單倍體細胞的制作方法

單倍體細胞的制作方法
【專利摘要】本發明涉及產生穩定的單倍體細胞培養物，所述細胞在正向及反向遺傳學中的用途，尤其鑒定與修飾的表型關聯的靶基因和尤其是鑒定與毒素抗性，尤其蓖麻毒素毒性抗性關聯的基因靶，及靶化合物的治療性用途。
【專利說明】單倍體細胞
【【技術領域】】
[0001]本發明涉及單倍體細胞和它們作為遺傳篩選工具的用途，以及與細胞存活和毒素抗性關聯的新鑒定的基因。
【【背景技術】】
[0002]復雜生物的二倍體基因組嚴重限制在模型物種研究中、而且在人研究中的許多遺傳方法。一些生物(諸如酵母或社會昆蟲)是單倍體，即它們攜帶單組染色體(Otto和Jarne, 2001)。酵母的單倍性已被利用鑒定生物學的根本性的機理(HartwelI等人，1974)。但是，全部體細胞哺乳動物細胞攜帶2個拷貝的染色體，即呈現使突變篩選不明了的二倍性。具有它們的基因組的單拷貝的生物，諸如酵母，提供遺傳分析的基礎，其中必要的基因的任何隱性突變會由于第2基因拷貝的缺失而顯示清楚的表型(Hartwell等人，loc.cit.)。最近已顯示，單倍體哺乳動物細胞允許正向遺傳篩選(Carette等人，2009, 2011a, 2011b)。但是，證明了難在哺乳動物中產生體細胞單倍體細胞，可能因為單倍性與哺乳動物發育不相容(Latham等人，2002)。至今，已在魚胚胎干細胞(Yi等人，2009)、人KBM-7白血病細胞(Carette等人，2009，2011a)中達到單倍性，及通過電融合產生雜交細胞(Yan等人，2000)。嘗試自單倍體小鼠胚胎建立多能干細胞系導致了具有二倍體核型的單性生殖胚胎干細胞的分離(Kaufman等人，1983)。這些研究報道了具有定義的內細胞團的明顯正常單倍體小鼠胚泡的發育(Kaufman等人，1983 ;Latham等人，2002)。Kaufman等人(1983)描述活化鼠卵母細胞的方法,其發育成單倍體和二倍體干細胞的混合物。但是單倍體細胞無法穩定地培養及培養物立即轉變為全部二倍體狀態。
[0003]W02008/0334 69A1描述產生具有二倍體、雜合基因組的單性生殖胚胎干細胞的方法。這些細胞與特定供體匹配和可用于移植物。
[0004]W001/32015A1涉及分離單倍體細胞，尤其從二倍體卵母細胞(例如在受精或導入雌性原核之后)產生的細胞的方法，其中半數染色體然后在極體中被擠出。將該單倍體細胞轉化為二倍體細胞，例如通過電融合或注射另一單倍體基因組，從而形成二倍體細胞。
[0005]Leeb等人(2011)描述哺乳動物單倍體胚胎干-樣細胞培養物的產生。
[0006]盡管模型生物中功能損失遺傳篩選闡明了多種生物學過程，哺乳動物細胞的二倍體基因組至今阻止了大規模基因破壞。鑒于此，會高度期望允許哺乳動物中的隱性遺傳學的高-通量方法的手段和方法，但是尚未可利用。
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【發明內容】
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[0007]因此，本發明解決的技術問題可本認為是提供滿足上述需求的手段和方法。所述技術問題由在權利要求中及在下文表征的實施方式解決。
[0008]尤其，本發明的目標是提供單倍體干細胞的培養物和產生該細胞的方法。該細胞應穩定足夠的時間量，這允許在正向及反向遺傳學實驗期間操作和分析。
[0009]這些目標由本發明解決，本發明提供產生單倍體細胞的哺乳動物細胞或細胞系的方法，包括獲得多個處于發育的多細胞胚胎階段，優選胚泡階段的單倍體細胞，分離所述多個細胞，擴增分離的所述多個細胞，自所述擴增的細胞選擇及分離一個或更多具有單倍體基因組的單細胞，由此獲得穩定的單倍體細胞的細胞系的細胞。任選地，可將若干個分離的細胞組合成細胞培養物。或者，各個體細胞可增殖及生長為細胞培養物(亞克隆)。本發明還涉及產生源于單性生殖桑椹胚或胚泡的單倍體胚胎干細胞系的方法，該方法包括:(a)自雌性受試者體外活化非-受精的卵母細胞，以誘導單性生殖發育；(b)培養所述步驟(a)的活化的卵母細胞，以產生桑椹胚和/或胚泡；(C)自所述步驟(C)的桑椹胚和/或胚泡分離胚胎干細胞及，任選地，將所述胚胎干細胞轉移進抑制所述胚胎干細胞分化的細胞培養基；(d)使步驟(C)的胚胎干細胞經歷FACS分析及鑒定和/或富集顯示單倍體DNA內含物的胚胎干細胞；及(e)任選地，顯示單倍體DNA內含物的胚胎干細胞的重復的FACS純化和所述胚胎干細胞的擴增，由此產生單倍體胚胎干細胞系。也提供的是可由發明的方法和其優選的變體獲得的或由發明的方法和其優選的變體獲得的具有單倍體基因組的細胞的細胞培養物。本發明還涉及由上述的方法產生的單倍體胚胎干細胞系。此外，本發明提供桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干-樣細胞系，其包含至少60%單倍體胚胎干細胞，以及提供使用所述單倍體胚胎干細胞的試劑盒及測試系統。此外，本發明涉及單倍體干細胞的方法和用途以及源于該方法和用途的產物。該新用途和方法不限于使用創新地產生的及改善的干細胞，但也可使用現有單倍體干細胞。本發明的再一方面在權利要求中描述及定義。
[0010]發育的多細胞胚胎階段的多個單倍體細胞可從可以單倍體狀態單性生殖地增殖的活化的卵母細胞得到。在優選的實施方式中，本發明的方法包括下列步驟:獲得哺乳動物的單倍體單性生殖卵母細胞或單倍體胚胎細胞，將所述卵母細胞或胚胎細胞轉移進假孕雌性，使所述卵母細胞或胚胎細胞生長至多細胞階段，任選地將所述多細胞階段的細胞培養至胚泡階段，由此提供處于發育的多細胞胚胎階段的所述多個單倍體細胞。在進一步步驟中，方法可包括:獲得所述多細胞階段的細胞，擴增所述多細胞階段的細胞(例如作為培養物簡單維持，尤其以分離的形式，無擴增也是可能的)，自所述擴增的細胞選擇及分離具有單倍體基因組的單細胞，使所述細胞擴增至細胞培養物，由此獲得穩定的單倍體細胞的細胞系。
[0011]方法的第I步驟包括獲得單倍體單性生殖卵母細胞或胚胎細胞。此可由本領域知道的常用方法，例如通過由醇或鍶處理活化卵母細胞來進行。活化的細胞能增殖及含有僅一個基因組拷貝(單倍性)。
[0012]單倍性涉及在細胞周期的Gl或GO期期間每細胞僅存在一個基因組拷貝(In)。發明的單倍體細胞能在S期復制基因組，在G2期建立基因組的第2拷貝(2n)。在G2期此拷貝的基因組是純合的。單倍性可區別于二倍性，在Gl或GO期期間具有2個基因組(通常雜合)，和在S期之后在G2期期間具有4個基因組。最終導致建立的單倍體細胞培養物的全部發明的細胞在方法的全部步驟期間維持單倍性。一些細胞可獲得二倍體基因組。將這些細胞選擇性地移除。
[0013]活化的卵母細胞可在假孕雌性中生長，其中所述細胞生長至多細胞階段，諸如囊胚或桑椹胚階段。假孕雌性中的生長優化活化的卵母細胞以早期胚胎-樣發育成單倍體細胞，用于培養。或者，細胞可如Leeb (2011)描述培養。可分離多細胞階段的細胞，并且也可體內或體外進一步生長。在所述進一步生長步驟中，所述多細胞階段的多個細胞可進一步擴增和/或發育，包括至囊胚階段。盡管單倍體細胞無法完成胚胎發育同時維持單倍性，發育的早期階段是可能的。根據本發明，該胚胎-樣多細胞聚集體可為發育的胚胎階段的多個單倍體細胞。在該階段，在所述多個細胞之內細胞由細胞間鍵附接。該多個細胞可新產生或，例如自冷凍的供給提供。替代性地，自該多個細胞或多細胞階段，諸如單倍體單性生殖胚胎-樣階段簡單獲得分離的細胞也是可能的。
[0014]在下一步，分離及擴增來自所述多細胞階段的多個細胞的一個或更多細胞。自多細胞階段的細胞分離通常涉及將多細胞階段分離為個體細胞，即個體化，例如通過破壞細胞粘接，諸如通過胰蛋白酶消化，或自多細胞階段移出至少一個單倍體細胞。然后，例如在細胞培養基中進一步擴增或維持分離的細胞。自擴增的或維持的細胞選擇及分離本發明的單倍體細胞。呈現為，當嘗試獲得單倍體細胞的細胞培養物時，此另外的分離步驟是關鍵的。盡管該細胞最可能自單性生殖活化開始就存在，自囊胚階段獲得的其他細胞的存在似乎掩蓋存在于多細胞階段的多個細胞的少數選擇的細胞的獨特性質。僅用此另外的分離步驟，這些選擇的少數細胞可經延長的時間維持它們的單倍體狀態似乎是可能的。可對(整個)多細胞階段或其部分，優選對多細胞階段本身實施多細胞階段，例如桑椹胚或胚泡的個體化。盡管例如在移除透明帶，移除滋養外胚層之后及在免疫外科之后，僅使用內細胞團獲得及培養內細胞團是可能的(Leeb，2011)，根據本發明不需要這些步驟。本發明提供個體化多細胞階段或通過培養 細胞(包括滋養外胚層)的更簡單得多的方法。此方法更容易操作得多，對多細胞階段的細胞欠毀壞性及節省試劑和人力成本。在其他實施方式中，實施這些步驟當然是可能的。在分離所述多細胞階段的細胞期間或之前，可移除或不移除多細胞階段的透明帶。可分離或不分離內細胞團。
[0015]分離的細胞是不附接于所述多細胞(胚胎)階段的原多個細胞的任何其他細胞的單細胞。幾個分離的細胞通常存在于細胞培養物中。或者，各個體細胞可增殖及生長為細胞培養物(亞克隆)。亞克隆是特別有利的，由于其提供用于進一步發育實驗，諸如正向誘變實驗和分化實驗的標準化的原點。如果使用潛在地來源于分離的原單倍體細胞的細胞混合物，鑒定個體細胞的特征，例如干細胞樣性質或分化能力是不可能的。在混合物中，一種細胞可能負責表達干細胞標志物，而另一種細胞負責發育為分化的組織。根據本發明，首次顯示單細胞是干細胞-樣的，和同時能發育為分化的細胞。
[0016]細胞可在尤其例如通過輻射或絲裂霉素C而具有失活的細胞周期的常見的飼養體培養物上，優選飼養細胞(諸如成纖維細胞，優選小鼠胚胎成纖維細胞(MEF))層上維持和/或擴增。細胞也可在無飼養細胞的培養條件下維持或生長。優選地，將細胞維持在飼養層上，然后在無飼養細胞的培養中維持。在細胞維持期間，細胞也可擴增、增殖和/或生長。盡管，在產生本發明的細胞之后立即，在飼養層上維持細胞呈現對于改善細胞活力重要，然而所述細胞令人驚訝地適應在無飼養體的條件下生長。優選通過逐漸減少及最終移除飼養細胞密度來訓練細胞在無飼養體的條件下生長。無飼養體的細胞相比于例如描述于Leeb (2011)的飼養體依賴性細胞具有顯著優勢。在毒性(抗性)篩選中，當用毒素攻擊單倍體細胞及就抗性進行篩選(例如在隨機突變后)時，飼養層也會被毒素影響。當飼養細胞死亡時，飼養體依賴性單倍體細胞也會如此，即便確實發展出毒性抗性。由此，在飼養體細胞培養物中會導致假陰性結果。由此優選，為如下文以更多細節描述進一步用于，尤其與毒素或生長抑制物接觸的細胞，使用無飼養體的單倍體細胞。[0017]本文所用的細胞的“分離”指稱自具有其他性質的其他細胞移出所述細胞。這些其他性質可不在于細胞的遺傳構造，而且不在于可與基因沉默或活化事件關聯的活化、分化或表達狀態。在多數情況中，分離涉及單細胞的個體化，但也可涉及相同的性質或活化狀態的分離。
