用于治療椎間盤退變性疾病的成纖維細胞的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于通過體內機械牽張力將細胞包括人成纖維細胞分化成軟骨細胞樣細胞的方法和組合物。在具體的方面，將成纖維細胞遞送至關節例如椎間盤，隨后成纖維細胞分化成軟骨細胞樣細胞以治療其中軟骨的功能障礙，包括例如修復退變的椎間盤。由于細胞的定位(如在纖維環的裂隙中)或其它生物力學和生物化學微環境因素而未分化成軟骨細胞的成纖維細胞可產生纖維基質分子以幫助髓核和纖維環的組織修復和再生。在某些方面，在遞送至個體之前，在例如生長因子、體外機械牽張力和/或基質分子不存在的情況下處理成纖維細胞。
【專利說明】用于治療椎間盤退變性疾病的成纖維細胞
[0001]本申請要求2011年11月9日提交的美國臨時專利申請系列N0.61/557，479和2012年8月21日提交的美國臨時專利申請系列N0.61/691391的優先權，將所述兩個申請通過引用整體并入本文。
【技術領域】
[0002]本發明的領域包括醫學、外科學、解剖學、生物學、細胞生物學和/或分子生物學的領域。在某些實施方案中，本發明的領域涉及用于治療與需要軟骨的身體部分例如脊柱或關節相關的醫學病況的方法和組合物。
[0003]發明背景
[0004]椎間盤，也稱為椎間纖維軟骨，位于脊柱內的相鄰椎骨之間，并且每一個椎間盤形成軟骨關節以允許椎骨輕度運動，從而充當將椎骨保持在一起的系帶。椎間盤包含對應于椎體終板表面形態的纖維軟骨板。椎間盤在承重中起著重要作用。椎間盤包括外層纖維環(annulus fibrosus),其圍繞內部膠質狀髓核(nucleus pulposus)。髓核插入椎體終板表面上的光滑圓形邊緣內。髓核接觸透明軟骨板，所述軟骨板附著至椎體的粗糙表面。
[0005]椎間盤疾病(Invertebral Disc Disease),也稱為椎間盤障礙,包括椎間盤退變性疾病(DDD)，是例如其中存在脊椎盤的功能障礙(包括惡化和/或疝出)的醫學病況。在DDD中，存在髓核的逐漸脫水。此后，通常被髓核吸收的物質被非均勻地轉移通過纖維環，其可經歷進行性結構性劣化。當纖維環因損傷或因老化而撕裂，隨后髓核可開始擠出通過撕裂時，椎間盤突出(其可稱為滑出椎間盤、椎間盤破裂或脊柱盤脫出)發生。
[0006]本領域需要對于治療椎間盤疾病有效并且具有最小侵入性和/或準備時間的方法和組合物。
[0007]發明概述
[0008]本發明涉及用于治療有此需要的個體，包括需要軟骨修復的個體的系統、方法和組合物。本發明涉及用于任何類型的軟骨包括例如椎間和關節軟骨的生物修復的方法和組合物。在具體的方面，本發明涉及軟骨修復例如關節軟骨修復的領域。更具體地，本發明的實施方案包括用于在機械應力下生長、增殖細胞和/或將細胞分化成軟骨細胞樣細胞的方法。
[0009]在某些方面，本發明例如從例如成纖維細胞體內產生天然組織。更具體地，但非專有地，本發明涉及用于例如生長人成纖維細胞并將其分化成軟骨細胞樣細胞的方法。在某些實施方案中，細胞可以是自體的或同種異體的或其混合物。
[0010]在具體實施方案中，本發明使用某些細胞向軟骨細胞樣細胞的分化。在具體實施方案中，在特定條件下將例如人真皮成纖維細胞(HDF)分化成軟骨細胞樣細胞。細胞向軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞的分化可以以任何適當的方式(包括在植入后在體內)發生。
[0011]在具體實施方案中，本發明提供了用于體內再生關節例如椎間盤、肘、膝、肩、髖、顳下頜關節等的方法。
[0012] 在某些實施方案中，作為本發明應用焦點的軟骨是椎間盤軟骨。在本發明的具體方面，將本發明中使用的細胞經歷體內機械牽張力以進行軟骨形成分化。
