表達豬圓環病毒ⅱ型orf2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法

表達豬圓環病毒ⅱ型orf2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種表達豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201315。本發明將PCV2ORF2基因插入到通用載體PG中，構建了轉移質粒PGO。PRVTK-/gG-/gE-病毒接種80-90%融合的單層ST細胞，吸附2h，將質粒PGO轉染ST細胞，利用蝕斑純化技術獲得重組病毒PGO株，免疫小鼠。結果顯示，商品化PCV2滅活疫苗與重組病毒PGO株免疫組均能誘導鼠產生特異性的體液免疫應答，二者抗體效價明顯高于DMEM培養液免疫組且差異顯著（p<0.05)。小鼠淋巴細胞增殖實驗表明PGO重組病毒免疫組特異性的細胞免疫應答高于PCV2滅活疫苗和DMEM培養液免疫組且差異顯著（p<0.05)，并且其能抵抗PCV2強毒的攻擊，表明該重組病毒有作為PCV2新型疫苗的潛力。
【專利說明】表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株及其制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種表達豬圓環病毒II型0RF2基因重組豬偽狂犬病毒PGO株的制備方法。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是目前為止發現的最小的脊椎動物病毒。PCV根據致病性、抗原性及核苷酸序列的不同分為PCVl和PCV2兩種基因型。其中PCVl廣泛存在于豬群但對其無致病性，基因組長度為1759bp。PCV2具有致病性，基因長度為1767bp或者1768bp，PCV2不僅是世界各國普遍存在的仔豬斷奶后多系統衰竭征(PMWS)的致病病原，而且與豬皮炎和腎病綜合征(TONS)、母豬流產、豬繁殖障礙、肥豬炎性呼吸道病綜合征(PRDC)及死亡綜合征(SAMA)的發生具有重要關系。另外PCV2能夠侵害淋巴系統從而引起豬體免疫抑制，繼發感染豬流感、豬偽狂犬、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等病毒性傳染病及多種細菌性傳染病，從而使疫情變得更加嚴重，現階段該病毒的廣泛存在已給我國及全球其他國家的養豬業造成了嚴重的經濟損失。目前國內外能有效防制本病的疫苗較少，因此，PCV2安全有效疫苗的研究對PCV2相關性疾病控制及根除具有重要意義。
[0003]PRV為皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，基因組DNA龐大，為150 kbp，具有分子量大、宿主范圍廣、易于建立潛伏感染、可插入基因多等特性，具有以下優點:①病毒遺傳背景清楚。②安全性好，現有的活疫苗株HB98及Bartha-K61等疫苗已應用多年且安全有效。⑤生產方法簡單，成本較低，接種相對方便。③免疫期較長=PRV作為活病毒載體接種機體后主要以細胞免疫為主，故外源基因能夠在體內進行持續表達。④宿主范圍較廣，豬、山羊、牛、綿羊、狗、貓、等多種動物均能感染PRV，故能夠針對不同動物的研制不同的活載體疫苗以便控制該病的流行。⑥PRV對人無感染性，這些優點決定了 PRV可以成為優良的活病毒載體。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種重組豬偽狂犬病毒毒株，分類命名:重組豬偽狂犬病毒，拉丁文學名:Herpesviridae。保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱:CCTCC,保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學，保藏日期:2013年5月28日，保藏編號 CCTCC N0:V201315。