[0018]對于干細胞維持適合的培養基為本領域所知和可商購；實例是含有Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液、MgCl2, CaCl2, L谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素如青霉素/鏈霉素(P/S)、胚胎牛血清(FBS)、LIF(白血病抑制性因子)的培養基。0.25% (w/v)胰蛋白酶-EDTA可任選地另外地用于分開細胞。培養基中含有的另外的因子可為人轉鐵蛋白、腐胺二鹽酸鹽、人重組胰島素、L甲狀腺素、三-碘甲狀腺原氨酸、黃體酮、亞硒酸鈉、肝素和皮質酮。
[0019]初始擴增，在自多細胞階段分離細胞之后，可在IOmin~I周之間，優選，至少15min、20min或25min,和/或下列之任一個:達5天,4天,3天,2天，I天，18小時，12小時，6小時，3小時，I小時。自擴增的細胞分離單個單倍體細胞，其可形成新的相對穩定的單倍體細胞培養物的基礎。這些單倍體細胞具有干細胞樣特征及在這里被稱為“干細胞”，盡管單倍體細胞發育成單倍體哺乳動物或分化的組織當然是不可能的。"干細胞"是具有在培養物中增殖，產生一些保持相對未分化的子代細胞，及產生一種或更多特化的細胞類型的細胞的其他子代細胞的能力的細胞。本發明的單倍體細胞能無限增殖，并且可分化為3種胚胎胚層。它們無法如胚胎干細胞一樣可分化為全部體細胞系，及生殖系。但是將單倍體細胞轉化為能有該多樣的分化能力的二倍體細胞是可能的。一般而言，本發明的細胞可為多能性的。由于不發生卵母細胞的受精，它們不是胚胎的細胞。所述細胞有時被稱為胚胎干細胞或胚胎干-樣細胞，原因在于發育的早期階段至例如囊胚或桑椹胚階段模擬胚胎的發育。但是，本發明的細胞是像這樣及不經進一步修飾不能發育為胚胎或進一步發育為哺乳動物。但是，它們適合發育為細胞系。同樣，“單性生殖胚胎”是缺乏受精的胚胎，不是真正的胚胎。
[0020]如果全部這些步驟被進行，本發明的產生單倍體細胞的哺乳動物細胞或細胞系的方法包括下列步驟:獲得所述哺乳動物的單倍體單性生殖卵母細胞或胚胎細胞，將所述卵母細胞或胚胎細胞轉移進假孕雌性，使所述卵母細胞或胚胎細胞生長至多細胞階段，優選桑椹胚或囊胚階段，任選地將所述多細胞階段的細胞培養至胚泡階段，獲得所述多細胞階段的細胞，擴增所述多細胞階段的細胞，自所述擴增的細胞選擇及分離一個或更多具有單倍體基因組的單細胞，由此獲得穩定單倍體細胞的細胞系的細胞。
[0021]為選擇和分離，可對單倍體細胞進行標記，尤其優選標記細胞中的基因組、染色體或DNA。優選單倍體細胞是熒光標記的。為了選擇及分離單細胞，可例如通過胰蛋白酶消化分離或個體化。然后可根據它們的基因組含量分選個體細胞。在特定情況中，用根據本發明的方法，以至少20，優選至少50，更特別至少100和尤其優選200個細胞/s的高通量選擇及分離細胞。高通量方法具有可每單位時間分離大量的細胞的優勢。一種該方法是，例如，流式細胞術或FACS，用其可分類及分離達1000個細胞/s或更多。根據另一標志物，例如胚胎細胞的標志物標記細胞，以進一步區別及選擇細胞也是可能的。優選地，此另外的選擇與單倍體細胞的選擇同時進行，諸如通過使用標記該另外的標志物的其他熒光染料(基于“多色”的方法)。細胞可根據尺寸進一步選擇。
[0022] 如在這里及在實施例中顯示，根據這些方法步驟，自單性生殖胚胎產生單倍體小鼠干細胞系是可能的。這些細胞攜帶20個染色體，表達干細胞標志物，及可體外和體內發育成全部胚層(內胚層、中胚層、外胚層)。
[0023]本發明的方法包括培養分離的細胞或已經自多細胞階段或多個細胞擴增為細胞培養物的幾個分離的細胞。尤其所述方法包括細胞培養物的常規再接種或單倍體細胞的富集或二倍體細胞的移除，以維持細胞培養物的單倍體完整性。優選地，所述方法還包括下列步驟:培養所述細胞培養物的細胞及在達50代后自所述細胞培養物分離一個或更多單倍體細胞，及擴增所述分離的單倍體細胞作為新持續的細胞培養物。
[0024]本發明提供哺乳動物細胞的第一相對穩定的培養物。優選地，親本和/或細胞培養物的細胞來自優選非-人哺乳動物。由此，尤其優選地，由于倫理原因，細胞是非-人細胞。細胞可為鼠、靈長類動物、豬、牛、山羊、馬科動物、綿羊、犬科動物、貓科動物、兔。
[0025]親本細胞可為雜合或純合的，優選雜合的。雜合細胞含有可在本發明的細胞系中引起個體單倍體基因組的2個不同基因組。從 雜合細胞產生單倍體細胞的每一個事件通常引起親本基因組的不同組合，由此產生不同的單倍體細胞。優選地，本發明的細胞培養物的細胞是克隆，包含相同的單倍體基因組。親本細胞是雜合的，即包含2個相同基因組也是可能的。自該親本細胞的全部單倍體細胞通常是相同的。對于雜合親本細胞，本發明具有特別的優勢，因為用發明的方法經單倍體干細胞途徑產生純合后代細胞是可能的。
[0026]本發明的單倍體細胞可經由下列方式轉化為二倍體細胞，例如失效的胞質分裂和/或基因組的內復制或至少2個單倍體細胞的融合，或由本領域知道的其他方法(包括電融合或另一單倍體基因組的注射(諸如在W001/32015A1中))。該二倍體細胞仍是純合的，并且能進一步胚胎或組織發育——甚至對于晚于胚層發育的階段(包括，分化例如分化為組織細胞)也是如此。由此，本發明提供組合純合誘變(進一步細節見下文)與干細胞的分化潛能。如果人工導入單倍體細胞的基因組之外的其他基因組，二倍體細胞也可被產生為雜合。相當地，可將本發明的細胞的基因組導入其他細胞而產生雜合細胞。這些其他細胞可以是或不是單倍體，例如卵母細胞，或二倍體。由此，本發明的方法可還包括將本發明的培養物的細胞轉變為二倍體細胞和任選地還將所述細胞，例如分化為體細胞干細胞，或多能或全能干細胞，諸如內部胃粘膜，消化道，肺，肌肉，骨，血，泌尿生殖，表皮或神經系統細胞。尤其是細胞可分化為產生血細胞的造血干細胞；產生例如骨細胞(bone cells)(骨細胞(osteocytes))和軟骨細胞(cartilage cells)(軟骨細胞(chondrocytes))的骨髓間質細胞(間質干細胞)；多能外周血干細胞(PBSC);具有產生肝細胞，心肌細胞，神經細胞和肌肉細胞的潛力的成年骨髓干細胞；產生神經細胞(神經元)以及非-神經元細胞(星形膠質細胞和少突膠質細胞)的腦中神經干細胞；產生例如吸收細胞，杯狀體細胞，帕內特細胞和腸內分泌細胞的上皮干細胞；皮膚干細胞(產生角質形成細胞的表皮干細胞和產生毛囊的濾泡干細胞)；產生產胰腺內分泌激素細胞的肝臟干細胞；產生胰島細胞的胰腺干細胞和祖細胞；眼的干細胞和祖細胞(角膜和視網膜干細胞)沖胚層源成血管細胞(血管-關聯的干細胞)。例如，骨髓細胞和臍帶血干細胞對于治療血病癥諸如白血病、多發性骨髓瘤和淋巴瘤是有用的。為治療嚴重的缺血性心臟病，可將自骨髓和外周血的干細胞注射進冠狀動脈或直接注射進心肌，可移植的細胞包括自骨髓的間質干細胞和自外周血的CD34+細胞。治療性益處可為心肌的增加的血管化，及新心肌細胞的形成。
[0027]本發明的單倍體細胞的培養物相對穩定，但可發生單細胞轉變為二倍體狀態。已顯示，本發明的細胞經70代穩定。在一些情況中，每天2~3%的細胞可轉變為二倍體細胞。優選地，將發明的細胞培養物常規純化，以移除二倍體細胞或再接種。在優選的實施方式中，本發明的細胞培養物包含至少30 %單倍體細胞，優選至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %或至少90 %單倍體細胞或由其組成。新接種的培養物或冷凍的培養物可包含100%單倍體細胞或由其組成。
[0028]在優選的實施方式中，轉變為二倍體細胞的速度是至多10% /天，優選至多8% /天，至多6% /天,至多5% /天,至多4% /天或至多3% /天,尤其當以5個連續日平均時。
[0029]本發明的細胞培養物通常含有多個單倍體干細胞，優選至少10，尤其優選至少50，更優選的至少100，至少500，至少1000，至少5000，至少10000至少50000或甚至至少100000個細胞，其中，以上百分率，例如至少30%的細胞是單倍體。
[0030]將發明的單倍體干細胞遺傳分析，及已由定量PCR鑒定在基因表達中具有高辨別價值的幾個特征性基因。在本發明的細胞中，優選基因Nanog和/或Sal 14相比IB10/C細胞上調。優選上調是至少1.2倍，優選至少1.5倍。對于Nanog而言，上調也可為至少2倍。
[0031]發明的單倍體細胞還能形成胚狀體(EB)。該EB細胞可表達內胚層標志物Gata4。分化還通過使用實時PCR確認。原型ES細胞標志物Nanog、Rexl、0ct4、Sox2、Klf4、Sall4或Kfl2或其任何組合的表達可在EB中下調，而系定型標志物Handl (中胚層、滋養外胚層)、Nkx2_5和Brachyury (均中胚層)、巢蛋白(神經)、Gata4、Gata6、Foxa2 (全部早期內胚層)、Soxl7 (內胚層和中胚層)、Cxcr4R(內胚層)、角蛋白18 (外胚層)或其任何組合的mRNA表達可相對于無EB分化的親本單倍體干細胞上調。這些差異也表明，本發明的單倍體干細胞能分化為全部3個胚層的幾個系。 [0032]優選發明的單倍體細胞表達至少一種干細胞標志物，諸如0ct4和/或Sox2。優選地，本發明的單倍體細胞能形成含有Gata4+內胚層細胞和/或Tujl+神經元的EB。
[0033]本發明的一個具體目的是提供產生源于單性生殖桑椹胚或胚泡的多能、單倍體胚胎干細胞系的方法，所述方法包括:
[0034](a)自雌性受試者體外活化非-受精的卵母細胞，以誘導單性生殖發育；
[0035](b)培養步驟(a)的所述活化的卵母細胞，以產生桑椹胚和/或胚泡；
[0036](c)自步驟(b)的所述桑椹胚和/或胚泡分離胚胎干細胞及，任選地，將所述胚胎干細胞轉移進抑制所述胚胎干細胞分化的細胞培養基；
[0037](d)使步驟(C)的胚胎干細胞經歷FACS分析及鑒定和/或富集顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞；以及
[0038](e)任選地，顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞的重復的FACS純化和所述胚胎干細胞的擴增，由此產生單倍體胚胎干細胞系。
[0039]如本文所用，單數形式“一個/種(a) ”，“一個/種(an) ”和“該/所述(the) ”包括單數和復數個所提及物，除非上下位明確另外指出。例如，“細胞”指稱一個或多于一個細胞。
[0040]本文所用的術語“包含(comprising、comprises或 comprised of)”、與“包括(including或includes) ”或“含有(containing或contains) ”是同義詞，并且是包含性的或或開放式的，且不排除另外的、未敘及的成員、要素或方法步驟。顯然，術語“包含”包括術語“由……組成”。[0041]本文所用的術語“體外”表示動物或人體的外面或外部。本文所用的術語“體外”應理解為包括“離體”。術語“離體”一般指稱自動物或人體移出的及在機體之外例如在培養容器中維持的或增長的組織或細胞。本文所用的術語“體內”表示動物或人體的里面或內部。
