專利名稱：重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組鯉魚PKC S基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用。
背景技術：
蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)與許多細胞生物效應有關，在細胞信息傳遞中具有重要作用。由于P K C是促癌劑佛波酯在細胞內的高親和力受體，因而在腫瘤發生發展中的作用引起人們重視，已發現多種腫瘤組織中PKC含量高于正常。到目前為止，在哺乳動物組織內已確定10種PKC亞類(8-3)，分為A、B、C三組，A組稱為典型或傳統的 PKC (classicalor conventional PKC，CPKC),包括 a、0 1、II 和Y亞類,其中@1和P II有高度的同源性,是由同一 mRNA的不同剪接而成，A組成員分子量在 76_78kDa。B 組為新型 PKC (atypical PKC，aPKC)，包括 S、e、n (L)和 0 亞類，分子量在77_83kDa。C組為非典型PKC(atypicalPKC，aPKC)，由(和入亞類組成，分子量較小為67kDa。其中，PKC S在調控人和鼠肝細胞生長和抗氧化中起著重要作用。迄今，關于PKC S在哺乳動物細胞生長、增殖和抗氧化中發揮調節作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳動物的細胞中開展，并取得了許多成果，但未見有鯉魚PKC S基因的cDNA核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種重組鯉魚PKC 6基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用。 本發明解決上述問題所采用的技術方案是一種重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No I所不的基因序列；2)將SEQ ID NO :1所不的基因序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且與SEQ ID No :1所示的基因序列表達的氨基酸序列相同的基因序列。一種重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由權利要求I所述重組鯉魚PKC A基因所表達的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白質。一種上述重組鯉魚PKC 6基因的制備方法，包括下述步驟
1)采集鯉魚的總RNA并以其腸道組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一
鏈；
2)以步驟I)中的cDNA第一鏈為模板，利用引物P1、P2進行PCR擴增，得到SEQID NO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步驟2)中以P1、P2為引物，利用DNA聚合酶進行PCR反應的50 u I PCR擴增體系中各組分及其比例為CDNA第一鏈，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25 U I ;501^的卩2，0. 25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8. Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反應循環條件94°C 預變性 lmin ；94°C變性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40個循環；最后72°C延伸10 min,反應完成。一種上述制備的重組鯉魚PKC 6基因的檢測方法，包括下述步驟
1)將Pl和P2的PCR回收產物的PCR擴增采用2XTaqPCR MasterMix進行，50 y IPCR擴增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的PKCS回收產物，l.Oiil ;50iiM的P3，0. 25u I ；50uM 的 P4，0.25ii I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反應循環條件94°C預變性lmin ;94°C變性30sec, 6CTC退火30sec, 72°C延伸lmin,共35個循環；最后72°C延伸5 min，反應完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列；
2)取5ill PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進行電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析結果。具體地，該檢測方法中，所述50倍稀釋的PKC 6回收產物指重組鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區核苷酸序列的制備方法中所制備的重組鯉魚PKC 8基因cDNA序列。一種上述制備的重組鯉魚PKC 6基因的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟
1)將Pl和P2PCR回收產物的PCR擴增采用2XTaq PCR Master Mix進行，50 PCR擴增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((8回收產物，l.Oiil ;50iiM的P5，0. 25iil ；50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反應循環條件94°C預變性 lmin ;94°C變性 30sec,60°C (P5, P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個循環；最后72°C延伸5min，反應完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQ ID NO :8所示的序列； 2)取5ill PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進行電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析結果。上述重組鯉魚PKC S基因在檢測鯉魚PKC S基因的表達情況中的應用。具體地，鯉魚PKC S基因的表達情況包括鯉魚PKC S基因在各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的表達情況。為了檢測上述應用的表達情況，根據SEQ ID NO :1所示序列設計上游引物ro1、下游引物ro2，所述roi具有seq id no :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用熒光定量PCR擴增，20 PCR擴增體系中各組分及其比例為cDNA，2.0iil ；10uM 的 NDl，1.0iil ；10uM 的 ND2，1.0iil ；
SYBR Premh Es Tag n (2X), 10. Ou I ；dH2o,6. o u I;反應循環條件％°C 預
變性30sec ;95°C變性5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44個循環；最后72°C延伸2min，反應完成。本發明研究和開發與鯉魚PKC S蛋白相關的基因克隆及其重組表達具有極其重要的作用，因為研究清楚鯉魚的PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞培養存活率、提高細胞抗氧化能力，以調控細胞生長等方面，由重組PKCS蛋白制備的抗體可以檢測PKC 6基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個體的不同發育階段的表達情況。
本發明獲得的重組PKC S基因的編碼區長2061bp，并且確定了其核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列。通過比對已知的斑馬魚、人、大鼠、小鼠的PKC S基因的核苷酸序列，找到保守區，然后根據斑馬魚胚胎的PKC S基因(NM_214708. l)cDNA編碼區的序列，在不打破氨基酸編碼的前提下設計上游引物(5’_從起始密碼子ATG的開始)，下游引物5’端起始于斑馬魚PKC 6基因的天然終止密碼子TGA，設計出了一對用于通過RT-PCR方法擴增鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區片段的引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應用這對引物擴增出了特異性片段，測序后得到了鯉魚PKC 6基因的cDNA編碼區2061bp片段，序列分析表明與斑馬魚的序列(NM_214708.1)同源性為88%，且保持了正確的編碼。這一 cDNA片段稱為 “cPKCS ”。所以，本發明的目的是通過己知的不同物種的PKC S的核苷酸序列設計引物，然后通過RT-PCR方法得到重組鯉魚PKC S基因的cDNA編碼區片段。對該片段測序后提供編碼鯉魚PKC 6蛋白的基因的cDNA的編碼區2061bp的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。綜上所述，本發明的有益效果是本發明的重組鯉魚PKC S蛋白相關的基因克隆及其重組表達具有極其重要的作用，因為研究清楚重組鯉魚PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞培養存活率、提高細胞抗氧化能力，防止細胞氧化損傷，以調控細胞生長等方面，由重組PKC S蛋白制備的抗體可以檢測PKC S基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個體的不同發育階段的表達情況。
圖1是重組鯉魚PKC 8基因序列的電泳 圖2是以P3、P4為引物進行PCR鑒定的電泳 圖3是以P5、P6為引物進行PCR鑒定的電泳圖； 圖4是鯉魚不同腸段信號分子PKC 6 mRNA相對表達量的檢測示意 圖5是肌醇對幼建鯉前腸PKC 6磷酸化的影響的檢測示意 圖6是肌醇對幼建鯉中腸PKC 6磷酸化的影響的檢測示意 圖7是肌醇對幼建鯉后腸PKC 6磷酸化的影響的檢測示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖，對本發明作進一步地的詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。實施例1 :
本實施例的重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)將SEQ ID NO :1所示的基因序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且與SEQ ID No :1所示的基因序列表達的氨基酸序列相同的基因序列。如903位的C替換成G，序列編碼的氨基酸序列是相同。本實施例的重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由權利要求1所述重組鯉魚PKC A基因所表達的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白質。如323位的K替換成L，蛋白質的生物活性不會發生改變。實施例2