[0005]本發明的技術方案是:一種表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201315。
[0006]所述的表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，包括設計與合成引物，增殖偽狂犬病毒，提取偽狂犬病毒DNA，轉染，純化，所述轉染步驟如下:
(I)取100 μ LTCID50為10_6125/0.Iml的PRV TK_/gG7gE—病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350 μ L，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次；
(2)將240 μ I 無血清培養基 OPT1-MEM 和 10 μ I Lipofectamine 2000 于 EP 管中混合均勻，得到溶液A ;
(3)將4μ g去內毒素質粒PGO補OPT1-MEM至總體積250 μ L并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B ;
(4)將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C；
(5)將步驟(1)中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2ml無血清培養
基;
(6)將步驟(4)中溶液C逐滴加入六孔板中,搖動培養板,輕輕混勻,在37°C,體積濃度為5%的CO2中保溫5-6h ；
(7)6h后，更換有血清的全培養基，37°C，5%C02中48-72h檢測轉染水平。
[0007]本發明的有益效果是:本發明將PCV2 0RF2基因插入到通用載體PG中，構建了轉移質粒PGO。PRV TK_/gG_/gE_病毒接種80-90%融合的單層ST細胞，吸附2h，將質粒PGO轉染ST細胞，利用蝕斑純化技術獲得重組病毒PGO株，免疫小鼠。結果顯示，商品化PCV2滅活疫苗與重組病毒PGO株免疫組均能誘導鼠產生特異性的體液免疫應答，二者抗體效價明顯高于DMEM培養液免疫組且差異顯著(p〈0.05)。小鼠淋巴細胞增殖實驗表明PGO重組病毒免疫組特異性的細胞免疫應答高于PCV2滅活疫苗和DMEM培養液免疫組且差異顯著(p〈0.05)，并且其能抵抗PCV2強毒的攻擊，表明該重組病毒有作為PCV2新型疫苗的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為PGO重組質粒構建流程圖；
圖2為重組質粒PGO中0RF2基因的PCR擴增，M.DNA Marker DL2000; 1.PCR產物C.陰性對照；
圖 3為重組質粒PGO的酶切鑒定圖，M.DNA Marker λ-EcoT 14 I digest; 1.BamH I酶切產物；m.DNA marker DL2000 ；
圖4為重組質粒PGO的酶切鑒定圖，M.DNA Marker λ -EcoT 14 I digest; 1.BspT10A I 和kpn I酶切；m.DNA marker DL2000 ；
圖5為三輪空斑篩選后得到的單克隆；
圖6為單克隆重組病毒傳代15次后觀察到的綠色熒光照片；
圖7為重組病毒的PCR鑒定，M.DNA Marker DL2000; 1-10.PCR產物；C.陰性對照；圖8為PCV2攻毒后三組小鼠內臟PCR檢測結果，1-5:PGO重組病毒免疫組；6_10 =DMEM培養液免疫組組；11-15:PCV2滅活苗免疫組C:陰性對照。
【具體實施方式】
[0009]一種表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201315。