[0013]本發明的一個示例性目的是提供意欲修復退變性椎間盤例如恢復椎間盤解剖學和改善其功能的方法。在本發明的具體方面，提供了修復受損椎間盤的方法。在本發明的一個實施方案中，存在修復個體的關節(例如椎間盤)內的受損軟骨的方法，包括將根據本發明的成纖維細胞遞送至個體的相應關節(例如椎間盤)。在本發明的具體實施方案中，在不進行除去退變椎間盤的部分或全部的情況下將成纖維細胞遞送至椎間盤中。
[0014]在機械應力下，提供的細胞將在例如中心部分獲得核細胞的特征，在外圍獲得環紋細胞的特征。可以例如通過活組織檢查從皮膚收集示例性成纖維細胞。
[0015]在本發明的某些方面，除了本發明的方法以外，還給個體提供另一種療法。例如，在成纖維細胞的遞送之前、期間和/或之后，個體可接受一種或多種抗生素。示例性的術后療法包括非留體抗炎藥(NSAIDs)、簡單的止痛藥(鎮痛藥)和/或肌肉松弛藥(根據需要)，并且其可隨后進行術后(例如在術后第一周、第二周、第三周和更多周后)功能恢復。在具體實施方案中，可給個體提供抗生素、抗真菌劑或抗病毒劑中的一種或多種。
[0016]在本發明的某些方面，細胞分化成軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞，例如其中軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞分泌選自聚集蛋白聚糖、II型膠原、SOX-9蛋白、軟骨鏈蛋白、基底膜聚糖及其組合的分子。在一些具體情況下，細胞從成纖維細胞分化而來，示例性的成纖維細胞包括真皮成纖維細胞、肌腱成纖維細胞、韌帶成纖維細胞、滑膜成纖維細胞、包皮成纖維細胞或其混合物。
[0017]在具體實施方案中，在體內遞送至有此需要的個體之前、期間或之后不給成纖維細胞提供生長因子，包 括生長因子例如骨形態發生蛋白2(BMP-2)、BMP-4、BMP-6、BMP-7、軟骨源性形態發生蛋白(CDMP)、轉化生長因子β (TGF-β)、胰島素生長因子l(IGF-1)、成纖維細胞生長因子(FGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、FGF-2、血小板衍生生長因子(PDGF)及其混合物。
[0018]在另一個實施方案中，提供了包括置于一個或多個適當容器中的成纖維細胞的試劑盒。在具體實施方案中，試劑盒還包括一種或多種適合用于增強從成纖維細胞向軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞的體內分化的試劑。在一些實施方案中，本發明的試劑盒包括用于將成纖維細胞遞送至個體的一個或多個裝置。
[0019]在本發明的一些實施方案中，存在與將成纖維細胞遞送至有此需要的個體的體內部點相關的方法和組合物。在具體實施方案中，所述位點是體內的并且需要軟骨細胞，包括需要軟骨。例如，需要軟骨細胞的部點包括關節，例如軟骨關節(例如，椎骨)。在一些實施方案中，成纖維細胞獲自需要軟骨的個體。在具體實施方案中，成纖維細胞被遞送至個體內的至少一個椎間盤。在一些情況下，例如，在獲得后操作成纖維細胞，無論它們是否獲自有此需要的個體或無論它們是從第三方獲得的還是商購獲得的。可通過培養擴增成纖維細胞。在某些實施方案中，在向椎骨內移植之前或期間或之后，不給成纖維細胞提供生長因子、基質分子、機械牽張力(mechanical strain)或其組合。
[0020]在一些實施方案中，在椎間盤中存在成纖維細胞和軟骨細胞。在一些實施方案中，并非所有被體內遞送的成纖維細胞都將分化成椎間盤中的軟骨細胞，而椎間盤中產生的纖維組織在改善椎間盤高度和生物機械功能方面無疑是有用的。