[0042]本文所用的術語“單性生殖”或“單性生殖發育”指無需受精而直接自卵母細胞發育胚胎的過程。如本文所用，提及的術語指精子穿透缺失下發生的卵母細胞(即雌性配子)活化的過程。本文所用的單性生殖指通過卵母細胞活化獲得的早期階段胚胎發育，其包含滋養外胚層和內細胞團，包含全部雌性來源的DNA。因此，“單性生殖桑椹胚或胚泡或胚胎〃指僅含有全部源于雌性配子的雌性染色體DNA的桑椹胚/胚泡/胚胎。該單性生殖胚胎階段或胚胎可通過未受精的雌性配子(例如，未受精的哺乳動物卵母細胞)的活化衍生，如下文進一步解釋。
[0043]在進一步實施方式中，也涉及可源于雄核發育的單性生殖胚胎。
[0044]〃配子〃是由減數分裂產生的及有性繁殖中涉及的特化的單倍體細胞(例如，精子和卵母細胞)。
[0045]本文所用的術語“卵母細胞”是指繁殖中涉及的雌性配子母細胞或生殖細胞。換言之，其是未成熟的卵子，或卵細胞。卵母細胞在雌性配子發生期間在卵巢中產生。分離卵母細胞的方法為本領域所熟知。基本上，此會包括自雌性受試者的卵巢或生殖道分離卵母細胞(見例如 “Principles and Practice of Fertility Preservation”，CambridgeUniversity Press2011,由 J.Donnez 及 S.S.Kim 編輯)。
[0046]在本發明的 情景中使用的卵母細胞可從哺乳動物雌性受試者得到，所述哺乳動物雌性受試者優選選自人受試者、非-人靈長類動物例如獼猴屬(例如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(Macacamulatta))或滅猴屬(諸如滅毛猴(Callithrix jacchus))或大猿家族(例如大猩猩、黑猩猩和紅毛猩猩，但是在本發明的情景中特別排除人)、小鼠、大鼠、山羊、豬、馬、牛、貓、狗、綿羊或駱駝。卵母細胞可為非-受精的和未成熟的卵母細胞或非-受精的和成熟卵母細胞。優選地，卵母細胞是非-受精的和未成熟的卵母細胞。所述未成熟的卵母細胞可由描述于文獻(例示地見Krotz等人，2010)的方法體外成熟。
[0047]在本發明的方法的一實施方式中，分離未受精的及未成熟的卵母細胞，然后在活化之前體外成熟。
[0048]如本文所用，卵母細胞的"活化"指未受精的卵母細胞被(優選外源地)活化的過程，使得其經歷如下過程，一般包括染色單體對的分離和第2極體的擠出，尤其得到具有單倍體數的染色體且各具有一個染色單體的卵母細胞。〃活化〃也包括含有全部雌性來源的DNA的細胞被誘導而發育為具有可辨別的內細胞團和滋養外胚層的胚胎(其對于產生多能胚胎干細胞有用)的方法。本發明的實施方式也包括已移植2個雄性(雄核發育)或2個雌性單倍體核(雌核發育)的卵母細胞或卵裂球細胞諸如內細胞團細胞或飼養層細胞的活化。本文所用的“活化的卵母細胞”還包括已與乙醇或氯化鍶溫育的未受精的和任選地成熟的卵母細胞，如本領域所知(見例如Kaufmann等人，1983)及也如在隨附的實施例中描述。例如，來自超排卵的雌性小鼠的卵母細胞或人卵母細胞可通過使它們暴露于乙醇，優選4%至8 %、更優選5 %至7 %的范圍的乙醇(優選在PBS或鹽水或其他適合的緩沖劑中)優選3~7，5分鐘的時間，更優選4~6分鐘的時間,最優選5分鐘的時間(甚至更優選5分鐘組合5% EtOH,如在隨附的實施例中顯示)，或氯化銀,優選25mM來活化,如Leeb等人(2011)例示。用于產生源于活化的卵母細胞的桑椹胚和胚泡的適當的培養條件描述于本領域(例如Leeb等人.2011 ;或Krotz等人.2010,等)。
[0049]本文所用的術語“卵裂球”是指通過活化的卵母細胞分裂產生的一類細胞。
[0050]術語“桑椹胚”在本文指在哺乳動物的早期胚胎發生中形成的結構及是指約16個未分化的球形細胞的實體球體。隨著桑椹胚中細胞分裂持續，卵裂球的形狀變化和彼此緊密對齊。此過程被稱為壓實。
[0051]本文所用的術語“胚泡”是在桑椹胚形成之后的哺乳動物發育中的早期胚胎階段。其特別是囊胚的哺乳動物實例。其具有內細胞團(ICM)，或成胚細胞(其隨后形成胚胎)，及細胞外層或滋養層(其隨后形成胎盤)。ICM是本發明的胚胎干細胞的一個源，而滋養層是另一源。滋養層圍繞內細胞團和被稱為囊胚腔或胚泡腔的流體-填充的胚泡腔。當囊胚腔在桑椹胚中打開時，在人受精之后約第5天開始胚泡形成。因此，術語〃內細胞團〃指產生胚胎組織的胚胎的內部部分。在本發明的情景中，內細胞團(見隨附的實施例)以及滋養層，優選0ct4-誘導的滋養層或如Wu等人(2011)中公開的例中的OiPS的這些細胞可用于提供本發明的多能胚胎干細胞的連續來源。將理解的是，在本發明的情景中使用的滋養層(優選誘導的滋養層，其中誘導的是指這些細胞的多能性的誘導，其由0ct4-誘導的滋養層-OiPS例示)可不毀壞胚泡而源于胚泡(包括人胚泡)，即胚泡胚胎”不會被傷害-對應方法為本領域技術人員，例如自常在源于哺乳動物(包括人)胚胎的滋養層上進行的植入前診斷(有時被稱為“PID”)的【技術領域】熟知。
[0052]在本發明中，“內細胞團”指由單性生殖產生的胚胎的內部部分。
[0053]術語“祖細胞”通常指未特化的或相對欠特化的及能增殖的細胞，其或其后代可產生至少一種相對更特化的細胞類型。作為例示且不限制，祖細胞可產生可沿著一個或更多系分化而產生越來越相對更特化的細胞的后代，其中該后代和/或越來越相對更特化的細胞本身成為祖細胞，或甚至產生末端分化的細胞，即完全特化的細胞，其可在有絲分裂后。術語也包括本文定義的胚胎干細胞。
[0054]本文所用的術語“干細胞”指能自我更新，即，可不分化而增殖的祖細胞，其中干細胞的后代或其至少部分基本上保留未特化的或相對欠特化的表型、分化潛能、及親本干細胞的增殖能力。術語包括能基本上無限地自我更新的干細胞，即，其中后代或其部分進一步增殖的能力相比母代細胞基本上不減少，以及顯示有限的自我更新的干細胞，即，其中后代或其部分進一步增殖的能力相比母代細胞可論證地減少。基于產生多樣的細胞類型的能力，祖細胞或干細胞可通常被描述為全能、多能(pluripotent)、多能(multipotent)或單倉泛。
[0055]“全能”細胞可通過暴露于如在發育中正常發生的刺激而分化為身體的任何細胞類型，包括生殖系。因此，全能細胞可被定義為能生長，即發育為整個生物的細胞。
[0056]需知，本發明的主題的細胞(包括本發明的進一步實施方式)優選不是全能的，但(嚴格地)是多能的。
[0057]在具體的優選實施方式中，本發明的細胞(包括全部與之相關的進一步實施方式)是人細胞或非-人靈長類動物細胞，多能及源于胚泡(優選源于滋養層)。
[0058]“多能”干細胞不能生長為整個生物，但能產生來源于全部3個胚層，即，中胚層、內胚層和外胚層的細胞類型，及可能產生生物的全部細胞類型。如本文所用，〃多能細胞"指源于通過活化含有全部雌性或雄性來源的DNA的細胞而產生的胚胎的細胞，其可以未分化的狀態體外維持延長的、理論上無限的時間，其可產生不同分化的組織類型，即，外胚層、中胚層和內胚層。此包括，例如但不限于可分化為骨、軟骨和肌肉的間葉干細胞；可分化為血、內皮和心肌的造血干細胞；可分化為神經元和神經膠質的神經元干細胞等。在一實施方式中，所述細胞的多能狀態通過培養胚胎的內細胞團或源于內細胞團或滋養層(優選被重編程而成為多能的誘導的滋養層)的細胞來維持，所述胚胎由單性生殖方法，在適當的條件下，例如通過在成纖維細胞飼養層或另一飼養層或任選地包括白血病抑制性因子(LIF)的熟知的培養基上培養而產生。該培養的細胞的多能狀態可由本領域知道的各種方法確認，例如，(a)確認多能細胞的標志物特征的表達；(b)產生含有表達所述多能細胞的基因型的細胞的嵌合動物；(c)將細胞注射進動物，例如，SCID小鼠，體內產生不同分化的細胞類型；及(d)觀察所述細胞(例如，當在飼養層或LIF缺失下培養時)體外分化為胚狀體和其他分化的細胞類型。本發明的細胞優選是多能的。
[0059]“多能”細胞能自生物的各2種或更多不同器官或組織產生至少一種細胞類型，其中所述的細胞類型可來源于相同的或來源于不同胚層，但不能產生生物的全部細胞類型。相反，“單能”細胞能分化為僅一種細胞系的細胞。
[0060]本文所用的“胚胎干(ES)細胞或細胞系”是指具有優選哺乳動物的特征的細胞或細胞系，自桑椹胚或胚泡分離的胚胎干細胞(如報道于，例如，Martin(1981);及Evans (1981));即，能無限增殖和可分化為生物的全部特化的細胞類型，包括3個胚胎胚層、全部體細胞系，及優選也包括生殖系的胚胎干細胞。本文所用的術語“細胞系”以其最廣義是指永久建立的細胞培養物或細胞群，其例如源于優選哺乳動物桑椹胚或胚泡，給定適當的細胞培養條件，其(至少理論上)能在培養中無限分裂。“來源于桑椹胚或胚泡”是指胚胎干細胞從桑椹胚或胚泡分離。例如，胚胎干細胞可從胚泡的內細胞團或滋養層分離。優選地，通過分離胚胎干細胞而桑椹胚或胚泡未被損傷或毀壞，即“余下”胚胎未被該過程傷害。胚胎干細胞具有高核-細胞質比、顯著的核仁，能無限增殖和可分化為生物的多數或全部特化的細胞類型，諸如3胚胎胚層、全部體細胞系，及優選也為生殖系。可分化為生物的全部特化的細胞類型和可貢獻于生殖系的胚胎干細胞是全能的。在一些情況中，獲得胚胎干細胞，其可分化為生物的幾乎全部特化的細胞類型；但不分化為一種或小數特定細胞類型。例如，Thomson等人(1995)描述當轉移進另一胚泡時，靈長類動物胚胎干細胞的分離不貢獻于生殖系。術語〃胚胎干細胞系〃旨在包括胚胎干-樣細胞(ES-樣細胞)，其是自哺乳動物內細胞團或上胚層分離的細胞系，其具有平的形態、顯著的核仁，永生和能分化為全部體細胞系，及當轉移進另一胚泡時不可貢獻于生殖系。例如，新近研究已發現，當過表達0ct4時，滋養層干細胞可轉變為ES-樣多能干細胞(Wu等人(2011))。鑒于此，在本發明的手段和方法的一實施方式中，過表達0ct4的滋養層細胞也可用于產生單倍體ES-樣細胞和細胞系。術語〃胚胎干細胞系〃也旨在包括〃源于內細胞團的細胞〃(源于ICM的細胞)，其是直接源于分離的ICM或桑椹胚的細胞，無需對它們傳代以建立連續ES或ES-樣細胞系。制造、培養及使用胚胎干細胞的方法，例如，描述于US6，235，970或US7，592，175，其內容以 它們的整體并入本文。例如，所述細胞可在適當的條件下培養，例如通過將它們在抑制ES細胞的分化的白血病抑制性因子(LIF)的存在下，在成纖維細胞飼養層或另一飼養層上培養。本文所用的術語“胚胎干細胞”包含自分離的胚胎干細胞、原代胚胎干細胞或其群或細胞系建立的細胞系。其包括處于它們的非-分化的形式或處于它們的分化的形式的胚胎干細胞。其也包含胚胎干細胞的祖先，其細胞系或包含該未分化的或分化的胚胎干細胞的細胞群。任選地，所述胚胎干細胞被遺傳修飾，例如被突變，如在本文別處所述。原型胚胎干細胞標志物為本領域所知及包括，例如，堿性磷酸酶、0(^4、3012、似110〖、1(]^4、1^11、Klf2、cMyc Sall4、或SSEA-1。胚胎干細胞的非-分化的、多能或全能狀態可由本領域知道的各種方法確認，例如，通過確認多能/全能細胞的標志物特征的表達來確認。例如，多能/全能ES細胞可特征在于0ct4 (POU轉錄因子的成員)和Nanog的高水平表達。維持干細胞多能性/全能性需要臨界量的0ct4和Nanog。當ES細胞被誘導分化時，0ct4和Nanog下調，其被證明對于適當的和異向發育程序必要(見，例如，Cavaleri等人(2003) ；Mitsui等人(2003))。