為了獲取實施例1中所述的重組鯉魚PKC 6基因序列，可以采用本實施例的方法，具體如下
首先按照提取總RNA的標準要求采集鯉魚(Common carp, Cyprinus carpio)的各類組織樣本。現場宰殺鯉魚后立即取腎臟、腸道、肌肉、脾臟及肝胰臟等組織塊，放入冷凍管后立即入液氮保存，帶回實驗室后置于_80°C冰箱保存備用。然后利用TaKaRa的總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取鯉魚腸道、肌肉、腎臟、肝胰臟及脾臟等組織的總RNA，最后根據文獻報道的哺乳動物PKC S基因在各類組織中的表達情況和總RNA提取結果，選定以腸道組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第一鏈為模板，利用特異性引物P1、P2進行PCR擴增，得到目的片段。之后將電泳后分離的目的片段切膠回收，測定雙鏈cDNA的濃度，以巢式PCR方法對擴增產物進行鑒定。Pl和P2引物對的擴增產物通過P3和P4、P5和P6的PCR擴增，電泳鑒定的得到預期大小的DNA片段，初步驗證了 Pl和P2擴增產物的正確性。將Pl和P2引物對的擴增產物的樣品送上海生工生物工程有限公司測序。作為結果，獲得了 2061bp的鯉魚cPKC 6基因cDNA編碼區的核苷酸序列。 顯示上面提到的特征的本發明的特異性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法擴增出鯉魚的cPKC 6基因的cDNA編碼區片段。根據本發明獲得的鯉魚PKC 6基因cDNA的核苷酸序列可進一步通過RT-PCR或雜交的方法檢測PKC 6基因的組織表達特異性，也可進一步實現鯉魚PKC S基因全長cDNA的克隆。將本發明的cDNA重組到表達載體上可能會表達出完整的PKC S蛋白，進而可用于抗體生產，檢測鯉魚各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的PKC 6基因的表達情況等等。鯉魚PKC 8基因的cDNA編碼區2061bp片段的克隆
為了克隆來自鯉魚腸道組織細胞的PKC 6基因包含2061bp編碼區的cDNA，根據斑馬魚公開的核苷酸序列(NM_214708.1),首先設計合成允許擴增2061bp的cDNA的PCR引物對，即
上游引物 5’- ATGGCCCCTTTCCTGAGGATTGCT -3’(Pl)
下游引物 5’-GACCACAirGTGTCTCACITTTGCA -3’(P2)。然后設計合成了另外兩對用于鑒別Pl和P2擴增產物的引物，即
上游引物 P3，5’ -AAATCCACCAAGCGACCTGA-3’，
下游引物 P4，5’ -TACCCACAATCCCTAACCGG-3’ ；
上游引物 P5，5’ -ACCTCTACTCCACTITTCAA-3’，
下游引物 P6，5’ -ATATTACCCACAATCCCTAA-3’ ；
為了利用RT-PCR方法克隆PKC S基因的cDNA，從鯉魚腸道組織提取總RNA，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取鯉魚腸道組織總RNA，進行電泳檢測和紫外測定RNA濃度后置于-80°C冰箱保存備用。然后，利用TaKaRa的M-MLV反轉錄酶并按照使用說明書的操作程序進行反轉錄反應，得到cDNA
第一鏈。
以上面得到的cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，利用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶進行 PCR 反應。50ii I PCR 擴增體系cDNA，2. 5 u I ；P1 (50uM),0. 25 u I ；P2 (50 uM),
0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；dNTP Mixture (each 2.5 mM),
8.0 ill ；ddH20, 33. 5 u1-,TaKaRa LA Taq (5 U/u 1),0. 5 u I0 反應循環條件94°C 預變性lmin ;94°C變性30sec，60 °C退火30sec，72°C延伸2 min，共40個循環；最后72°C延伸8min，反應完成。取5iil PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(100V，10 min)，凝膠成像系統觀察分析結果。作為結果，得到了 2061bp的特異性目的片段(SEQ ID NO :1所示序列)。Pl 和 P2 PCR 回收產物的 PCR 擴增采用 2 X Taq PCR Master Mix (KT201)進行，50 u I PCR 擴增體系PKCS 回收產物(50X 稀釋)，1. Oii I ;P3 (50 y M)，0. 25 y I 和 P4(50iiM)*P5(50iiM)，0. 25 u I 和 P6(50 y M)，0. 25 u I ；2XTaq PCR Master Mix, 25. Ou I ；ddH20,23. 5 u I0 反應循環條件94°C預變性 lmin ;94°C變性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸5min，反應完成。取5 PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(100V，lOmin)，凝膠成像系統觀察分析結果。作為結果，分別得到了約900和約550 bp的擴增產物。其大小與P3P4引物對設計的擴增產物922bp和P5P6引物對設計的擴增產物556bp相符，表明擴增產物的特異性。經過兩次鑒定的P1P2擴增產物送往上海生工生物工程有限公司用測序。