[0021]在一些實施方案中，存在將人真皮成纖維細胞在體內分化成軟骨細胞樣細胞的方法，其包括將成纖維細胞遞送至個體的關節的步驟，其中在遞送之前，不將成纖維細胞經歷生長因子、基質分子、機械牽張力或其組合。在一些具體情況下，個體具有椎間盤疾病。在一些情況下，關節是椎間盤。
[0022]在一些實施方案中，椎間盤中一些未分化的成纖維細胞和已分化的軟骨細胞樣細胞被進一步定義為產生纖維性基質分子、軟骨性基質分子或兩者的細胞。在某些方面，軟骨細胞樣細胞被進一步定義為產生基質分子例如膠原蛋白1、膠原蛋白I1、蛋白聚糖或其組合的細胞。在具體實施方案中，膠原包括I型和II型膠原。在一些情況下，蛋白聚糖之一是聚集蛋白聚糖。
[0023]在具體情況下，成纖維細胞被遞送至椎間盤之間。在某些情況下，成纖維細胞被遞送至髓核與內纖維環的裂隙之間或其內。成纖維細胞可被遞送至例如椎間盤之間，包括髓核與內部纖維環內的裂隙。
[0024]本發明的方法的一些方面包括從個體獲得成纖維細胞。獲得可包括從身體取出成纖維細胞，或可包括例如從第三方(包括商業性地)或從貯藏庫取回已獲得的成纖維細胞。在某些方面，將成纖維細胞擴增例如至少一天。在一些情況下，將所獲得的成纖維細胞傳代例如超過I次。在具體的方面，將成纖維細胞擴增并傳代。
[0025]在一些實施方案中，提供了在個體的關節中產生纖維組織和/或軟骨組織的方法，其包括將成纖維細胞遞送至關節的步驟，其中在遞送至關節之前或期間或之后成纖維細胞未被暴露于生長因子、基質分子、機械牽張力或其組合。在具體實施方案中，纖維和/或軟骨細胞組織包含例如具有特定生物化學標志物例如I型和II型膠原和/或在軟骨和纖維組織中發現的許多蛋白聚糖的細胞。
[0026]在本發明的某些實施方案中，在遞送至個體的關節之前和/或之后成纖維細胞的存在和/或成纖維細胞的死亡觸發了一個或多個細胞的反應。在具體的情況下，成纖維細胞的存在和/或成纖維細胞的死亡觸發來自關節內的其它細胞的反應，所述其它細胞可以是任何類型，包括個體的內源細胞，例如軟骨細胞、成纖維細胞、椎間盤干細胞等。在具體的方面，內源細胞反應包括生長的刺激，例如如關節中至少一些成纖維細胞死亡。因此，在具體實施方案中，成纖維細胞的僅僅存在和/或細胞死亡時細胞內因子的釋放可能刺激椎間盤中存在的細胞的細胞生長反應。在具體情況下，細胞生長反應導致椎間盤的再生長(或關節修復)。
[0027]在本發明的具體實施方案中，作為成纖維細胞向關節的遞送的間接或直接結果，瘢痕組織可在關節內形成。在至少一些特定的情況下，例如當關節是椎間盤時，通過為環狀裂隙(annular fissure)提供穩定性、強度、減震、封閉等,這樣的瘢痕組織形成對于關節是有益的。
[0028] 上述內容已相當廣地概括了本發明的特征和技術有利方面，以更好地理解下面的本發明詳細描述。在下文中描述了形成本發明權利要求主題的本發明的另外的特征和有利方面。本領域技術人員應理解，公開的概念和具體的實施方案可被容易地用作用于改變或設計實現本發明相同目的的其它結構的基礎。本領域技術人員還認識到，這樣的等同的構造不背離所附權利要求中所示的本發明的精神和范圍。當與附圖結合考慮時，根據下列描述可更好地理解據信在其組織和操作方法方面為本發明特征的新型特征以及其它目的和有利方面。然而，應明確理解，每一個附圖被提供來僅用于舉例說明和描述，而無意界定本發明的界限。
[0029]發明詳述
[0030]本發明通過引用將2010年5月7日提交的美國專利申請系列N0.12/775，720整體并入本文。