[0061]〃繁殖單倍體胚胎干細胞或細胞系〃是指在單倍體細胞的宿主生物之外增殖人工產生的單倍體細胞的胚胎干細胞系。一般該單倍體細胞系會包含在體外培養物中。或者，單倍體細胞可體內繁殖，例如通過注射進假孕雌性小鼠或注射進SKID小鼠而產生分化的細胞類型。
[0062]如本文所用，術語“分離的細胞”或“分離的(單倍體)胚胎干細胞”通常指未與細胞與之體內結合的一種或更多細胞或一種或更多細胞組分給合的細胞。例如，分離的細胞可已從其天然環境移出，或可由已從其天然環境移出的細胞的繁殖，例如，離體繁殖得到。優選地，本文所用的胚胎干細胞是分離的胚胎干細胞。例如，胚胎干細胞可從胚胎，胚胎組織或胚胎階段，例如，從桑椹胚或囊胚階段(例如哺乳動物胚泡)，優選從胚泡的內細胞團分離。但是，由Wu等人的新近研究(2011)提示，當過表達0ct4時，滋養層細胞可被重編程為多能ES-樣細胞。由本發明的方法產生的單倍體胚胎干細胞和ES-樣細胞系可來源于，例如，人，非人靈長類 動物諸如稱猴(例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(Macacamulatta))或狨猴屬或大猿(例如大猩猩、黑猩猩和紅毛猩猩)，小鼠，大鼠，山羊，貓，狗，綿羊或駱駝。
[0063]本文所用的術語“細胞群”通常指一群細胞。除非另外說明，該術語指由分離的本發明的單倍體胚胎干細胞組成或包含分離的本發明的單倍體胚胎干細胞的細胞群。由此想到，提及的細胞群仍可包含二倍體細胞，盡管這些細胞是少數，代表相應群的總細胞計數的例如不多于20%，15%，10%，5%，4%，3%，2%或1%。細胞群可由具有常見的表型的細胞或可包含至少具有常見的表型的細胞的級分組成。當細胞在下列一種或更多可論證的特征中基本上類似或相同時，細胞被稱為具有共同的表型，包括但不限于形態學外觀，特定細胞組分或產物，例如，RNA，蛋白，細胞-特異性標志物或其他物質的表達的存在，缺失或水平，特定生物化學通路的活性，增殖能力和/或動力學，分化潛能和/或對分化信號的應答或體外培養期間的行為，例如，附著、非-附著、單層生長、增殖動力學等。該可論證的特征可因此限定細胞群或其級分。例如，被稱為HMScl和HMSc2的本發明的2種單倍體ES細胞系在緊密模擬二倍體ES細胞系IB10/C之一的轉錄組分析中顯示表達譜(見圖9)。
[0064]當細胞群在本文被稱為“異源”時，此通常表示包含2種或更多細胞或不具有共同的表型的細胞的級分的細胞群，例如，包含2種或更多不同細胞類型的細胞的細胞群。作為例示及不限制，異源細胞群可從胚胎組織或階段諸如桑椹胚或胚泡分離，和可包含多樣的細胞類型，包括但不限于內細胞團或滋養層的細胞。
[0065]當細胞群在本文被稱為同質時，其由具有共同的表型的細胞組成，該細胞也是單倍體。在本文被稱為“基本上同質”的細胞群包含具有共同的表型和單倍性的實質性大多數細胞。“基本上同質”細胞群可包含至少70 %，至少80 %，至少85 %，優選至少90 %，至少95%,96%,97%,98%或甚至至少99%的具有共同的表型和單倍性(諸如特別被稱為例如本文定義的胚胎干細胞或本文定義的胚胎干細胞的祖先的表型的表型)的細胞。如本文所用，術語“基本上同質”也包括同質群。例如，如描述于下列實施例的本發明的單倍體胚胎干細胞系可被認為是基本上同質或甚至同質細胞群。
[0066]本文所用的術語“分離”是指自桑椹胚或胚泡的內細胞團或滋養層獲取胚胎干細胞。例如，人胚胎在受精后4~5天達到胚泡階段，在該時間、它們由約50~150個細胞組成。優選地，自本發明的桑椹胚或胚泡分離胚胎干細胞不導致胚泡的破壞或損傷。例如，可分離單性生殖胚泡的內細胞團的單細胞，及使其在適當的細胞培養條件下增長為單倍體胚胎細胞系。
[0067]在本發明的方法中，術語“產生”源于單性生殖桑椹胚或胚泡的單倍體胚胎干細胞系是指產生從桑椹胚或胚泡(源于非-受精的、活化的卵母細胞)分離的單倍體胚胎干細胞系。
[0068]“FACS”或“FACS分析”是隨它們按激光束在流體流中經過而測量細胞或粒子的特定物理和化學特征的良好描述的手段。術語"流式細胞術〃源于隨它們流經一系列檢測器，單細胞(cyto)的測量(計)。流式分選通過使用電或機械手段轉向及收集具有一種或更多落入由用戶設定的值的范圍之內的測量的特征的細胞來延伸流式細胞術。FCM的主要應用包括分析細胞周期， 凋亡，壞死，多色分析，細胞分選，功能分析和干細胞分析。FACS分析可用于鑒定，分選，純化及富集顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞，如描述于下列實施例。本文所用的“FACS分析”在本發明的方法的情景中優選指單倍體細胞的富集或純化。
[0069]如本文所用，"二倍體細胞〃指具有二倍體DNA內含的細胞，例如，卵母細胞，卵裂球或胚胎干細胞。二倍體卵母細胞在小鼠中具有40個染色體,一組(20個染色體)來源于各親本。二倍體卵母細胞在人中具有46個染色體，一組(23染色體)來源于各親本。如本文所用，〃 二倍體DNA"在人中指46個染色體，一個雄性及一個雌性組，及在小鼠中40個染色體。"二倍體細胞"以同源對具有其染色體，及具有2個拷貝(2n)的各常染色體遺傳座位。"合子"是自在受精期間雄性和雌性配子的融合得到的二倍體細胞。
[0070]如本文所用，"單倍體細胞"指具有單倍體DNA內含的細胞，例如，卵母細胞，卵裂球或胚胎干細胞，其中單倍體DNA具有全部雄性或全部雌性來源，優選雌性來源。類似地，本發明的單倍體(單性生殖)卵裂球，桑椹胚或胚泡，或胚胎干細胞或細胞系或細胞群特征在于單倍體DNA內含。如本文所用"單倍體DNA"在人中指全部雄性或全部雌性來源的23個染色體。在小鼠中，單倍體DNA指20個染色體。"單倍體細胞"是指具有單倍體數(In)的染色體的細胞。如顯示于下列實施例，本發明的單倍體胚胎干細胞可由以下例示過程產生:在小鼠中，可通過使其暴露于5%乙醇或25mM氯化鍶來活化來自超排卵的雌性小鼠的卵母細胞。在活化之后，將卵母細胞轉移到假孕受者。在胚胎發育第3.5天(ED)，收獲致密桑椹胚和胚泡及在用來衍生胚胎干細胞的條件下培養；也見圖1A。
[0071]本文所用的術語“超排卵的小鼠”是指一般在性交后(pc)3.5天，可用作供體卵母細胞的源的超排卵的小鼠。所述小鼠可，例如，通過向青春期前雌性的PMSG和hCG激素的
注射方案產生。
[0072]本文所用的術語“分化(differentiation)”、“分化(differentiating) ”或“其衍生物”表示未特化的或相對欠特化的細胞變得相對更特化的過程。在細胞個體發生的情景中，形容詞“分化的”是相對術語。因此，“分化的細胞”是相比與之比較的細胞，向特定發育通路更進展的細胞。分化的細胞可為，例如，末端分化的細胞，即，在生物的各種組織和器官中從事特化的功能的完全特化的細胞(并且其可以是但不必需是在有絲分裂后)。在另一例中，分化的細胞也可為分化系之內的祖細胞，其可進一步增殖和/或分化。類似地，如果細胞相比與之比較的細胞，向特定發育通路更進展，則所述細胞是“相對更特化的”，其中因此后者被認為是“未特化的”或“相對欠特化的”。相對更特化的細胞在下列一個或更多可論證的表型特征中可不同于未特化的或相對欠特化的細胞，諸如，例如，特定細胞組分或產物，例如，RNA,蛋白，特定細胞標志物或其他物質的表達的存在，缺失或水平，特定生物化學通路的活性，形態學外觀，增殖能力和/或動力學，分化潛能和/或對分化信號的應答，等，其中該特征表示相對更特化的細胞進一步沿著所述的發育通路進展。
[0073]分化的非限制性實例可包括， 例如，多能干細胞向給定類型的多能祖細胞或干細胞變化，多能祖細胞或干細胞向給定類型的單能祖細胞或干細胞變化，或在給定細胞系之內單能祖細胞或干細胞向更特化的細胞類型或向末端特化的細胞變化。未特化的或欠特化的細胞向更特化的細胞分化可通過具有中間程度的特化的細胞的呈現進行。例如，本文所述的分離的單倍體胚胎干細胞可體外和體內分化為全部胚層，即內胚層、外胚層和中胚層，如顯示于下列實施例。
[0074]〃遺傳篩選〃、"遺傳診斷〃、"遺傳分析〃和〃遺傳測試〃是指由常規方法分析本發明的單倍體胚胎細胞或細胞系，以檢測與表型、疾病或病情關聯的特定DNA的存在或缺失。該方法包括，例如，原位雜交、聚合酶鏈反應、巢式聚合酶鏈反應、熒光計量檢測方法、RFLP分析、VNTR或STR檢測方法(其就許多串聯重復二核苷酸或其他短串聯重復子(STR)序列的利用進行篩選)、單-鏈構象多態性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及錯配切割分析即，通過酶促(RNA酶A)或化學(哌啶)手段。該方法也描述于下列實施例和為本領域熟知(Sambrook,分子克隆:實驗室手冊，冷泉港實驗室，第3版，2001)。
[0075]〃遺傳選擇〃是指使用遺傳測試定向選擇基因型。
[0076]〃遺傳修飾〃或〃遺傳操作〃是指細胞，優選本發明的單倍體胚胎干細胞的基因組的修飾。此包括插入、缺失及取代修飾。優選修飾會在基因組中的靶位點實現。在優選的實施方式中，修飾的單倍體ES細胞會最終用于核移植，其用于表達修飾的/操作的基因的動物的產生。
[0077]〃倍增〃是指增加包含雄性或雌性來源的期望的單倍體基因組的細胞數。
[0078]術語"核轉移"或"核移植"指克隆方法，其中將來自供體細胞的核移植入去核的卵母細胞。核轉移技術或核移植技術在文獻中有描述(見，例如，由Lorthongpanich等人(2010)的綜述和該文引用的參考文獻)。在對象應用中，核轉移或核移植或NT互換使用。本定義也包括移植一個或2個選擇的單倍體基因組而產生胚胎。
[0079]〃缺乏功能基因〃是指整個基因從受試者基因組丟失，或基因被突變為其可不再發揮功能的程度(例如，產生野生型蛋白)。[0080]由〃遺傳缺陷〃是指核酸缺失或插入，其對應于基因的轉錄，基因的mRNA翻譯為蛋白的改變，蛋白或基因的mRNA的半衰期的改變或自基因的野生型表達的其他變化。不同形式的給定基因被稱為"等位基因"。基因的"野生型等位基因"是以相對高頻度在天然的群中存在及產生野生型或正常表型的那些。導致異常或非-野生型表型的基因的等位基因是"突變等位基因"。接合性指生物中性狀的等位基因的相似性。如果兩個等位基因相同，則生物就該性狀是純合的。如果兩等位基因不同，則生物就該性狀是雜合的。如果一個等位基因丟失，則其是半合子，及如果兩個等位基因丟失，則其是缺合子。
[0081]本發明涉及由任何方法產生和倍增含有單倍體染色體內含的胚胎干細胞，這些細胞用于遺傳評估，諸如正向遺傳篩選或遺傳隱性篩選，特定單倍體基因組的遺傳修飾或倍增的用途，及這些細胞在產生具有二倍體DNA內含的胚胎中的用途。
