酪氨酸蛋白激酶jak2基因中與豬抗藍耳病相關的snp標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用，所述與豬抗藍耳病相關的SNP標記位于豬的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，該序列的81bp、115bp、151bp和264bp四處堿基分別為T、A、G和A的待測豬為易感藍耳病豬品種，而這四處堿基分別為C、G、A和T的待測豬為抗藍耳病豬品種。本發明提供的分子遺傳標記不受豬的年齡、性別等限制，可用于抗藍耳病豬品種的早期選育，甚至在豬剛出生時就可準確地進行篩選，可大大加快抗藍耳病豬的育種進程；篩選方法準確，操作簡單，成本低，效率高。
【專利說明】酪氨酸蛋白激酶J AK2基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，俗稱“藍耳病”是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,該病毒是巢狀病毒目動脈炎病毒科的一個成員，同屬的病毒還有馬動脈炎病毒，鼠乳酸脫氫酶酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現為間質性肺炎和母豬流產木乃伊胎等，每年對全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。2007年在中國爆發了一場高熱病，該病迅速在全國范圍擴散 ，超過200萬頭豬被感染，40萬頭豬死亡，該病最后證實是由一種高致病性的藍耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞，現在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應答，體液免疫不能及時產生有效的中和抗體，而且會形成抗體依賴的病毒增強效應，最終導致免疫抑制和持續感染，由于該病毒的突變率極高，傳統疫苗方法也不能有效控制該病，很多研究都致力于尋找RNAi，干擾素等新的方法來針對該病毒，用于彌補傳統方法的不足。
[0003]由于不同的豬品種和個體的遺傳背景差異，對藍耳病的抗性也不同，研究表明在臨床癥狀和生理生化指標上，通城豬、梅山豬等國內豬品種相較于國外長白豬、大白豬等感染高致病性PRRSV后有較強的抗性。通過高通量測序的方法，對感染PRRSV前后長白豬和通城豬的組織做差異基因表達分析，某些免疫相關的基因表達量在感染前后四個品種間有顯著的差異。另外，存在一些品種間的SNP位點，這些基因在宿主的免疫應答中起到了很重要的作用，而且這些SNP位于基因的外顯子中，通過找出不同品種間PRRSV感染造成的基因表達差異，不僅可以研究PRRSV的感染機制，還可以找出抗性或易感相關的基因，通過對品種間的SNP進行比較分析，從而篩選出抗性較強的豬。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中與豬抗藍耳病相關的SNP標記及其應用。
[0005]酪氨酸蛋白激酶JAK2參與細胞生長、發育、分化以及組蛋白修飾等許多重要的生理過程，在天然免疫和和獲得性免疫的信號調節通路中起到了重要的作用，它可以和II類型受體，如IFN-α ,IFN-β、細胞白介素的受體結合，在信號轉到的過程中發揮重要作用，當干擾素等細胞因子結合到受體上時，JAK隨即結合到受體的細胞質末端，隨后磷酸化SATA形成同源或異源二聚體，進入到細胞核里，激活相關基因的轉錄。本發明人首次發現在兩個不同抗性的豬品種:長白豬(易感豬)、通城豬(抗病豬)之間的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因外顯子中存在四個品種間SNP位點，用常規分子生物學方法檢測這四個位點的堿基類型，可以作為一種檢測抗病和易感豬的方法。
[0006]為了實現本發明目的，本發明提供一種與豬抗藍耳病相關的SNP標記，其位于豬的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其中，該序列的81bp、115bp、151bp和264bp四處堿基分別為T、A、G和A的待測豬為易感藍耳病豬品種，而這四處堿基分別為C、G、A和T的待測豬為抗藍耳病豬品種。
[0007]本發明還提供用于檢測與豬抗藍耳病相關的SNP標記的引物對，其包括上游引物F:5’ -AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’ 和下游引物 R:5’ -CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3’。
[0008]本發明還提供與豬抗藍耳病相關的SNP標記在鑒定抗藍耳病豬品種中的應用，其包括步驟:I)提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉錄成CDNA ;2)以步驟I)中的cDNA為模板，F和R為引物，進行RT-PCR反應；3)分析PCR產物，如果擴增產物序列中81bp、115bp、151bp和264bp四處的堿基分別為C、G、A和T，則待測豬為抗藍耳病豬品種。
[0009]反轉錄PCR的步驟為:
[0010]i )打開RNA 二級結構
[0011]在一支無核酸酶污染的小離心管中加入:
[0012]
RNA2μ^,
o! igodTIiLig
無核酸酶水補齊至 15μ1。
加熱離心管至70°C, 5分鐘。
[0013]ii)反轉錄 PCR
[0014]向上述離心管中加入:
[0015]
M-MLV 5 X反應緩沖液5μ1
1mMdATP1.25μΙ
1mMdCTP1.25μ1
1mMdGTP1.25μ1
1mMdTTP1.25μΙ
RNasin?核酸酶抑制劑25U
M-MLV反轉錄酶200U。
[0016]反轉錄PCR的反應條件為:42°C，60min。
[0017]常規PCR使用的擴增體系以15 μ I計為:
[0018]
【權利要求】
1.一種與豬抗藍耳病相關的SNP標記，其特征在于，其位于豬的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP標記的核苷酸序列如SEQID N0.1所示,其中，該序列的81bp、115bp、151bp和264bp四處堿基分別為T、A、G和A的待測豬為易感藍耳病豬品種，而這四處堿基分別為C、G、A和T的待測豬為抗藍耳病豬品種。
2.用于檢測權利要求1所述與豬抗藍耳病相關的SNP標記的引物對，其特征在于，包括上游引物 F:5’ -AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’ 和下游引物 R:5’ -CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3’。
3.權利要求1所述與豬抗藍耳病相關的SNP標記在鑒定抗藍耳病豬品種中的應用，其包括步驟: .1)提取待測豬樣品組織中的總RNA，反轉錄成cDNA；. 2)以步驟I)中的cDNA為模板，F和R為引物，進行RT-PCR反應； . 3)分析PCR產物，如果擴增產物序列中81bp、115bp、151bp和264bp四處的堿基分別為C、G、A和T，則待測豬為抗藍耳病豬品種。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中反轉錄PCR包括的步驟為: i)打開RNA 二級結構 在一支無核酸酶污染的離心管中加入:
II)反轉錄PCR 向上述離心管中加入:
反轉錄PCR的反應條件為:42°C，60min。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中常規PCR使用的擴增體系以.15 μ I計為:
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中常規PCR的反應條件為:95°C5min;以 95°C 30s, 50°C -70°C, 30s-2min ；72°C 30s_2min 做 35 個循環；72°C lOmin，于 4°C保溫。
7.含有權利要求2所述引物對的用于檢測抗藍耳病豬品種的試劑盒。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10.權利要求1所述與豬抗藍耳病相關的SNP標記在豬的分子標記輔助育種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046621SQ201310082138
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月14日 優先權日:2013年3月14日
【發明者】李寧, 陳志勝, 任立明, 胡曉湘 申請人:中國農業大學