[0031]如在本文中在說明書中所用，〃 一個/ 一種(a) 〃或〃一個/ 一種(an) 〃可意指一個或多個。如本文權利要求中所使用的，當與單詞"包含"結合使用時，單詞"一個/ 一種(a) 〃或〃一個/ 一種(an) 〃可意指一個或超過一個。如本文中所用，“另一個”可意指至少第二或更多個。在具體實施方案中，本發明的方面可以例如“基本上由本發明的一個或多個要素或步驟組成”或“由本發明的一個或多個要素或步驟組成”。本發明的一些實施方案可由本發明的一個或多個要素、方法步驟和/或方法組成或基本上由其組成。預期本文中描述的任何方法或組合物可根據本文中描述的任何其它方法或組合物來執行。
[0032]如本文中所用，術語“軟骨細胞樣細胞”是指不是原代軟骨細胞而是衍生自例如成纖維細胞的細胞。這類軟骨細胞樣細胞具有軟骨細胞(軟骨的細胞)的表型，包括例如軟骨細胞(例如多邊形和/或菱形細胞)的形狀和/或能夠聚集并產生軟骨基質組分，例如硫酸化蛋白聚糖和II型膠原。因此，軟骨細胞樣細胞的示例性標志物包括聚集蛋白聚糖的一種或多種，其為硫酸軟骨素和硫酸角質素蛋白聚糖、II型膠原、SOX-9蛋白、軟骨鏈蛋白和基底膜聚糖(其為例如硫酸肝素蛋白聚糖)。
[0033]如本文中所用，術語“關節”是指身體中其中骨架的兩塊骨連接的區域。
[0034]雖然可通過本發明的方法至少部分地修復任何組織，包括任何軟骨組織，但在具體的示例性實施方案中，椎間盤軟骨或關節軟骨被修復。本發明的一般實施方案是將HDF用作用于工程化新軟骨以用于椎間盤的細胞來源，因為這些細胞容易收集和生長。本發明包括將這些細胞分化成軟骨細胞樣細胞。
[0035]1.本發明中使用的細胞
[0036]在本發明的某些實施方案中，可使用任何細胞，只要細胞能夠分化成軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞。然而，在具體實施方案中，細胞是成纖維細胞，例如真皮成纖維細胞、肌腱成纖維細胞、韌帶成纖維細胞或滑膜成纖維細胞。可使用自體細胞，盡管在一些變通實施方案中，可使用同種異體細胞；在一些具體實施方案中，已對同種異體細胞測定疾病，所述細胞被認為適合用于人傳送。在本發明的某些方面，細胞是自體的，盡管在一些變通實施方案中，細胞是同種異體的。在其中細胞不是自體的情況下，在用于本發明之前，可通過本領域的標準裝置處理細胞以除去潛在危險的物質、病原體等。
[0037]使用自體HDF作為細胞來源的裝置的原理包括:1)HDF可以例如從小至3.0mm直徑的圓形皮膚樣品的打孔活檢組織非侵入性地收集；2)不存在來自另一個供體的污染的風險(例如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、克雅氏病等)；和3)HDF可在培養中容易地擴增并且在特定培養條件下分化成軟骨細胞樣細胞。可使用其它成纖維細胞群體，例如肌腱或韌帶成纖維細胞群體。在一個實施方案中，自體成纖維細胞是優選的。本發明的一些方面可使用商業購買的例如從實驗室(例如Cascade Biologies)購買的HDF。細胞可以是成人HDF或新生兒HDF。新生兒包皮成纖維細胞是例如非常方便的細胞來源。這些細胞可在商業上使用并且可容易地獲得以及易于生長。
[0038]根據本發明，從個體的皮膚組織的打孔活檢組織(6mm)收集自體HDF。在實驗室中，可用剪刀剖除皮下脂肪和深真皮。可將剩余組織切碎，在0.25%胰蛋白酶中于4°C溫育過夜。隨后，將真皮與表皮碎片分離，例如機械地分離。可將活檢組織的真皮碎片切碎，可將碎片用于開始外植體培養。可將從外植體收集的成纖維細胞在37°C于8% C02中生長在含有10%胎牛血清的Dulbecco’s MEM(DMEM)中。在一些特定方面，可在分化成軟骨細胞之前將這些細胞進行擴增。