[0010]所述的表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，包括設計與合成引物，增殖偽狂犬病毒，提取偽狂犬病毒DNA，轉染，純化，所述轉染步驟如下:(1)取100μ LTCID50為10_6125/0.Iml的PRV TK7gG7gE_病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350 μ L，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次；
(2)將240 μ I 無血清培養基 OPT1-MEM 和 10 μ I Lipofectamine 2000 于 EP 管中混合均勻，得到溶液A ;
(3)將4μ g去內毒素質粒PGO補OPT1-MEM至總體積250 μ L并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B ;
(4)將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C；
(5)將步驟(1)中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2ml無血清培養
基;
(6)將步驟(4)中溶液C逐滴加入六孔板中，搖動培養板，輕輕混勻，在37°C,體積濃度為5%的CO2中保溫5-6h ；
(7)6h后，更換有血清的全培養基，37°C，5%C02中48-72h檢測轉染水平。
[0011]一、豬圓環病毒II型0RF2基因重組豬偽狂犬病毒活載體的構建 I材料與方法
1.1試驗材料` 質粒PGEMT-0RF2和PG質粒(載體)購自河南省動物性食品安全重點實驗室，偽狂犬弱毒株購自武漢科前生物制品公司。DNA Marker DL2000,Premix Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、及迎H1、歷/?dII1、^7 II限制性內切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；B10MIGA無內毒素質粒提取試劑盒購自鄭州賽斯生物科技有限公司；AXYGEN DNA凝膠回收試劑盒購自鄭州天馳生物科技有限公司；Lipofectamine? 2000 Reagent購自Invitrogen公司；胎牛血清、無雙抗DMEM培養液、OPT1-MEM無血清培養液購自Hyclone公司。
[0012]1.2.1重組質粒PGO的構建技術示意圖(圖1)
1.2.1.1引物設計與合成
根據重組質粒PGEMT-0RF2中0RF2基因閱讀框架設計I對0RF2全基因引物，上、下游引物的5’包含有酶切位點(下劃線部分)，擴增目的基因片段長度約0.7 kb。由上海生物工程有限公司合成該引物。
[0013]上游引物序列:5’- GAGGATCCATGACGTATCCAAGG-3?,
下游引物序列:5’ -GCGGATCCCATTCATTAAGGGTTA-3，
1.2.1.2 PG質粒的酶切和去磷酸化
PG質粒用及I進行酶切并用CIAP對酶切產物進行去磷酸化處理，體系如下:10Xbuffer 5 μ? ;酶切后的PG溶液 30 μ? ； CIAP I μ? ；ddH20 14 μ? ;總體積 50 μ?，上述混合物振蕩均勻，在37°C水浴鍋中作用30 min后置4°C冰箱過夜，之后用凝膠回收試劑盒回收載體(PG)。
[0014]1.2.1.3外源片段(0RF2)的制備
體系如下:漢.H I I μ? ；10XK Buffer I μ? ;質粒 5 μ? ；ddH20 3 μ?，總體積 10μ?，混合物瞬時離心后置于37°C水浴鍋酶切3h，之后用凝膠回收試劑盒對0RF2目的片段進行膠回收。
[0015]1.2.1.4載體(PG)與外源片段(0RF2)的連接
在10 μ?體系中加入:Ligation buffer 1.0 μ? ;去磷酸化PG載體2.0 μ? ;外源0RF2基因6.0 μ? ；T4 DNA ligase 1.0 μ?，總體積10 μ?，混勻并于16°C連接槽中過夜。
[0016]1.2.1.5連接產物的轉化
