一種真菌羧酸酯酶及其編碼基因與應用的制作方法【專利摘要】本發明公開了一種真菌羧酸酯酶及其編碼基因與應用。本發明提供了一種蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發明一種新的羧酸酯酶，其最適反應溫度為45℃，最適反應pH值為6.5；用本發明的羧酸酯酶可以較快水解乙酸芳樟酯，并且可以高效合成丁酸丁酯，具有較好的工業化應用前景。【專利說明】一種真菌羧酸酯酶及其編碼基因與應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及生物【
技術領域：
】，尤其涉及一種真菌羧酸酯酶及其編碼基因與應用。【
背景技術：
】[0002]酯酶(EC.3.1.1.X)通常同時具有水解和合成的能力，水解時催化酯鍵產物為相應的酸和醇，合成時把酸的羧基與醇的羥基縮合并縮水，產物為酯類或其它香味物質。其中最重要的兩種酯酶是脂肪酶[EC.3.1.1.3]和羧酸酯酶[EC.3.1.1.1]。脂肪酶因其催化中心附近存在“蓋子”結構而具有“界面效應”，而羧酸酯酶不具有該現象。羧酸酯酶催化反應遵循經典的米氏動力學，而脂肪酶只有當底物達到一定濃度后才能表現出較高的催化活性。另外，羧酸酯酶對短碳鏈酯類(一般少于10個碳原子)具有較高的催化活性，而脂肪酶傾向于催化含有較長碳鏈(多于10個碳原子)的水不溶性酯類(Bornscheuer,2002.Microbialcarboxylesterases:classificat1n,propertiesandapplicat1ninb1catalysis.FEMSMicrob1lRev26:73-81)。羧酸酯酶具有許多獨特的特性，如它們在有機相中可以完成酯化、轉酯、酯交換等眾多反應，而且其中的大多數反應具有不對稱選擇性，可以專一性地用于制備許多用化學法難以合成的手性化合物(如液晶、光學活性藥物、農藥等)及其前體(彭立風等，2000.微生物脂肪酶的應用[J].食品與發酵工業，26:68-73)。[0003]羧酸酯酶具有廣泛的底物特異性，在有機溶劑中具有較高的穩定性，并且一些羧酸酯酶還具有較高的對映選擇性，這使羧酸酯酶在食品、制藥等行業中具有廣泛的應用前景。羧酸酯酶可以用來合成一些短鏈酯類，如丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯和辛酸乙酯等(Fendrietal.,2012.Athermoactiveuropygialesterasefromchichen:Purificat1n,characterizat1nandsynthesisofflavoresters.1ntJB1lMac1mol50:1238-1244),這些具有水果香味的酯類物質在食品工業中具有重要的應用價值。目前，臨床上所用的1200多種化學藥物中，約有480多種為手性藥物，藥物的生物活性與其手性對映體構型密切相關，并非兩種異構體都具有相同的活性，而酯酶可用于制藥工業中手性藥物的酶法拆分(QuaxandBroekhuizenj1994.DevelopmentofanewBacilluscarboxylesteraseforuseinresolut1nofchiraldrugs.ApplMicrobialB1technol41:425-431)。[0004]羧酸酯酶廣泛存在于動物、植物和微生物中。微生物羧酸酯酶主要來源于細菌、古細菌和放線菌，其中以細菌羧酸酯酶的研究最為廣泛。如芽胞桿菌(Eggertetal.,2000.AnovelextracellularesterasefromBacillussubtilisanditsconvers1ntoamonoacylglycerolhydrolase.EurJB1chem267:6459-6469)，假交替單胞菌(Cieslinskietal.，2007.AcoldadaptedesterasefromPsychrotrophicpseudoalteromassp.strain643A.ArchMicrob1l188:27-36),高溫厭氧桿菌(Raoetal.,2011.AthermostableesterasefromThermoanaerobactertengcongensisopeningupanewfamilyofbacteriallipolyticenzymes.B1chimB1physActal814:1695-1702)，酒酒球菌(Sumbyetal.,2009.Cloningandcharacter!zat1nofanintracellularesterasefromthewine-associatedlacticacidbacteriumOeinococcusoen1.ApplEnvironMicrob75:6729-6735),地衣芽胞桿菌(Yangetal.，2012.Cloning,express1nandb1chemicalcharacterizat1nofanovel,moderatelythermostableGDSLfamilyesterasefromGeobaciIlusthermodenitrificansT2.JB1sciB1engArticleinpress)和分支桿菌(Guoetal.,2010.Characterizat1nofanovelesteraserv0045cfromMycobateriumtuberculosis.PLOS0NE5:10)等來源的羧酸酯酶已經得到較為深入的研究。然而，關于絲狀真菌酯酶的研究報道相對較少。Purdy和Kolattukudy(PurdyandKolattukudy,1975.Hydrolysisofplantcuticlebyplantpathogens.Purificat1n,aminoacidcomposit1n,andmolecularweightoftwoisoenzymesofcutinaseandanonspecificesterasefromFusariumsolanif.pis1.B1cheml4:2832-2836)最早報道了一種Fusariumsolanif.pisi來源的非特異性酯酶。