[0039]在一些具體的方面，人真皮成纖維細胞的軟骨細胞樣分化可通過應用機械牽張力來促進。在本發明的一些具體實施方案中，在從成纖維細胞分化后，體內所得的細胞包含表示I型和II型膠原和蛋白聚糖的某些生物化學標志物的表達。
[0040]在一些具體的方面，人真皮成纖維細胞的軟骨細胞樣分化可在體內發生，其中椎間盤的微環境有助于軟骨細胞分化。在一些特定的實施方案中，椎間盤中以及椎間盤的其它生物化學環境中靜水荷載、缺氧、以及與駐留軟骨細胞的細胞間相互作用可促進從成纖維細胞向軟骨細胞的分化。在本發明的具體實施方案中，細胞移植后椎間盤中的細胞為纖維細胞性細胞和軟骨細胞性細胞的組合，所述細胞產生具有在軟骨和纖維組織中發現的I型和II型膠原和/或一些蛋白聚糖的生物化學標志物的纖維和軟骨細胞組織。
[0041]I1.本發明示例性方法(包括修復受損軟骨的方法)的實施方案
[0042]在本發明的實施方案中，提供了在體內將細胞包括成纖維細胞(例如，人)分化成軟骨細胞樣細胞的方法。所述方法可包括將成纖維細胞遞送至個體的關節的步驟，其中在遞送之前，不將成纖維細胞經歷生長因子、基質分子、機械牽張力或其組合。在體內遞送之前可以將或可以不將成纖維細胞暴露于缺氧條件。
[0043]機械應力/牽張力是軟骨發生的重要因素。本發明的方法在體內使用機械牽張力，在一些具體的實施方 案中，使用來自脊柱的固有壓力來提供機械牽張力。在一些實施方案中，所述方法可在其它類型的壓力包括間歇性流體靜力壓、流體切應力等不存在的情況下發生。在一些實施方案中，所述方法在不存在除固有脊柱壓外的壓力、低氧張力、生長因子、基質中的培養等的情況下發生。在一些實施方案中，來自脊柱的壓力荷載被用于誘導成纖維細胞向其它細胞的分化。
[0044]成纖維細胞可獲自供體來源(同種異體的)或自體皮膚活檢組織。可從皮膚分離細胞和在培養中擴增它們，在某些情況下，不處理所述細胞或僅最低程度地處理細胞(例如，暴露于血清、抗體等)。可將這些細胞置于裝置(例如，具有來自單層培養物培養基中的重懸浮細胞的注射器)中，將其注射入個體。用于飼養細胞以進行擴增的血清可用培養基例如DMEM來洗滌，以避免任何外來血清被注射入個體。在本系統的一些實施方案中，未使用基質，包括無藻酸鹽。在本發明的一些實施方案中，例如僅注射所述細胞(或最少量的流體以懸浮細胞用于注射)并且不注射培養基。包含細胞的液體懸浮液可包含作為DMEM組分的緩沖劑、氨基酸、鹽、葡萄糖和/或維生素。未用于本發明的方法步驟的細胞處理示例性基質分子包括聚合物(包括例如PGA、PLGA和PCL);天然水凝膠例如膠原、透明質酸、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖；和合成水凝膠例如PEO、PVA, PAA等)。
[0045]在本發明的一些特定方面，細胞被誘導以經歷向軟骨細胞或軟骨細胞樣細胞的分化。這樣的分化在體內遞送后發生。在本發明的一些具體實施方案中，機械應力刺激HDF的軟骨發生分化。
[0046]在本發明的一些方面，可通過增加椎間盤尺寸、膠原含量和/或某些生物分子的水平來改善基質生物力學和椎間盤的生物學。在本發明的一些實施方案中，椎間盤中的細胞，只要它們不滲漏出空間和不死亡，就可產生基質分子例如膠原、蛋白聚糖等。在某些方面，生物分子提供有益的生物力學性質例如抗壓性/拉伸負荷。經歷因正常站立/行走/脊柱的彎曲而產生的負荷的細胞在體內將分化成軟骨細胞或軟骨樣細胞。椎間盤中的成纖維細胞和軟骨細胞可產生可改善椎間盤高度和體積以及增強生物力學性質的纖維和/或軟骨基質或組織。