取DH5a感受態細胞50 μ?，加入連接產物5 μ?，冰浴30 min后，42°C熱激90-120 s,再冰浴15 min，加950 PL不含抗生素的LB液體培養基，37°C 250 r/min振蕩I h，8000rpm離心5 min后無菌棄去上清液,用100 KL液體重懸沉淀,均勻涂布在含Amp( 50 Pg/mL)的LB固體平板上，再涂上20 μ? X-gal和4 PLIPTG混勻液，37 °C培養箱中正放培養3h后倒置培養16 ho
[0017]1.2.1.6重組質粒PGO的提取
從上述轉化培養的平板中挑取單個白色菌落，接種于3 mL Amp+ LB液體培養基內，在37°C搖床培養過夜，用質粒提取試劑盒按照說明書進行質粒提取，提取的質粒其命名為PGO。
[0018]1.2.1.7重組質粒PGO的鑒定
按質粒提取試劑盒按照說明書進行提取重組質粒，以重組質粒PGO為模板進行0RF2基因的PCR擴增檢測，反應條件為:預變性94 0C 5min ；95 °C I min, 58 °C I min,72°C I min,30個循環；最后72°C再延伸lOmin。用BanMl酶對質粒PGO進行酶切鑒定。用Kpn I酶和Bspll^ I酶對重組質粒PGO中0RF2基因插入方向進行鑒定。將PCR和酶切鑒定均為陽性并且插入方向也正確的PGO質粒送至華大基因有限公司進行測序。
[0019]1.2.2 PRV的增殖及病毒DNA的提取
ST細胞長至單層后，棄去營養液并用清洗兩遍，加入100 μ L PRV病毒液和
0.5mLD’Hanks液，放至37°C溫箱吸附作用lh，其間每隔15min輕搖使病毒吸附均勻，傾去瓶內液體后加入2%DMEM維持液，置于37°C溫箱繼續培養；待80%左右的細胞發生病變(CPE)時棄去維持液，
加I mL細胞裂解液和50 μ L蛋白酶Κ(10 μ g/mL)，搖振混勻后置55°C作用I~3 h，其間搖勻數次以消化均勻，之后將混合液轉入至1.5mL Eppendorf管,按常規方法抽提PRV
基因組。
[0020]取2 μ L DNA用紫外分光光度計測量PRV病毒DNA濃度直至為I μ g/ μ L。
[0021]1.2.3 轉染
用B10MIGA無內毒素質粒小提試劑盒提取質粒PGO至I yg/yL備用。復蘇細胞，轉染前24 h按常規方法將ST細胞傳至第三代，將細胞懸液加到6孔板中，待細胞長至90 %左右時進行轉染。
[0022]參照脂質體Lipofectamine? 2000試劑盒轉染說明書進行共轉染,優化條件后按以下步驟進行:
(1)取100μ LTCID50為10_6125/0.Iml的PRV TK7gG7gE_病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350 μ L，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次；
(2)將240 μ I 無血清培養基 OPT1-MEM 和 10 μ I Lipofectamine 2000 于 EP 管中混合均勻，得到溶液A ;
(3)將4μ g去內毒素質粒PGO補OPT1-MEM至總體積250 μ L并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B ;
(4)將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C；(5)將步驟(1)中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2ml無血清培養
基;
(6)將步驟(4)中溶液C逐滴加入六孔板中，搖動培養板，輕輕混勻，在37°C,體積濃度為5%的CO2中保溫5-6h ；
(7)6h后，更換有血清的全培養基，37°C，5%C02中48-72h檢測轉染水平。
[0023]1.2.4重組病毒的空斑篩選與純化