Calero-Rueda等(Calero-Ruedaetal.,2009.StudyofasterolesterasesecretedbyOph1stomapiceae:Sequence,modelandb1chemicalproperties.B1chimicaetB1physicaActal794:1099-1106)研究了瀝青長_殼菌(Oph1stomapiceae)酯酶的序列、模型及生化性質。Chen和Fang(Chenetal.，2011.Researchontheesterificat1npropertyofesteraseproducedbyMonascussp.AfricanJB1technollO(26):5166-5172)從中國傳統釀酒大曲中分離得到一株紅曲霉Monascussp.并研究了該菌所產酯酶粗酶液的酯化特性。關于嗜熱真菌酯酶的相關研究報道，僅見Fan等(FanandMatteyj1999.Smallenzymeswithesteraseactivitiesfromtwothermophilicfungi,EmericellanidulansandTalaromycesemersoni1.B1technolLett21:1071-1076)研究了嗜熱真菌Emericellanidulans和Talaromycesemersonii來源酯酶的分子量分布，以及Kontkanen等(Kontkanenetal.,2006.Purificat1nandcharacterisat1nofanovelsterylesterasefromMelanocarpusalbomyces.EnzymeMicrobialTechnol39:265-273)從熱白絲菌(Melanocarpusalbomyces)中純化得到一種固醇酯酶并研究了其酶學性質。[0005]由于酯酶的相關研究主要局限于少數種屬，真菌酯酶的研究還不夠深入，且種類較少。實際上產酯酶的真菌種類遠多于目前已報道的。因此，進一步從自然界中篩選產酯酶的真菌，尤其是嗜熱真菌菌株對于拓寬酯酶的來源、豐富酯酶的種類具有重要的意義。[0006]目前，世界各國都在致力于開發性能優良的羧酸酯酶，期待在食品、制藥和日用化工等領域有重大突破。因此，篩選分泌酯酶的嗜熱真菌菌株，生產性能優良的酯酶，并應用羧酸酯酶制備食品中應用的風味物質或日化中應用的香料以解決化學合成工藝所帶來的高能耗和環境污染問題具有重要的意義。【
發明內容】[0007]本發明的一個目的是提供一種真菌羧酸酯酶及其編碼基因。[0008]本發明提供的蛋白，命名為RmEstA，為羧酸酯酶，是如下(a)或(b):[0009](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；[0010](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白質。[0011]上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。[0012]其中，序列表中的序列2由324個氨基酸組成，分子量約為35kDa。[0013]為了使a)中的蛋白便于純化，可在a)的蛋白質氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。[0014]表1為標簽的序列[0015]【權利要求】1.一種蛋白，是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有羧酸酯酶活性的由序列2衍生的蛋白質。2.編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。3.如權利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(I)-(5)中任一種的DNA分子:(1)編碼區為序列表中序列I所示的DNA分子；(2)編碼區為序列表中序列I自5’末端第55-1026位核苷酸所示的DNA分子；(3)編碼區為序列表中序列I自5’末端第55-1029位核苷酸所不的DNA分子；(4)在嚴格條件下與(I)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼具有羧酸酯酶活性蛋白的DNA分子；(5)與(I)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有羧酸酯酶活性蛋白的DNA分子。4.含有權利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為將權利要求2或3所述DNA分子插入表達載體中，得到表達權利要求1所述蛋白的重組載體。6.擴增權利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。7.權利要求1所述蛋白作為羧酸酯酶中的應用。8.權利要求1所述蛋白在水解乙酸芳樟酯中的應用。9.權利要求1所述蛋白在合成風味酯中的應用。10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述風味酯為丁酸丁酯；所述應用為丁酸、丁醇和權利要求1所述蛋白在溶劑中反應，得到丁酸丁酯；所述丁酸、丁醇和權利要求1所述蛋白的配比具體為0.15M:0.125M:50U。【文檔編號】C12P7/04GK104031898SQ201310066622【公開日】2014年9月10日申請日期:2013年3月4日優先權日:2013年3月4日【發明者】楊紹青,江正強,徐海博,劉昱,閆巧娟,段曉杰申請人:中國農業大學