[0047]在本發明的一些方法中，在獲得成纖維細胞后，可擴增細胞的數目，盡管在一些備選實施方案中，在任何先前擴增不存在的情況下將成纖維細胞體內提供給有此需要的個體。本領域技術人員承認培養的細胞需要營養并且可利用培養基例如FBS(胎牛血清)飼養細胞。在一些情況下可防止污染或感染(例如，通過添加抗生素)。在將細胞注射至個體之前，用例如DMEM培養基洗滌細胞以除去FBS和抗生素，將懸浮細胞用于注射。流體懸浮物可包含少量培養基(其包含例如緩沖液、氨基酸、鹽、葡萄糖和/或維生素)。成纖維細胞的體外生長可包括在體內使用之前生長至少一天或多天。在某些情況下，可檢查或監控細胞以確保至少一些細胞發生分裂。可除去不分裂的細胞。
[0048]在某些實施方案中，椎間盤高度得到改善和/或在植入的細胞中顯示某些生物化學標志物。椎間盤高度可使用例如平面放射線影像檢查(plain radiographs)、比較治療前后的情況來測量。在至少一些特定的情況下，還可使用磁共振成像(MRI)、生物化學標志物測定和/或組織學。恢復椎間盤高度改善了橫穿脊柱的脊神經的空間，并且除了改善該區域的椎間盤生物力學和生物學以外，其還以這樣的方式具有間接益處。在一些具體的實施方案中，成纖維細胞移植后的組織學變化可顯示纖維細胞和軟骨細胞與因更加豐富的組織而具有增加的椎間盤高度的基質的組合。
[0049]在一些實施方案中，將成纖維細胞注射在椎骨或椎間盤之間，并且髓核中的細胞可遷移至環關聯椎間盤退變(annulus associated disc degeneration)的裂隙。這些細胞將增強髓核和纖維環中的基質形成以幫助修復和組織再生。髓核中的細胞將更多地朝向軟骨細胞分化并且纖維環中的細胞將因髓核和纖維環的機械和生物化學環境而更加纖維細胞化。
[0050]在一些實施方案中，成纖維細胞的分化直至體內植入時才開始，并且由于不同的生物力學和生物化學環境的原因，并非所有移植的細胞都能分化成軟骨細胞。
[0051]在本發明的一些實施方案中，從例如待治療的個體獲得成纖維細胞，從另一個個體(包括例如尸體或活的供體)獲得它們，或商購獲得它們。可獲取皮膚活檢組織，在一些實施方案中可處理皮膚活檢組織。例如，可消化皮膚組織過夜以獲得成纖維細胞，培養所述細胞以進行擴增，將它們提供給個體，包括通過將它們注射進入個體。在遞送至個體之前，取決于需要的細胞數目，將細胞傳代I次或多次，例如包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。傳代可在I或更多天，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或1、2、3、4或更多周的過程中發生。在一些實施方案中，將細胞例如傳代5-7天。
[0052] 在本發明的一些實施方案中，通過在體內給有此需要的個體(包括對所述疾病易感的個體，例如衰老的個體)提供成纖維細胞來預防椎間盤疾病。在一些實施方案中，個體是成人。處于患該疾病的風險中的個體包括運動員(專業的或業余的)、吸煙者、肥胖個體和/或其職業或生活方式需要例如體力勞動，包括過度抬舉的那些個體。實施例
[0053]下列實施例用來顯示本發明的一些優選實施方案。本領域技術人員應當理解，下列實施例中公開的技術代表了本發明人發現的在本發明的實施中運行良好的技術，從而可被認為構成用于其實施的優選模式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應當理解可在公開的具體實施方案中進行許多變化，仍然獲得相同或相似的結果而不背離本發明的精神和范圍。
[0054]實施例1
[0055]成纖維細胞注射和體內分化
[0056]在本發明的一些實施方案中，將成纖維細胞例如遞送至哺乳動物椎骨以改善椎間盤退變。在一些實施方案中，將成纖維細胞遞送至哺乳動物椎骨以誘導軟骨細胞分化或以繼續軟骨細胞分化。