[0082]為了產生源于單性生殖桑椹胚或胚泡的單倍體胚胎干細胞系，需從雌性受試者分離非-受精的卵母細胞。本發明的雌性受試者是哺乳動物雌性，優選選自人，非人靈長類動物諸如例如稱猴(例如食蟹猴(Macaca fascicularis),恒河猴(Macacamulatta))或狨猴屬或大猿(例如大猩猩、黑猩猩和紅毛猩猩)，小鼠，大鼠，山羊，貓，狗，綿羊或駱駝等，如之前提及。分離哺乳動物卵母細胞的方法在本領域有描述。分離的卵母細胞可為未成熟的或成熟卵母細胞。優選地，分離的非-受精的卵母細胞是可體外成熟的未成熟的卵母細胞，如文獻中所述。在下一步，將所述卵母細胞體外活化，以誘導單性生殖發育，這可通過使卵母細胞暴露于乙醇或銀鹽來實施。例如，5%或7%乙醇或25mM氯化銀可用于此。然后在允許產生桑椹胚和/或胚泡的適當的細胞培養條件下培養活化的卵母細胞。所述培養條件為本領域所知。然后所述桑椹胚或胚泡可用作分離本發明的胚胎干細胞的源，其中在最優選的實施方式中，本發明的細胞是源于胚泡的多能細胞。胚胎干細胞的分離在本領域有描述(例如.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach，，RobertsonE.J., edl987, Oxford:1RL Press ;“Manipulating the mouse embryo” Nagy A.等人,2003,冷泉港出版社，第3版)。任選地，將分離的胚胎干細胞轉移到抑制所述胚胎干細胞分化的細胞培養基。達到此目的的手段和方法為本領域技術人員熟知，及包括例如向培養基或緩沖劑添加LIF。在下一步，使分離的或培養的胚胎干細胞經歷FACS分析，以便鑒定和/或富集顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞。在進一步任選的步驟中，顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞的FACS純化和所述胚胎干細胞的擴增被重復一次或更多次，優選2，3，4，5次或更多次，由此產生穩定的單倍體胚胎干細胞系。在一方面，本發明的要旨在于發現體外活化的卵母細胞，以誘導單性生殖發育。
[0083]圖1A顯示誘導單性生殖和自小鼠衍生本發明的單倍體ES細胞系的概觀。用5%乙醇或25mM氯化鍶(SrCl2)活化小鼠卵母細胞及移植進假孕雌性。然后自胚泡產生ES細胞和隨后由FACS分選單倍體細胞。將培養物常規再分選，直到衍生出穩定的單倍體細胞。
[0084]人卵母細胞向胚泡的成熟可由本領域知道的適應的體外受精(IVF)流程實施。例如，可實施卵巢超刺激，以便取回多個卵。然后，可實施超聲波-引導的經陰道卵母細胞取回，以直接自卵巢獲得卵母細胞。可使分離的卵母細胞體外成熟36~48小時。本文所述的適當的單性生殖活化及本領域知道的細胞培養條件可用于產生桑椹胚或胚泡，從而可從所述桑椹胚或胚泡分離本發明的人單倍體胚胎干細胞。
[0085]本發明還涉及單倍體胚胎干細胞系，如由單倍體鼠胚胎干細胞系例示。單性生殖胚胎發育自單倍體卵母細胞及，由此，僅含有母源基因組。但是，全部報道的細胞系源于攜帶二倍體組的染色體的單性生殖胚胎(Kaufman等人，1983)。本發明人假定,單倍體細胞可仍存在于單性生殖早期胚胎中，及單倍體ES細胞可源于該胚泡。為了實現此，發明人通過暴露于5%乙醇而活化了來自超排卵的C57BL/6X129F1雌性的卵母細胞。然后將活化的卵母細胞轉移進假-懷孕的受者(見圖1A)。在胚胎發育第3.5天(ED)，收獲致密桑椹胚和胚泡及在用來衍生ES細胞的條件下培養。FACS分析顯示，小量的單性生殖地來源的細胞的確顯示減少的DNA含量(圖8A)。此群的幾輪FACS純化和隨后擴增導致源于2個不同胚泡的2種獨立細胞系，下文稱之為HMScl和HMSc2，其具有細胞周期的Gl期中的In染色體組和細胞周期的G2期中的2n染色體組(圖1B、圖8A)。染色體分散顯示，兩種細胞系攜帶單倍體組的20個染色體(圖1C、圖SB)。需注意，兩種細胞系現在已傳代多于50次，而無任何增殖危機的跡象。由此，減數分裂卵母細胞的開發活化和胚泡的單性生殖衍生允許發明人建立具有單倍體染色體組的小鼠細胞。
[0086]如本領域技術人員理解，本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系可用于各種方法，例如，用于研究印記調節。由于本發明提供唯獨母源來源的單倍體胚胎干細胞和細胞系，其提供一種分析用來控制等位基因特異性表達或阻遏的機理的新工具。
[0087]此外，所述本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系可用于純合誘變。由于單倍體染色體含量和經時成為二倍體的固有趨勢的組合，本發明的單倍體胚胎細胞和細胞系理想地適合于產生致使隱性表型分析的純合突變。為此，發明人成功地使用了反轉錄病毒基因捕獲誘變以及轉座子輔助的誘變而大規模產生純合突變。以類似樣式，輻射或化學劑可用于隨機誘變。發明人也成功地實施了同源重組而隨意導入任何期望的突變。
[0088]而且，本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系可用于快速和立即產生純合靶向的小鼠，由此防止耗時繁殖的需求。這是由于，所述細胞和細胞系顯示二倍化的固有性質，最可能由于內復制或失效的胞質分裂。當，例如，注射進鼠胚泡時，該二倍體，雌性胚胎干細胞可能顯著地貢獻于許多組織，由此，在純合或嵌合小鼠之內導致純合鼠組織。優選地，本發明的單倍體胚胎干細胞貢獻于生殖系。
[0089]可應用本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系的另一方法是在哺乳動物中半克隆:半克隆被定義為體細胞基因組的人工遺傳混合而產生新遺傳組合，如通常性繁殖的情況。為此，可，例如，實施以下2個實驗:
[0090](I)可將卵母細胞用單倍體胚胎干細胞核(而非精子)人工受精。如果此方法成功，此會是2個雌性的第I個有活力的后代。
[0091](2)可將受精的卵母細胞的雌性原核移出及用本發明的單倍體胚胎干細胞的單倍體基因組取代，以允許與雄性原核融合。通過如此，單倍體胚胎干細胞可產生雜合小鼠，和可體內取得導入的潛在突變及詳細分析。
[0092]而且，本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系可用于由誘變產生單倍體或二倍體胚胎干細胞或原代細胞的情景中純合性的基因敲除的基因組域庫:該細胞可在組織培養中或體內用于研究基因功能。為了產生數千突變和對它們全部進行測序，發明人已，例如，建立突變，挑選，擴增，冷凍及平行分析數千克隆的流程。簡言之，挑選源于單個、隨機突變的細胞的ES細胞集落，將各集落個別冷凍，并且還擴增集落級分，以提取DNA。由此，可產生具有鑒定的突變的數千個體細胞系，各獨立地冷凍，如顯示于下列實施例。[0093]最終，本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系可用于在細胞培養中快速篩選:飽和誘變流程之后，細胞庫可用于為多個發育或病理學過程鑒定新基因功能。該新基因功能部分會是感興趣的藥物靶。最近公開了該篩選需要的技術(Carette等人，2009)。作為原理證明，發明人成功地進行了就蓖麻毒素-毒性的篩選及鑒定了蓖麻毒素毒性中涉及的多個新基因。
[0094]在下列實施例中展示本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系的詳細分析以及它們在各種遺傳和藥物篩選及方法，諸如允許飽和的遺傳隱性篩選及導致純合等位基因或正向遺傳篩選的可反轉的誘變流程中的應用。
[0095]在本發明的方法的優選的實施方式中，所述步驟(a)的非-受精的卵母細胞是體外成熟的卵母細胞。
[0096]在本發明的方法的另一優選的實施方式中，步驟(a)的卵母細胞通過使卵母細胞暴露于乙醇(優選5% )或氯化鍶(SrCl2)(優選25mM)來活化。
[0097]在本發明的方法的再優選的實施方式中，步驟(d)和/或(e)重復至少5次。
[0098]在本發明的方法的仍再優選的實施方式中，雌性受試者是哺乳動物，優選人受試者，非人靈長類動物，例如稱猴屬(例如食蟹猴(Macaca fascicularis),恒河猴(Macacamulatta))或狨猴屬(諸如狨毛猴(Callithrix jacchus))或大猿家族(例如大猩猩、黑猩猩和紅毛猩猩，但是在本發明的情景中特別排除人)，小鼠，大鼠，山羊，豬，馬，牛，貓，狗，綿羊或駱駝。
[0099]在本發明的方法的優選的實施方式中，所述細胞系的單倍體胚胎干細胞特征在于具有細胞周期的Gl期中的In染色體組和細胞周期的G2期中的2n染色體組。
[0100]在本發明的方法的另一優選的實施方式中，至少60 %，或優選65 %，70 %，75 %，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或甚至100%的產生的所述細胞系的胚胎干細胞是單倍體。
[0101]在本發明的方法的再優選的實施方式中，所述細胞系的單倍體胚胎干細胞特征在于表達選自下列的一種或更多胚胎干細胞標志物:堿性磷酸酶，0ct4, Sox2, Nanog, Klf4,Rexl, Klf2, cMyc Sall4，和 / 或 SSEA-10
[0102]在本發明的方法的仍再優選的實施方式中，所述細胞系的單倍體胚胎干細胞顯示穩定的生長至少50，55，60，65，70，75或甚至更多代。
[0103]在本發明的方法的也優選的實施方式中，所述細胞系的單倍體胚胎干細胞維持單倍性至少 7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，50 或甚至更多代。
[0104]在本發明的方法的另一優選的實施方式中，方法還包括分化所述細胞系的單倍體胚胎干細胞。
[0105]在本發明的方法的另外的優選的實施方式中，方法還包括遺傳修飾所述細胞系的單倍體胚胎干細胞。
[0106] 在進一步實施方式中，方法，還包括將本發明的單倍體細胞(優選已被例如由核酸序列諸如載體等的突變或插入的方式遺傳修飾的細胞)轉化為二倍體細胞。這些二倍體細胞是等基因的(包括同一組的性染色體)。
[0107]本發明還屬于由上述的本發明的方法產生的單倍體胚胎干細胞系。
[0108]此外，本發明也提供桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干-樣細胞系，其包含至少60%單倍體胚胎干細胞。
[0109]將關于本發明的方法所示的定義和實施方式就實際的情形應用于本發明的單倍體胚胎干細胞和細胞系。
