一種海參源枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】一種海參源枯草芽孢桿菌按如下方法獲得：將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現有的牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37℃恒溫條件下培養2天；挑取單個形態各異的菌落反復劃線培養至出現純菌株，得海參源（共附生菌株）枯草芽孢桿菌HS22（BacillussubtilisHS22）菌株。本發明提供的菌株及其代謝產物抑菌活性強，對植物有促生長作用，并對海蝦無節幼體具有一定毒性，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產物可應用于醫藥抑菌、抗腫瘤、生物防治、食品保鮮、防腐和化妝品添加劑等領域，具有產業價值。
【專利說明】一種海參源枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業、食品及醫藥領域，特別是一種海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 (.Bacillus subtilis HS22)菌株及其在對細菌和植物病原菌的生長抑制、對植物的促生長、其代謝產物在抑菌方面的應用。
【背景技術】
[0002]海參屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱動物(Holothuroidea)。全世界約有1200種海參，主要生活在熱帶和溫帶的海洋中，常見的可食海參有刺參、梅花參、白瓜參，這些海參除了食用價值之外，還含有豐富的生物活性物質，如海參毒素、海參多糖、海參皂苷、脂肪酸、多肽、海參神經節苷酯等，這些成分具有多種生物活性。另海參體內及腸道內生活著大量的細菌，這些細菌具有獨特的結構與功能，但這些微生物及其代謝產物迄今未止還沒有被充分利用。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種制備工藝簡單、成本低的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株，以利用海參體內的有益物質，在細菌和植物病原菌的生長抑制方面、對植物的促生長方面發揮作用。
[0004]本發明的一種海參源枯草芽孢桿菌，按如下方法獲得:
a.將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現有的牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37°C恒溫條件下培養2天。
[0005]b.挑取單個形態各異的菌落反復劃線培養至出現純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應陽性，V.P反應之后的pH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑取；該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
[0006]本發明的一種海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株的在對細菌和植物病原菌的生長抑制、對植物的促生長、其代謝產物在抑菌方面的應用。
[0007]本發明提供的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus sub tillsHS22)菌株及其代謝產物抑菌活性強，對植物有促生長作用，并對海蝦無節幼體具有一定毒性，制備方法簡單，成本低廉，菌株及其代謝產物可應用于醫藥抑菌、抗腫瘤、生物防治、食品保鮮、防腐和化妝品添加劑等領域，具有產業價值。
[0008]本發明中的海參共附生枯草芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
【具體實施方式】
[0009]本發明的海參源(共附生菌株)枯草芽孢桿菌HS22 {Bacillus subtilis HS22)菌株按如下方法獲得，
a.將剛打撈的中國黃海海域的新鮮海參，在超凈工作臺內用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨后，將200 μ L研磨液均勻涂布于現有的牛肉膏蛋白胨平板培養基上，37 °C恒溫培養2天。
[0010]b.挑取單個形態各異的菌落反復劃線培養至出現純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22 (Bacillus subtilis HS22)菌株，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應陽性，V.P反應之后的PH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑取；該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
[0011]用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性。
[0012]抑菌活性的檢測:大腸桿菌co7i (EC)、變形桿菌/7Toiew1S vulgaris(?^0、金黃色葡萄球菌5^<3/7力_770<^9<^^/5.aureus (SA)、產氣桿菌aerogenes(EA)和枯草芽孢桿菌(BS)均采用現有的牛肉膏蛋白胨培養基。上述各菌均受贈于中科院大連化學物理研究所。將各菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，振蕩培養24 h作指示菌。
[0013]分別用移液槍取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，用無菌三角涂棒涂抹均勻，然后用記號筆在培養皿底部的外面將牛肉膏蛋白胨固體培養基培養皿分成六個區，每個區分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移取海參共附菌株(純菌株)發酵物樣品10 μ L滴到濾紙片中央，置于37°C培養箱中培養三天。每個純菌株做3次重復處理，陽性對照為75%酒精，陰性對照為無菌水。觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。
[0014]其中HS22菌株發酵液對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，抑菌圈平均直徑為10 mm，對該抑菌活性菌株利用16SRNA分子鑒定確定其為芽孢桿菌屬，通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產糊精結晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發酵、硝酸鹽還原、產生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為枯草芽孢桿菌。
[0015]c.采用正交試驗(Table I)對HS22菌株進行抑菌條件優化，利用極差分析法對試驗結果進行分析，得到分別得到抑制不同指示菌的最優條件，通過綜合平衡分析和實驗驗證，評價其抑制細菌指示菌活性的較優條件為淀粉、硝酸鉀、NaCl, K2HP04、MgS04、FeS04的添加量分別為1.5%、2%、0.05%,0.05%,0.05%,0.001%，控制培養基初始pH為5，40°C培養4 cL
[0016]Tablel Orthogonal factors and levels
【權利要求】
1.一種海參源枯草芽孢桿菌，其特征在于:按如下方法獲得: a.將打撈出水的新鮮海參，在超凈工作臺內用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海參體壁用研磨機充分研磨成均漿后，將研磨液均勻涂布于現有的牛肉膏蛋白胨平板培養基上，在37°C恒溫條件下培養2天； b.挑取單個形態各異的菌落反復劃線培養至出現純菌株，即得海參共附生枯草芽孢桿菌HS22(Bacillus subtilis HS22)，該菌革蘭氏陽性芽孢桿菌，原生質中無不著色顆粒，過氧化氫酶陽性，厭氧不能生長，V.P反應陽性，V.P反應之后的PH值7.2，對溶菌酶、疊氮化鈉有抗性，能產生卵磷脂酶，PH5.7生長，7%的NaCl中生長，生長溫度15~45°C，單個菌落圓形，白色，菌落邊緣不光，表面有光澤，易挑取；該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7080。
2.一種根據權利要求1所述的一種海參源枯草芽孢桿菌的應用。
【文檔編號】C12N1/02GK103966115SQ201310034682
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2013年1月30日
【發明者】張付云, 劉曄, 王維才, 蒼桂璐, 盧航 申請人:大連海洋大學, 張付云