ST細胞長至單層后，收獲重組病毒后反復凍融3次，吸取100 μ L，用DMEM培養液作10倍梯度稀釋，分別將10' 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6稀釋度的病毒液取400 μ L接種到六孔板中，置于37°C細胞培養箱內吸附1.5h，吸棄孔內培養液，用PBS液清洗三次，每孔加入低溶點營養瓊脂瓊脂糖2 mL,瓊脂糖凝固后放入細胞培養箱中培養2天，在熒光顯微鏡的藍光(波長420-490 nm)下能觀察到綠色和無特殊熒光顏色的兩種病毒蝕斑，在熒光顯微鏡下用巴氏吸管小心吸取綠色蝕斑，加入少量DMEM維持液并在無菌操作臺中搗碎瓊脂塊，-20°C反復凍融三次后收毒。將收獲的病毒液接種到含單層ST細胞的24孔細胞培養板內，置于細胞培養箱中至90%以上的細胞發生病變，收獲24孔板放于-20° C并反復凍融3次。提取凍融后的病毒液DNA，進行PCR擴增，選擇PCR陽性的病毒空斑進行下一輪的蝕斑純化。
[0024]1.2.5重組病毒在ST、VERO, 1BRS-2、PK細胞上的培養特性
待ST、VERO、1BRS2、PK細胞長成單層后，按1%的接毒量分別接種四種細胞，吸附1.5h后，換成2%的維持液，放至細胞培養箱中培養，在接毒后8h、12h、24h、36h、48h用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態及病毒感染細胞后的熒光情況。
[0025]1.2.6重組病毒在多種細胞上毒價的測定` 用ST細胞增殖的重組病毒進行TCID50測定，將ST細胞、IBRS-2細胞、PK細胞和VERO細胞接種到96孔微量培養板中，待細胞長至90%單層時進行試驗。方法如下:將重組病毒用DMEM培養液在無菌Ep管中作10倍梯度稀釋，即從KT1-1O-'將各個稀釋梯度的病毒接種到96孔微量培養板，每個稀釋度作8孔重復，每孔接種100 μ L，病毒吸附2h后，每孔再加入IOOyLDMEM培養液。同時將兩縱排孔做為正常細胞對照，置細胞培養箱中培養，逐同觀察并且記錄結果，數據按照Reed-Muench兩氏法進行TCID50效價評定。
[0026]1.2.7重組病毒PGO株的安全性研究
注射小鼠:選30只PRV、PCV2血清學檢測均為陰性的6-8周齡健康昆明小鼠分別用重組病毒0.2ml (含毒量:2X IO5PFU)肌肉注射，隔離后人工飼養。逐日觀察小鼠的精神、食欲。
[0027]1.2.8重組病毒的理化特性研究
取3ml重組病毒平均分成6份(每份500 μ L)分別用氯仿、胰蛋白酶處理10min、5%石碳酸處理2min、l%氫氧化鈉處理lOmin、平攤到無菌培養皿中用紫外線照射30min,剩余的1份不做任何處理作為陽性對照，各取100 μ L接種到長滿ST細胞的細胞培養瓶中，并逐日觀察細胞病變情況。
[0028]1.2.9 RT-PCR 檢測 mRNA 含量
將純化的重組病毒液接種到致密ST細胞單層細胞中，待80%以上細胞出現病變時收毒，-20度與常溫反復凍融3次后，按照DNA提取方法進行DNA提取，并按照RNA提取試劑盒方法進行細胞總RNA的抽提，反轉錄后進行PCR擴增以檢測豬圓環病毒2型0RF2基因在ST細胞中的轉錄。
[0029]1.2.10細胞中0RF2蛋白表達的檢測
采用免疫過氧化物酶單層細胞試驗(Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)進行檢測。將ST細胞傳至96孔板上，待細胞長至90%左右每孔接10倍稀釋的重組病毒100 μ L，同時設未接毒細胞對照。細胞培養箱中吸附2h后加入含2%胎牛血清的DMEM維持液。24h后吸棄培養液并用PBS液清洗三遍，置37°C溫箱干燥lOmin。再用4°C預冷的4%甲醛液固定lOmin，PBS清洗三遍。將陽性血清用PBST-BSA液按1:50稀釋，并設陰性血清對照孔，每孔加液100 yL，37°C濕盒孵育lh，再用PBST洗5次。加入用PBST-BSA 1:200稀釋的HRP-SPA,同樣每孔加100 μ L，再置37°C濕盒孵育lh，取出后用PBST洗5次。每孔加入50μ L AEC顯色液避光作用15min，用PBST洗滌兩次后用顯微鏡進行結果觀察。
[0030]1.2.11遺傳穩定性評價