[0057]使用兔模型，其包括穿刺纖維環，在損傷后約4周將椎間盤高度減小(因例如基質丟失和退變而引起的)至約70%的正常高度。在纖維環穿刺后約4周進行該模型的細胞移植，椎間盤高度在例如隨后3-4周逐漸增加。被注射的細胞包含在椎間盤中，其是存活的以產生更多基質(纖維和軟骨組織)來增加椎間盤高度。更多的基質和增加的椎間盤高度在個體中導致更好的生物力學功能和更少的疼痛。在一些具體實施方案中，例如基于MRI，再生組織大多數為纖維軟骨而非具有高蛋白聚糖和水的透明型軟骨。在某些方面，生物化學分析顯示I型和II型膠原被表達，這顯示存在軟骨組分，從而表明至少在一些情況下存在軟骨組織(如果其全部為纖維(瘢痂組織)，則主要表達I型膠原而無II型膠原，但軟骨組織表達II型膠原)。
[0058]在操作上文提及的兔模型時，椎間盤高度在成纖維細胞的移植后增加。
[0059]盡管已更詳細地描述了本發明及其有利方面，但應理解可在本文中進行各種變化、替代和改變而不背離所附權利要求定義的本發明的精神和范圍。此外，本申請的范圍無意限于說明書中描述的方法、機器、制造、物質的組成、裝置、方法和步驟的具體實施方案。本領域技術人員根據本說明書的公開內容十分清楚，可以根據本發明使用目前存在的和將來待開發的與本文中描述的對應的實施方案大體上起相同的功能或獲得與其大體上相同的結果的方法、機器、制造、物質的組成、裝置、方法或步驟。因此，所附權利要求意欲在它們的范圍內包括這樣的方法、機器、制造、物質的組成、裝置、方法或步驟。
【權利要求】
1.一種將人真皮成纖維細胞體內分化成軟骨細胞樣細胞的方法，其包括將成纖維細胞遞送至個體的關節的步驟，其中在遞送之前，所述成纖維細胞未經歷生長因子、基質分子、機械牽張力或其組合。
2.權利要求1的方法，其中所述個體具有椎間盤疾病。
3.權利要求1的方法，其中所述關節是椎間盤。
4.權利要求3的方法，其中所述椎間盤中的成纖維細胞和軟骨細胞樣細胞是產生纖維性基質分子、軟骨性基質分子或兩者的細胞。
5.權利要求1的方法，其中所述軟骨細胞樣細胞是產生基質分子的細胞。
6.權利要求4的方法，其中所述基質分子是I型膠原、II型膠原、蛋白聚糖或其組合。
7.權利要求6的方法，其中所述膠原包括I型和II型膠原。
8.權利要求6的方法，其中蛋白聚糖之一是聚集蛋白聚糖。
9.權利要求3的方法，其中所述成纖維細胞被遞送至椎間盤之間。
10.權利要求9的方法，其中成纖維細胞被遞送至髓核與內部纖維環中的裂隙內或之間。
11.權利要求1的方法，其還包括從所述個體獲得成纖維細胞。
12.權利要求11的方法，其中將所述獲得的成纖維細胞進行擴增。
13.權利要求12的方法，其中將所述獲得的成纖維細胞擴增至少一天。
14.權利要求11的方法，其中將所述獲得的成纖維細胞傳代。
15.權利要求14的方法，其中所述傳代進行超過一次。
16.權利要求1的方法，其中在將所述成纖維細胞遞送至個體的關節后，許多成纖維細胞死亡。
17.權利要求16的方法，其中所述成纖維細胞的死亡導致來自所述個體的內源關節細胞的細胞反應。
18.權利要求17的方法，其中所述細胞反應包括刺激個體的內源關節細胞的生長。
19.權利要求1的方法，其中在將所述成纖維細胞遞送至關節后，存在來自所述個體的內源關節細胞的細胞反應。
20.權利要求19的方法，其中所述細胞反應包括刺激所述個體的內源關節細胞的生長。
21.權利要求1的方法，其中在將所述成纖維細胞遞送至所述個體的關節后，在所述關節中產生瘢痕組織。
【文檔編號】C12N5/00GK104011201SQ201280063195
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年11月8日 優先權日:2011年11月9日
【發明者】P·奧西倫, H·安 申請人:脊核細胞有限責任公司