.一種用于檢測樣品中是否存在毛霉菌目生物的方法，包括使樣品與權利要求25所述的抗體接觸，并檢測是否存在所述抗體與所述樣品的特異性結合，從而檢測所述樣品中是否存在毛霉菌目生物。
36.一種包含可藥用載體和化合物的藥物組合物，所述化合物選自權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽、其免疫原性片段或其功能性片段、權利要求11所述的反義核酸或者權利要求25所述的抗毛霉菌CotH抗體。
37.一種用于受試者抗真菌病癥免疫的疫苗組合物，包含免疫原性量的毛霉菌CotH多肽，或所述多肽的免疫原性片段，和可藥用載體。
38.根據權利要求37所述的疫苗組合物，還包含佐劑。
39.一種治療或預防對其有需要的受試者中毛霉菌病的方法，包括施用治療有效量的權利要求36所述的藥物組合物或權利要求37所述的疫苗組合物。
40.一種診斷受試者中毛霉菌病感染的方法，包括以下步驟: (a)提供來自所述受試者的測試樣品； (b)在適合條件下使所述樣品與能夠結合權利要求1所述的核酸或權利要求14所述的毛霉菌CotH多肽的試劑接觸，其中所述條件允許所述試劑與所述核酸或多肽特異性結合；和 (C)將所述測試樣品中所述特異性結合的量與對照樣品中特異性結合的量相比較，其中與所述對照樣品相比，所述測試樣品中所述特異性結合的量的增加或減少是對毛霉菌病感染的診斷結果。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，所述試劑選自權利要求25所述的抗毛霉菌CotH抗體或權利要求9所述的CotH寡核苷酸。
【文檔編號】C12N15/74GK103998057SQ201280056226
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2011年9月15日
【發明者】A·S·伊布拉伊姆, 明福·劉, 泰克勒吉奧吉斯·格布雷馬里亞姆, 躍·付, J·E·愛德華茲, 斯科特·菲勒 申請人:美國加州大學洛杉磯海濱分校醫學中心的洛杉磯生物醫學研究所