[0110]此外，本發明涉及自本發明的桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干細胞或細胞系獲得的庫。該庫可用作以基因組尺度用于正向及反向遺傳學的工具。例如，發明人用之前報道的含有可反轉的基因阱的反轉錄病毒(Schnutgen等人，2008)感染了被稱為HMSc2-27的本發明的胚胎干細胞系之一的新鮮FACS純化的單倍體培養物的5X IO8細胞，以便展示單倍體小鼠ES細胞中誘變的功效。此載體也含有允許插入顯示干細胞中最小或無可檢測的表達的基因的可移出的Oct-4結合位點(Schnutgen等人，2008)。在感染之后，如自集落形成測定估計，產生7.5X IO6獨立基因組插入。然后合并胚胎干細胞集落及分析對應于3百萬細胞的IOyg的基因組DNA，以由反向PCR和深度測序定位病毒插入位點。發明人可明確地鑒定176，178個插入。考慮到此庫由40X更多(7.5X IO6)獨立整合組成，誘變流程在原理上具有破壞多數基因的攻效。此庫作為用于高通量反向遺傳學的工具的使用以更多細節顯示于下列實施例。簡言之，所述系統允許的產生用于微RNA處理酶Drosha的敲除細胞系。此外，在正向遺傳篩選中，Gprl07已被鑒定為對于由蓖麻毒素(用作生物武器的毒素)殺滅必要的分子。本領域技術人員會理解，導入本發明的單倍體胚胎干細胞的突變在所述胚胎干細胞的二倍體狀態是純合的。因此，所述二倍體胚胎干細胞也可用于正向及反向遺傳方法(見圖6:整合導致相應座位的純合突變)。
[0111]也由本發明包括的是試劑盒或測試系統，其包含本發明的桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干細胞或細胞系。
[0112]本文所用的術語“試劑盒”指稱工具的集合，其包含本發明的桑椹胚來源的或胚泡來源的單倍體胚胎干細 胞或細胞系和以即用方式在分離或常見的管形瓶中提供的用于實施本文所述的方法的使用說明冊。試劑盒可還包含PCR引物或與下列原型胚胎干細胞標志物特異性結合的抗體，諸如0ct4、Nanog、SSEA-1、堿性磷酸酶(AP)、Rexl、Sox2、KLf4, Klf2或Sall4,或在本文所述的其他標志物。多能ES細胞可特征在于0ct4和Nanog的高水平表達。維持干細胞多能性需要臨界量的0ct4和Nanog表達。當ES細胞被誘導分化時，0ct4和Nanog下調。ES細胞的未分化的狀態常常特征在于細胞表面抗原、SSEA-l、SSEA-3和SSEA-4的表達。SSEA-1在8-細胞階段的植入前-階段鼠胚胎的表面表達及已發現在畸胎癌干細胞的表面表達，但不在它們的分化的衍生物上表達。SSEA-3和SSEA-4在卵子發生期間合成及存在于卵母細胞膜、合子和早期卵裂-階段胚胎中。已提出這些碳水化合物-關聯的分子的生物學作用是控制發育期間的細胞表面相互作用。未分化的靈長類動物ES細胞、人ES細胞和人胚胎癌(EC)細胞表達SSEA-3和SSEA-4，但不表達SSEA-1。但是，未分化的小鼠ES細胞確實表達SSEA-1，但不表達SSEA-3或SSEA-4。堿性磷酸酶是血、腸、肝和骨細胞中的酶及作為共享共同的蛋白結構但碳水化合物含量不同的糖蛋白的膜結合同種型存在。這些酶在堿性PH最有活性，因此得名。未分化的人EC、ES和胚胎生殖(EG)細胞已顯示表達非常高水平的堿性磷酸酶的肝/骨/腎同工酶。堿性磷酸酶的表達水平隨干細胞分化而減小。在另一優選的實施方式中，試劑盒可包含特異于下列系定型標志物的PCR引物，諸如，例如，Handl (中胚層和滋養外胚層),Nkx2_5和Brachyury (均中胚層),巢蛋白(神經),Gata4, Gata6, Foxa2 (全部早期內胚層)，Soxl7 (內胚層和中胚層)，Cxcr4R(內胚層)，及角蛋白18(外胚層)。其他標志物描述于下列實施例。鑒于此，本發明的試劑盒可用于，例如，研究單倍體胚胎干細胞體外和體內分化(潛力)(例如在畸胎瘤測定中)。在另一優選的實施方式中，試劑盒包含用于施用本文所述的單倍體胚胎干細胞的另外的設備，諸如注射器和注射針，其可用于例如將本發明的單倍體胚胎干細胞注射進胚泡，以便產生轉基因或敲除小鼠。使用說明包含關于細胞培養條件，待施用的細胞數，施用途徑等的信息。在再優選的實施方式中，試劑盒包含自本發明的桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干細胞或細胞系獲得的庫。
[0113]本發明也涉及測試系統，其包含本發明的桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干細胞或細胞系。測試系統對于藥物開發是特別有用的，如顯示于下列實施例。
[0114]其也在本發明的方法和單倍體胚胎干細胞和細胞系中優選的是，源于胚泡的胚胎干細胞源于胚泡的內細胞團(ICM)的。還在本發明的方法和單倍體胚胎干細胞系中優選的是，源于胚泡的胚胎干細胞源于滋養層，優選Oct-4過表達滋養層。
[0115]胚胎干細胞和滋養層干(TS)細胞均源于早期胚胎，然而這些細胞具有不同分化性質。胚胎干細胞可分化為全部3胚層細胞類型，然而TS細胞可僅分化為胎盤細胞。尚未測定是否TS細胞可轉變為ES-樣多能干(PS)細胞。在由Wu等人(2011)的新近研究中，已發現TS細胞中單轉錄因子，Oct-4的過表達足以將TS細胞重編程為多能狀態。這些Oct-4-誘導的PS(OiPS)細胞具有胚胎干細胞的表觀遺傳特征,包括X染色體復活,提升的H3K27me3修 飾，及Oct-4和Nanog基因中啟動子區的低甲基化。同時，Elf5基因的啟動子區的甲基化在TS細胞的重編程期間發生。OiPS細胞的基因表達譜非常類似于ESC。而且，OiPS細胞可體外和體內分化為3胚層細胞類型。更重要地，具有種系傳遞的嵌合小鼠可自OiPS細胞有效產生。這些結果展示，一種單轉錄因子，Oct-4，可將非-胚胎TS細胞重編程為PS細胞(Wu等人(2011))。
[0116]本發明的單倍體細胞開啟了通過單倍體基因組的攻效與干細胞的多能性組合來以基因組尺度揭開定義的細胞類型的根本性的生物學過程的可能性。本發明的細胞可因此用于突變分析，包括正向及反向遺傳學。
[0117]例如，本發明提供具有單倍體基因組的細胞用于突變分析的用途，包括將突變導入目標遺傳座位，及觀察與所述遺傳座位相關的細胞的修飾的活性。具有單倍體基因組的細胞優選是哺乳動物細胞，尤其具有上述干細胞樣性質(諸如分化為EB的能力)的哺乳動物細胞，尤其是由發明的方法獲得的或可獲得的細胞。也可使用其他單倍體細胞諸如由Leeb 等人(2011)、W02001/32015A1、W02012/117254A1 或 Elling 等人(2011)描述的細胞。由于本發明的細胞的單倍體性質，隱性突變可由于其他染色體中其他拷貝的單基因的缺失而以增加的效率加以研究。由此，優選本發明的細胞用于研究本發明的單倍體細胞中的隱性和/或單拷貝基因。
[0118]同樣，對于本發明的細胞的此用途以及進一步的用途，可選擇以單倍體形式穩定至少10代的細胞，優選細胞可由本發明的方法獲得或由本發明的方法獲得。在例如。10代后，應仍有至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少75 %的初始單倍體細胞，尤其在目標遺傳座位具有導入的突變的初始單倍體細胞。該目標遺傳座位可例如是Drosha或Rarg0
[0119]尤其是，本發明允許導入必要的基因(諸如Dosha)的條件性敲除或通過使用適合的條件性突變載體，例如包含可反轉的基因捕獲敲入致死基因。條件性敲除優選輔助可在刺激后被逆轉為基因-活性狀態的可反轉的突變，例如在雙-Flex系統中(Schnutgen等人.2008 ；W02006/056615A1 ；W02006/056617A1 ；W02002/88353A2 ；W02001/29208A1 ；也見圖15)。由此，在本發明的優選的實施方式中，由隨機(正向)或定點(反向)誘變將可反轉的突變導入單倍體細胞。適合的載體包含具有可反轉的突變的插入盒，例如可使用敲除。在突變之后，細胞可以是或可不是轉變的二倍體細胞。此通常對細胞的可用性無效應，由于在二倍化后，突變會是純合的。尤其優選地，使用2個或更多不相容的反向盒，諸如不相容的 1οχΡ/1οχ5171 和 FRT/F3 位點對。
[0120]一旦細胞已分化(例如上述)或“修復”座位，在野生型條件下分化細胞，然后再次轉動插入而在(任選地末端)分化的細胞類型中誘變，則也可進行反轉。
[0121]開發可反轉的誘變流程，其允許飽和的遺傳隱性篩選及導致純合等位基因。此系統允許就微RNA處理酶Drosha產生第一敲除細胞系。
[0122]由此，本發明還提供本發明的單倍體細胞的細胞培養物的細胞，其中一個或更多目標基因已被失活。優選細胞是細胞培養物，其中全部細胞已被類似地修飾。尤其提供的是無飼養體的單倍體哺乳動物細胞。無飼養體，或飼養細胞獨立性如在上述。
[0123]還提供的是包含基因Drosha和/或Rarg的敲除的單倍體哺乳動物細胞。所述細胞優選具有上述干細胞-樣表型及例如能分化為EB。所述細胞優選是由發明的方法獲得的或可獲得的細胞培養物。
[0124]也提供的是如下方法，其在單倍體細胞中諸如由敲除或敲落修飾目標基因的表達，及觀察與所述目標基因相關的細胞的修飾的活性。
[0125]在遺傳分析和誘變的進一步方法中，本發明的細胞可用于典型正向遺傳學。隨機突變，尤其插入突變，可導入單倍體細胞的基因組中，其導致不同表型，其進而可在選擇的細胞中分析。突變可導致基因表達的增加或減小。減小，包括表達的完全消除，可在基因被突變破壞時發生。當例如啟動子活性增加或阻遏物被破壞或自目標基因移除時，增加是可能的。
[0126]本發明的單倍體細胞的可用性可通過導入表達盒或表達報告子增加。因此，本發明提供，優選如上獲得的，包含表達盒或表達報告子的單倍體哺乳動物細胞。還提供的是產生該細胞的方法，包含獲得單倍體哺乳動物細胞，優選如上獲得的，及導入表達盒或表達報告子。表達報告的實例包括陽性或陰性選擇標志物，諸如抗生素抗性基因，HPRT1，白喉毒素，生物發光蛋白。表達報告子可由在特定目標條件活化的預選擇的啟動子驅動。該條件可為細胞的發育階段，尤其一定程度的分化或特定細胞類型。該啟動子可由基因組，預選擇的DNA部分，尤其是轉基因，諸如BAC轉基因的特定DNA修飾的發生，或通過目標特定遺傳元件整合進特定基因座位而活化。該遺傳元件可為將在以下詳述的敲除構建體。
[0127]由此，本發明也涉及產生包含目標表型的細胞，包含隨機突變多個具有單倍體基因組的細胞，優選哺乳動物細胞，尤其優選可由發明的方法獲得的或由發明的方法獲得的細胞，及選擇具有目標表型的細胞的方法。
[0128]該目標表型是例如細胞存活或細胞生長，尤其當使所述細胞與毒素或生長抑制物接觸時。由此，可產生具有對所述毒素或生長抑制物的抗性中涉及的修飾的基因的細胞。可然后分析遺傳突變及鑒定所述基因。[0129]該毒素是例如蓖麻毒素或蓖麻毒素-樣毒素。毒素可為核糖體-抑制蛋白，諸如PAP, PAP-S, PAP-1I，商陸毒蛋白(dodecandrin)，蓖麻毒素或蒴蓮根毒素或毒性，尤其有酶學活性的，其部分，諸如酶促鏈樣蓖麻毒素A鏈或蒴蓮根毒素A鏈(Ready等人，1984)。尤其優選的毒素是AB5毒素,或包含毒性活性的AB5毒素的A亞基。AB5毒素是例如彎曲菌屬(Campylobacter)腸毒素,霍亂毒素,熱-不穩定的腸毒素(例如.LT和LT-1I),百日咳毒素，志賀毒素，vero細胞毒素，EHEC毒素，假單胞菌外毒素A。用發明的方法，由該正向遺傳篩選將基因Gprl07鑒定為對于由蓖麻毒素(用作生物武器的毒素)殺滅必要的分子是可能的。基于此原理證明，現在當然也可能產生抗性細胞及鑒定針對任何其他毒素或生長抑制物或誘導變化的表型的其他劑的關聯基因。