作為結果，獲得了 2061bp的鯉魚PKC 6基因的cDNA編碼區的核苷酸序列。鯉魚PKC 6基因的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:1顯示了本實施實·例所獲得的cDNA克隆的核苷酸序列，SEQ ID NO: 2是由此推斷的氨基酸序列。PKC 6基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA編碼區的2061bp的開放閱讀框，該開放閱讀框編碼686個氨基酸殘基，分子量為78498. 36Da。本發明所獲得的重組鯉魚PKC S基因cDNA的核苷酸序列與斑馬魚(NM_214708.1)、人(NM_001090993.1)、小鼠(NM_0111)和大鼠(NM_133307.1)的 PKC S 基因cDNA的核苷酸序列的比較。結果表明鯉魚PKC S與斑馬魚、人、小鼠和大鼠的同源性分別為 90. 1%、70. 7%、71. 0% 和 70. 3%。正如清楚說明的和如上說明，本發明提供利用RT-PCR法克隆鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區的引物和編碼鯉魚的PKC S蛋白質的2061bp的cDNA和由此推斷的氨基酸序列。此cDNA包括了 2061bp的核苷酸序列，它編碼含有686個氨基酸殘基的蛋白質，經過進一步的改造后它可以亞克隆到如PET或pcDNA3.1等原核或真核表達載體上進行表達。重組的cDNA片段可能會表達出完整的PKC S蛋白多肽段，進而可用于抗體生產，檢測鯉魚各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的PKC 6基因的表達情況等等。實施例3
本實施例為實施例1和實施例2記載的重組鯉魚PKC S蛋白在測定鯉魚不同腸段PKC 6基因表達的應用。本實例以熒光定量PCR技術研究PKC 6基因在鯉魚各腸段的表達情況。選取體重接近的6尾健康鯉魚取樣。試驗魚腸道依據Villanueva等(1997)的方法分成幾乎等長的7腸段，分別測定各腸段PKC 6 mRNA豐度。樣品液氮研磨，提取總RNA。熒光定量用鯉魚腸道cDNA第一鏈采用Prime Script RT reagent Kit (寶生物工程(大連)有限公司，DRR037AS)合成，按試劑盒說明書的方法操作。PKC 6 cDNA熒光定量擴增根據本發明克隆得到的重組鯉魚PKC S基因的cDNA編碼區序列，設計成一對PKC S特異性定量擴增引物
上游引物 PDl，5’- AAATCCACCAAGCGACCT -3’ ；
下游引物 PD2，5’- CGAACCCTCCCACAGACG -3’ ；
熒光定量PCR擴增采用 SYBR Pllllie Scupt RT-PCR Kit II (Perfect Real
Time)(寶生物工程(大連)有限公司，DRR083A)進行，20iil PCR擴增體系cDNA，2. Oyl ；PD1
(10uM),1.0u I ；PD2( 10 u M),1. 0 u I ；Premh E-yII(2X),10.0u I ；
dH20,6. Ou I。反應循環條件95°C預變性 30sec ;95°C變性 5sec，55°C退火 15sec，72°C延伸15sec，共44個循環；最后72°C延伸2min，反應完成。結果表明鯉魚各腸段均有PKC S mRNA表達，第I和第4腸段顯著其他各腸段Gd< 0.05)，第6腸段最低，其余腸段差異不顯著Gd > 0.05)。實施例4
本實施例為實施例1和實施例2記載的重組鯉魚PKC 6蛋白在測定肌醇對鯉魚腸道PKC 6蛋白磷酸化影響的應用。本實例根據PKC S蛋白序列篩選的磷酸化抗體，檢測量肌醇對鯉魚不同腸段PKC 6蛋白磷酸化的影響。結果表明肌醇顯著提高了前腸和中腸中PKC S的磷酸化水平CF < 0. 05);肌醇對后腸PKC S磷酸化水平沒有影響0° > 0.05)。通過檢測鯉魚PKC 6基因在各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的表達情況，可以對檢測的中間數據結果進行進一步的分析和研究，對鯉魚PKC S基因的表達情況、其表達蛋白的磷酸化及相關情況，做進一步研究，進而可用于抗體生產。如上所述， 可以較好的實施本發明。
權利要求
1.一種重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)將SEQ ID NO:1所示的基因序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且與SEQID No 1所不的基因序列表達的氣基酸序列相同的基因序列。
2.一種重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID N0:2所示的由權利要求I所述重組鯉魚PKC A基因所表達的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID N0:2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID N0:2序列衍生的蛋白質。
3.一種權利要求1所述重組鯉魚PKC S基因的制備方法，其特征在于，包括下述步驟 1)采集鯉魚的總RNA并以其腸道組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一鏈； 2)以步驟I)中的cDNA第一鏈為模板，利用引物PUP2進行PCR擴增，得到SEQ IDNO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步驟2)中以P1、P2為引物，利用DNA聚合酶進行PCR反應的50iU PCR擴增體系中各組分及其比例為cDNA第一鏈，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25yl ;501^的卩2，0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8.Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反應循環條件94°C 預變性 Imin ；94°C變性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40個循環；最后72°C延伸10 min,反應完成。