[0130]對有力的毒素(諸如蓖麻毒素)的抗性發展展示，本發明的單倍體干細胞突變系統能篩選及獲得實際上是任何毒素或生長抑制物，優選包括毒性蛋白、毒性小分子或毒性病原體的抗性。
[0131]本發明的隨機突變導入優選是非-定點的和可潛在地靶向基因組中的任何位點。優選的突變誘導物是反轉錄病毒或慢病毒感染或能插入基因組的核苷酸構建體，諸如轉座子的使用。當然可存在少數該插入構建體或病毒誘變原的位點偏好，但通常可潛在地靶向多數基因。通常發明的突變是基因破壞，防止或減少功能性基因產物的基因表達。可通過使細胞接觸誘變化學品或暴露于輻射實現進一步隨機突變。
[0132]為有效隨機誘變，在這些實驗中使用多個細胞，各細胞潛在地獲得不同突變。優選使用至少1000個細胞，尤其優選至少5000，至少10000，至少50000，至少100000，至少200000，至少500000或至少1000000個細胞。
[0133]也提供的是由所述 方法獲得的或可獲得的細胞，其對毒素或生長抑制物具有抗性。例如提供對目標毒素(優選上述蓖麻毒素)或核糖體抑制性毒素(諸如PAP，PAP-S，PAP-1I，商陸毒蛋白，蓖麻毒素或其蒴蓮根毒素或毒性(核糖體抑制性)部分，或上述AB5毒素)具有抗性的單倍體細胞。
[0134]本發明也提供就在毒素抗性中具有活性的基因靶方面篩選細胞的方法，其包括產生具有毒素或生長抑制物抗性的細胞，還包括鑒定相比無隨機突變的細胞，所述具有毒素抗性的細胞中的所述突變。
[0135]當已由發明的隨機篩選鑒定需要修飾(尤其抑制，而且增加的表達)的目標基因時，通過修飾鑒定的基因的表達，例如由敲除或敲落突變(為表達減小)或導入包含所述基因的表達載體(為表達增加)修飾其他細胞也是可能的。已就蓖麻毒素抗性鑒定該基因，其包括選自表1或表2的基因，尤其是6?1'107，卩此9，1\^711，51。35。1，卩8仕2，631社2，]^(11，B4galtl, B4galnt3, Plcd3, Ror2, Samd4b, Gcnt2, Ggtal。對于本發明的此方面和再一方面尤其優選的是Gprl07，Fut9和/或Slc35cl。可，例如由敲除或敲落抑制這些基因，從而產生對上述蓖麻毒素或其他毒素具有增加的抗性的細胞。該產生的細胞可為單倍體細胞，諸如以上描述的，其已被用于鑒定這些靶，但也可為其他細胞，包括二倍體細胞。細胞，包括二倍體細胞可來自就本發明的單倍體細胞所述的相同的動物源。
[0136]由此，本發明也提供修飾，優選如由上述發明的方法獲得的哺乳動物單倍體細胞，及抑制目標基因或修飾遺傳座位的方法。優選該抑制是由敲除突變(例如由阻止目標基因表達的滅活基因構建體的同源重組輔助，或由通過使用序列特異性核酸酶修飾目標基因)，或由敲落(尤其使用RNAi，包括siRNA或shRNA的抑制性核酸)。可之前已用就特定目標表型選擇由本發明的隨機誘變篩選鑒定或不鑒定目標基因。目標基因可選自表1或表2的基因，優選 Gprl07, Fut9, Tcf711, Slc35cl, Fgfr2, Galnt2, Midi, B4galtl, B4galnt3, Plcd3,Ror2，Samd4b，Gcnt2，Ggtal或其任何組合。也提供的是可由此方法獲得的哺乳動物單倍體細胞，其相比非-修飾的親本哺乳動物單倍體細胞包含基因的抑制。
[0137]尤其是，本發明提供對蓖麻毒素具有增加的抗性的修飾的細胞，其相比未修飾的細胞(例如無修飾的相同的類型的親本細胞)包含表1或2的基因的蛋白中的任何一種的減少的表達，優選 Gprl07，Fut9，Tcf711，Slc35cl，Fgfr2，Galnt2，Midl，B4galtl，B4galnt3，Plcd3, Ror2, Samd4b, Gcnt2, Ggtal或其組合。所述修飾可由尤其優選通過施用抑制性核酸，諸如是或編碼抑制性RNS，包括siRNA或shRNA的核酸敲除或敲落。該修飾的細胞可為單倍體細胞，尤其由本發明獲得的細胞或任何其他細胞。優選細胞是哺乳動物細胞和/或非-人細胞。在其他實施方式中，細胞可為人細胞。優選細胞是分離的和/或體外或離體細胞。在其他實施方式中 ，細胞可為體內，例如在活體中。細胞可為單倍體，例如由發明的方法獲得的，或二倍體。細胞，包括二倍體細胞，可來自用于發明的單倍體細胞的上述相同的動物源。
[0138]如本文所用，〃離體〃細胞培養物指稱培養身體之外的細胞。離體細胞培養包括例如，在懸浮液，或在單-或多-孔板中的體外細胞培養。離體培養也包括與2種或更多不同細胞類型共培養細胞，及在2-或3-維支持物或基質中或上培養，包括單獨培養細胞或與其他細胞類型培養的方法，從而形成人工組織。
[0139]本發明還涉及鑒定針對毒素的治療劑的方法，包含鑒定上述基因靶及使治療性候選分子與所述基因靶或所述靶的基因產物，優選在分離的細胞中接觸，及鑒定候選體與基因靶或基因產物的結合事件或修飾的細胞對毒素的抗性。毒素優選是上述蓖麻毒素或核糖體抑制性毒素，諸如PAP、PAP-S、PAP-11、商陸毒蛋白、蓖麻毒素或其蒴蓮根毒素或毒性(核糖體抑制性)部分、或上述AB5毒素，及優選選自下列的基因靶:表1或2，尤其是Gprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2或Ggtal。但是，當然可選擇其他毒素或生長抑制物，以鑒定涉及抗性的基因靶。原理上，通過攻擊本發明的細胞培養物，就其作為針對毒素的治療劑的活性測試任何種化合物是可能的。一旦已根據本發明鑒定基因靶(包括其基因產物、編碼的蛋白)，直接測試化合物結合、調節、增加或減小尤其失活這些基因靶(包括編碼的蛋白)的活性是可能的。由于對于多數目標生物已完成基因組測序工程，一旦已鑒定基因靶，就知道靶基因的序列。然后容易篩選靶向這些基因或轉錄的mRNA的候選抑制物。由此可容易篩選候選核苷酸抑制物。蛋白的抑制物可通過接觸化合物庫而鑒定結合該蛋白的活性化合物來獲得。然后可通過直接分析對本發明的蛋白或細胞或細胞培養物的活性來確認結合劑的毒素抗性活性。靶向蛋白的優選的抑制物類別是抗體。可通過對模型動物，諸如小鼠，大鼠，其他嚙齒動物，如倉鼠或兔，山羊，等進行免疫容易產生針對這些靶蛋白的抗體。本文所用的抗體也包括結合靶蛋白的抗體片段，包括具有Fv部分的片段，包括F(ab’)，F(ab)或F(ab)2抗體。
[0140]本發明也涉及治療受試者或細胞中的毒素，尤其蓖麻毒素中毒，或在受試者或細胞中誘導蓖麻毒素抗性的方法，包括對所述受試者抑制表1或表2的基因或其基因產物中的任何一種，優選 Gprl07，Fut9，Tcf711，Slc35cl，Fgfr2，Galnt2，Midl，B4galtl，B4galnt3，Plcd3, Ror2, Samd4b, Gcnt2或Ggtal。毒素可為蓖麻毒素-樣毒素。毒素可為核糖體-抑制蛋白，諸如PAP，PAP-S, PAP-1I，商陸毒蛋白，蓖麻毒素或蒴蓮根毒素或毒性，尤其其酶學活性的部分，諸如酶促鏈，如蓖麻毒素A鏈或蒴蓮根毒素A鏈(Ready等人，1984)。尤其優選的毒素是AB5毒素,或包含毒性活性的AB5毒素的A亞基。AB5毒素是例如彎曲菌屬(Campylobacter)腸毒素,霍亂毒素,熱-不穩定的腸毒素(例如LT和LT-1I),百日咳毒素，志賀毒素，veix)細胞毒素，EHEC毒素，假單胞菌外毒素A。抑制可通過施用抑制物來抑制。所述基因的抑制物涉及這樣的化合物，其降低所述基因或它們的相應基因產物(包括表達的蛋白)的表達或活性水平。所述抑制物可為抗體或抑制性核酸，尤其包含或編碼小抑制性RNA分子，尤其優選減少細胞中所述基因的mRNA表達或含量至少20%，尤其至少50%的抑制性核酸。核苷酸抑制物可選自反義分子，核酶或小抑制性RNA分子(小干擾RNA (siRNA)；在本發明的含義中，調控RNA諸如〃微RNA" ("miRNA")和〃短發夾RNA" ("shRNA")與術語"siRNA"互換使用)。抑制可通過減少表達、蛋白含量或活性來抑制。
[0141]核苷酸-型抑制物的特定實施方式采用RNA干擾(RNAi)的應用。RNAi是由在序列上與沉默的基因同源的雙-鏈RNA起始的序列-特異性轉錄后基因沉默的過程。21~22個核苷酸的小干擾RNA(SiRNA)雙聯體被顯示為抑制哺乳動物細胞中的基因功能的有力的工具。優選用于短干擾RNA的穩定的表達的基于載體的系統。這些系統基于載體，其中編碼siRNA的合成的、基因-特異性靶序列在適宜于小的非-編碼RNA的轉錄的啟動子控制下表達。由此，在將其由標準轉染(例如電穿孔、脂轉染)或病毒感染流程(例如反轉錄病毒感染)導入哺乳動物細胞后，自載體產生siRNA。適合的小干擾RNA分子可容易由本領域知道的方法選擇。例如常見的是合成多個約20-50個不同的長21或22個核苷酸的所述雙聯體及接觸測試細胞。選擇具有靶基因表達降低最多的細胞。根據本發明，使用單倍體細胞的表型(例如毒素或生長抑制物抗性)作為標志物來選擇最佳抑制性RNA分子當然也是可能的。選擇設計siRNA的方法(包括選擇祀向的序列，制備siRNA雙聯體,載體設計和遞送)為本領域所熟知，例如詳細描述于US7，235，654。
[0142]作為siRNA的替代，可將反義寡核苷酸用作核苷酸-型抑制物來干擾靶基因、基因產物或蛋白的表達。反義寡核苷酸是互補于靶mRNA的區和可特別抑制特定轉錄物的表達的核苷酸的短延伸物。反義核酸可采取從已轉染進細胞的載體表達的RNA的形式或采取可通過各種手段例如利用陽離子脂質體、陽離子卟啉、融合肽和人工病毒體或用鏈球菌溶血素-O和電穿孔的細胞滲透化導入細胞的DNA或RNA寡核苷酸的形式。陽離子脂質與寡核苷酸形成穩定的復合物，其呈現改善的細胞攝取，由此導致增強的反義活性。
[0143]在進一步實施方式中，本發明涉及針對靶基因、基因產物或蛋白的核酶。與反義寡核苷酸類似，核酶通過Watson Crick堿基配對結合于底物RNA,其導致轉錄物的序列-特異性切割。由于它們的小尺寸和快速動力學，已廣泛地研究2種類型的核酶，錘頭核酶和發夾核酶。它們的應用已在幾個出版物中有綜述。核酶可由各種手段輸入細胞，如上就反義寡核苷酸所述，或它們可自載體表達，這提供這些分子的持續的細胞內產生的優勢。
[0144] 優選地，核苷酸-型抑制物從病毒載體例如反轉錄病毒或腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或慢病毒載體產生。
[0145]在一實施方式中，將核苷酸-型抑制物或編碼核苷酸-型抑制物的構建體通過轉染，即由"裸露的"DNA的遞送或在與膠體分散系統的復合物中遞送到細胞。膠體系統包括大分子復合物，納米囊，微球，珠和基于脂質的系統，包括水包油乳劑，微團，混合的微團，樹狀聚體和脂質體。膠體系統可為脂質-復合的或脂質體-配制的核苷酸-型抑制物。然后可通過使用知道的方法和材料實現抑制物，例如與各種脂質或脂質體材料的制劑化，及遞送給受者細胞或哺乳動物。