4.一種權利要求3所述制備的重組鯉魚PKC S基因的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟 1)將Pl和P2的PCR回收產物的PCR擴增采用2XTaqPCR MasterMix進行，50 ii IPCR擴增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((6回收產物，l.Oiil ;5011|1的？3，0.25u I ；50uM 的 P4，0. 25 u I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反應循環條件94°C預變性Imin ;94°C變性30sec, 60°C退火30sec, 72°C延伸lmin,共35個循環；最后72°C延伸5 min，反應完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列； 2)取5ill PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進行電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析結果。
5.根據權利要求4所述重組鯉魚PKCS基因的檢測方法，其特征在于，所述50倍稀釋的PKC 6回收產物指重組鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區核苷酸序列的制備方法中所制備的重組鯉魚PKC S基因cDNA序列。
6.一種權利要求3所制備的重組鯉魚PKC S基因的檢測方法，其特征在于，包括下述步驟 I)將Pl和P2 PCR回收產物的PCR擴增采用2XTaq PCR Master Mix進行，50 PCR擴增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((8回收產物，l.Oiil ;50iiia^P5，0.25iil ；·50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反應循環條件·94°C預變性 lmin ;94°C變性 30sec，60°C (P5P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個循環；最后72°C延伸5min，反應完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQID NO :8所示的序列；2)取5 ill PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進行電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析結果。
7.權利要求1所述重組鯉魚PKCS基因在檢測鯉魚PKC S基因的表達情況中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，鯉魚PKCS基因的表達情況包括鯉魚PKC 6基因在各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態下的表達情況。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于，在檢測中，根據SEQID NO :1所示序列設計上游引物ro1、下游引物PD2，所述roI具有SEQ ID NO :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用熒光定量PCR擴增，20 ill PCR擴增體系中各組分及其比例為cDNA，2. Ou I ；10uM 的 ND1，1. 0 y I ;10 y M 的 ND2，l.Oul Premix Ex TagmII (2X)，10. Oii I ；dH20,6. Ou I ;反應循環條件95°C預變性 30sec ;95°C變性 5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44個循環；最后72°C延伸2min，反應完成。
全文摘要
本發明公開了一種重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用。重組鯉魚PKCδ基因具有SEQ ID NO:1所示的序列。重組鯉魚PKCδ蛋白具有SEQ ID NO:2所示的序列。本發明的重組鯉魚PKCδ蛋白相關的基因克隆及其重組表達具有極其重要的作用，因為研究清楚重組鯉魚PKCδ基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞抗氧化能力，防止細胞氧化損傷，以調控細胞生長等方面，由重組PKCδ蛋白制備的抗體可以檢測PKCδ基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個體的不同發育階段的表達情況。
文檔編號C12N15/10GK103060347SQ20131004651
公開日2013年4月24日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者周小秋, 姜維丹, 馮琳, 姜俊, 劉揚, 李樹紅 申請人:四川農業大學