[0146]具體優選的是表1或表2的任一種基因的小分子抑制物，優選巖藻糖基化中涉及的基因，諸如Fut9或Slc35cl。這些抑制物的分子靶可為基因產物，即編碼的蛋白，或調控蛋白。優選的巖藻糖基化抑制物公開于(Biichsel等人，1980，Burkart等人，2000 ；Lee等人，2003, Hosoguchi等人，2010 ；Rillahan等人，2012)。抑制物也可為巖藻糖基轉移酶FucTII1、V、VI和/或VII的抑制物。尤其優選抑制物包含氟化的巖藻糖，諸如2F或6F氟化的巖藻糖，尤其優選2F-過乙酰-巖藻糖、6F-過乙酰巖藻糖、⑶P-2F-巖藻糖、⑶P-6F-巖藻糖(Rillahan等人，2012，Burkart等人，2000)。還優選的抑制物是胞苷_5’ -單磷酸-5-乙酰胺基-9-疊氮基-3，5，9-三脫氧-β -D-甘油基-r-D-半乳糖型-壬_2_酮糖酸、5-疊氮基乙酰胺基_3，5-雙脫氧-D-甘油基-β -D-半乳糖型-壬-2-噻吩基-1-甲基酯、5-疊氮基乙酰胺基_3，5-雙脫氧-D-甘油基-β -D-半乳糖型-壬-2-酮糖-1-甲基酯、5-疊氮基乙酰胺基_3，5-雙脫氧-D-甘油基-r，β -D-半乳糖型-壬_2_酮糖酸、胞苷-5’-單磷酸-5-疊氮基乙酰胺_3，5-雙脫氧-β -D-甘油基-r-D-半乳糖型-壬_2_酮糖酸、胞苷-5’ -單磷酸-5-(2-(4-((8R,9S, 13S, 14S, 17S)-3, 17- 二羥基-13-甲基-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-十氫-6H-環戊[a]菲-17-基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)乙酰胺基)_3，5-雙脫氧-β -D-甘油基-r-D-半乳糖型-壬-2-酮糖酸；6_脫氧-6- (2-(4- ((8R, 9S, 13S, 14S, 17S) -3, 17- 二羥基-13-甲基-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-十氫-6H-環戊-[a]菲-17-基)-1H-1, 2，3-三唑_1_基))-β -L-吡喃半乳糖-1-基-鳥苷5，- 二磷酸；6-脫氧-6-(1-甲基-4- (4-戊基苯基)-1H-1, 2，3-三唑-1-基)-β -L-吡喃半乳糖-1-基-鳥苷5’ - 二磷酸(Hosoguchi等人，2010) ;OTP_巖藻糖化合物諸如式I的化合物:
[0147]式I (Lee 等人，2003):
[0148]
【權利要求】
1.產生單倍體細胞的哺乳動物細胞系的方法，包括在發育的聚集胚胎階段，優選胚泡階段，獲得多個單倍體細胞，分離所述多個細胞，擴增分離的所述多個細胞，自所述擴增的細胞選擇及分離一個或更多具有單倍體基因組的單細胞，由此獲得穩定單倍體細胞的細胞系的細胞。
2.權利要求1的方法，還包括下列步驟:獲得所述哺乳動物的單倍體單性生殖卵母細胞或胚胎細胞，將所述卵母細胞或胚胎細胞轉移進假孕雌性，使所述卵母細胞或胚胎細胞生長至多細胞階段，任選地將所述多細胞階段的細胞培養至胚泡階段，由此提供在發育的聚集胚胎階段的所述多個單倍體細胞。
3.權利要求1或2的方法，還包括培養所述細胞培養物的細胞，及在達50代之后自所述細胞培養物分離單倍體細胞，及擴增所述分離的單倍體細胞作為新持續的細胞培養物。
4.權利要求1~3之任一項的方法，其中親本細胞是雜合的或純合的，優選雜合的。
5.產生源于單性生殖桑椹胚或胚泡的多能單倍體胚胎干細胞系的方法，所述方法包括: (a)自雌性受試者體外活化非-受精的卵母細胞，以誘導單性生殖發育； (b)培養所述步驟(a)的活化的卵母細胞，以產生桑椹胚和/或胚泡； (C)自所述步驟(b)的桑椹胚和/或胚泡分離胚胎干細胞及，任選地，將所述胚胎干細胞轉移進抑制所述胚胎干細胞分化的細胞培養基； (d)使步驟(c)的胚胎干細胞經歷FACS分析及鑒定和/或富集顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞；以及 (e)任選地，顯示單倍體DNA內含的胚胎干細胞的重復的FACS純化和所述胚胎干細胞的擴增， 由此產生單倍體胚胎干細胞系。
6.權利要求5的方法，其中所述步驟(a)的非-受精的卵母細胞是體外成熟的卵母細胞。
7.權利要求5或6的方法，其中步驟(a)的卵母細胞通過使卵母細胞暴露于乙醇(優選5% )或氯化鍶(SrCl2)(優選25mM)來活化。
8.權利要求5~7之任一項的方法，其中步驟(d)和/或(e)重復至少5次。
9.權利要求1~8之任一項的方法，其中雌性受試者是哺乳動物或所述細胞是哺乳動物的細胞，所述哺乳動物優選選自人、非人靈長類動物諸如稱猴(例如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(Macacamulatta))或狨猴屬或大猿(例如大猩猩、黑猩猩和紅毛猩猩)、小鼠、大鼠、山羊、貓、狗、綿羊或駱駝。
10.權利要求1~9之任一項的方法，其中所述細胞系的單倍體胚胎干細胞特征在于具有細胞周期的Gl期中的In染色體組和細胞周期的G2期中的2n染色體組。
11.權利要求1~10之任一項的方法，其中至少60%的產生的所述細胞系的胚胎干細胞是單倍體。
12.權利要求1~11之任一項的方法，其中所述細胞系的單倍體胚胎干細胞特征在于表達一種或更多下列胚胎干細胞標志物:堿性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Rexl、Klf2、cMyc Sall4、和 / 或 SSEA-10
13.權利要求1~12之任一項的方法，其中所述細胞系的單倍體胚胎干細胞顯示穩定的生長至少50代。
14.權利要求1~13之任一項的方法，其中所述細胞系的單倍體胚胎干細胞維持單倍性至少7代。
15.權利要求1~14之任一項的方法，還包括分化所述細胞系的單倍體胚胎干細胞。
16.權利要求1~15之任一項的方法，還包括遺傳修飾所述細胞系的單倍體胚胎干細胞。
17.權利要求1~16之任一項的方法，其中包括通過培養內細胞團、源于內細胞團或滋養層或胚泡外生的細胞來維持細胞，或其中分離所述多個細胞包括優選通過多細胞階段一優選胚泡一的胰蛋白酶消化來使多細胞階段一例如整個胚泡一的細胞個體化。
18.權利要求1~17之任一項的方法，其中個體細胞增殖及生長為細胞培養物(亞克隆)。
19.權利要求1~18之任一項的方法，其中優選在飼養層上維持之后，將細胞在無飼養細胞的培養條件下維持或生長。
20.桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干-樣細胞系，其由權利要求1~19之任一項的方法產生。
21.桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干-樣細胞系，其包含至少60%單倍體胚胎干細胞。
22.測試系統或試劑盒，其包含權利要求20或21的桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干細胞系。
23.前述權利要求之任一項，其中源于胚泡的胚胎干細胞源于胚泡的內細胞團(ICM)。
24.前述權利要求之任一項，其中源于胚泡的胚胎干細胞源于滋養層，優選過表達0ct4的滋養層。
25.具有單倍體基因組的細胞的細胞培養物，其可由權利要求1~19之任一項的方法獲得。
26.突變分析的方法,包括給細胞優選哺乳動物細胞提供單倍體基因組,包括向所述細胞中的目標遺傳座位導入突變，及觀察與所述遺傳座位相關的細胞的修飾的活性。
27.權利要求26的方法，其中細胞以單倍體形式穩定至少10代，優選細胞可由權利要求I~16之任一項的方法獲得或由權利要求1~16之任一項的方法獲得。
28.權利要求25的細胞培養物的細胞，其中一個或更多目標基因已被失活。
29.單倍體哺乳動物細胞，其包含基因Drosha和/或Rarg的敲除，優選其中所述細胞具有權利要求25的細胞培養物。
30.產生包含目標表型的細胞的方法，包括隨機突變多個具有單倍體基因組的細胞，優選哺乳動物細胞，尤其優 選可由權利要求1~19之任一項的方法獲得或由權利要求1~19之任一項的方法獲得的細胞，及選擇具有目標表型的細胞。
31.權利要求30的方法，其中目標表型是當使所述細胞與毒素或生長抑制物接觸時，細胞存活或細胞生長。
32.權利要求31的方法，其中所述毒素是蓖麻毒素。
33.權利要求30~32之任一項的方法，其中所述多個細胞包含至少1000個細胞。
34.單倍體細胞，其對于毒素優選蓖麻毒素具有抗性，可由權利要求30~33之任一項的方法獲得。
35.就在毒素抗性中具有活性的基因靶篩選細胞的方法，包括產生根據權利要求31~33之任一項的具有毒素抗性的細胞，還包括鑒定相比無所述隨機突變的細胞，所述具有毒素抗性的細胞中的突變。
36.鑒定針對毒素的治療劑的方法，包括根據權利要求35鑒定基因靶及使治療性候選分子與所述基因靶或所述靶的基因產物，優選在分離的細胞中接觸，及鑒定候選體與基因靶或基因產物的結合事件或修飾的細胞對毒素的抗性。
37.權利要求36的方法，其中毒素是蓖麻毒素和優選選自下列的基因靶:Gprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2 或 Ggtal0
38.治療受試者中的AB5毒素中毒優選蓖麻毒素中毒或誘導受試者中的AB5毒素抗性蓖麻毒素抗性的方法，包括對所述受試者抑制表1、2的基因中的任何一種，優選Gprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2或Ggtal，優選其中抑制是通過施用抑制物，尤其特異于表1或2的基因的基因產物中的任何一種的抗體，所述基因優選下列基因:Gprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2 或 Ggtal,或抑制性核酸，尤其包含或編碼siRNA或shRNA，尤其優選減少細胞中所述基因的mRNA至少20%、尤其至少50%的抑制性核酸。
39.對AB5毒素、尤其蓖麻毒素具有增加的抗性的修飾的細胞，其相比對毒素無增加的抗性的未修飾的細胞包含表1或2的基因中的任何一種的減少的表達，所述基因優選下列基因:Gprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2> Samd4b、Gcnt2、Ggtal 或其組合。
40.治療AB5毒素中毒優選蓖麻毒素或假單胞菌外毒素A中毒的方法，包括施用巖藻糖基化抑制物，優選小分子巖藻糖基化抑制物，尤其優選其中所述抑制物抑制Fut9和/或Slc35cl。
【文檔編號】C12N5/0735GK104024404SQ201280065785
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年11月30日 優先權日:2011年11月30日
【發明者】U·艾林, J·彭寧格, J·陶貝茨米德 申請人:分子生物技術院有限公司