將獲得的單克隆重組病毒在ST細胞中傳至第15代，觀察其在細胞中綠色熒光表達情況，待細胞出現80%病變時進行收毒，反復凍融3次后，提取重組病毒DNA，用豬圓環病毒2型0RF2基因PCR擴增條件進行PCR擴增鑒定，并對PCR產物進行基因克隆，測序工作由華大基因科技有限公司完成。
[0031]2結果與分析
2.1重組質粒PGO的鑒定
用0RF2特異性引物對重組質粒PGO進行PCR擴增，電泳檢測結果顯示在約0.7kb處有清晰條帶，與預期結果相符(圖2)。重組質粒PGO用ifeMl I酶切后，出現了 2條帶，其中I條為插入的目的條帶，位置約為0.7kb，另外I條為載體條帶，位置約為7.1kb,與預期結果相符(圖3)。重組質粒PGO用治I酶和沒S/7T104 I酶雙酶切后會出現3條帶，若方向正確則第三條條帶大小約為1.1 kb (圖4)，若方向錯誤則在1.5 kb出現一條亮帶。測序報告序列為702bp，與以前本實驗室登陸的序列相比(HQ693093 )，完全序列一致。
[0032]2.2重組病毒綠色熒光鑒定及空斑篩選
將重組病毒液按10倍系列稀釋后接種ST細胞，覆蓋營養瓊脂以進行蝕斑篩選。轉染16后，重組轉移質粒PGO與PRV發生同源重組，重組病毒帶有EGFP基因，表達綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光。試驗表明條件優化前轉染效率較低，熒光量較少，優化條件后轉染效率大大提高，能觀察到大量綠色熒光。
[0033]將PCR陽性病毒液按10系列稀釋后接種六孔板并覆蓋營養瓊脂，進行蝕斑篩選純化，通過3輪蝕斑純化后獲得單克隆空斑(圖5)。
[0034]2.3重組病毒PGO株在不同細胞上的培養增殖特性觀察
2.3.1重組病毒PGO株在ST細胞上的培養增殖特性觀察
將PRV PGO株接種到長滿ST單層細胞，8h后觀察無明顯病變，倒置熒光顯微鏡下不能觀察到綠色熒光，12h后能觀察到細胞圓縮，在倒置熒光顯微鏡下能觀察到輕微的綠色熒光，24h后細胞明顯圓縮，在倒置熒光顯微鏡視野內能觀察到大量綠色熒光，36h后大量細胞脫落，此時倒置熒光顯微鏡內能觀察到許多漂浮狀的綠色熒光，48h后細胞脫落85%左右，僅能觀察到少量的綠色熒光。
[0035]2.3.2重組病毒PGO株在PK細胞上的培養增殖特性PRV PGO株接種單層PK細胞8h后，細胞無明顯病變且在倒置熒光顯微鏡下不能觀察到綠色熒光，12h后細胞圓縮、變亮且能觀察到少量綠色熒光，24h后大量細胞變形、并出現PRV特征性空泡病變，細胞面拉網現象明顯，倒置熒光顯微鏡下能觀察到大量綠色熒光，36h后細胞明顯融合、約70%的細胞發生脫落，觀察到的綠色熒光減少，48h后細胞基本脫落完全，僅能觀察到少量綠色熒光。
[0036]2.3.3重組病毒PGO株在VERO細胞上的培養增殖特性
PRV PGO株接種單層VERO細胞8h即出現病變，表現為細胞輪廓模糊、圓縮、變亮，但是倒置熒光顯微鏡下并不能觀察到綠色熒光；12h表現為細胞中等融合并呈多形性，倒置熒光顯微鏡下能觀察到少量綠色熒光。36h細胞表現為大融合，出現多量PRV特征性空泡病變，視野內呈現拉網狀，此時用倒置熒光顯微鏡能夠觀察到大量的綠色熒光；48h細胞形成島嶼狀堆聚，并表現為塊狀脫落，倒置熒光顯微鏡下能觀察到團塊狀綠色熒光。
[0037]2.3.4重組病毒PGO株在IBRS-2細胞上的培養增殖特性
PRV PGO株接種IBRS-2細胞單層細胞8h后能觀察到細胞呈多形性，但是倒置熒光顯微鏡下并不能觀察到綠色熒光，12h細胞腫脹、變亮、變圓，能觀察到少量綠色熒光；24h細胞融合，PRV特征空泡病變，倒置熒光顯微鏡下能觀察到大量綠色熒光；36h細胞出現大面積脫落，倒置熒光顯微鏡下能觀察到零星綠色熒光；48h細胞基本脫落完全，倒置熒光顯微鏡下僅能觀察到少量綠色熒光。
[0038]2.4重組病毒PGO株在多種細胞上TCID50測定結果
重組病毒在ST、PK15、VERO及IBRS-2細胞上的增殖滴度分別為106 125/0.1ml、104.125/0.lmlU04 625/0.lmlU06 25/0.1ml，結果表明重組病毒在IBRS-2細胞和ST細胞上的增殖滴度與疫苗親本毒株的增殖滴度( 106 125/0.1ml)相似，而PK細胞和VERO細胞增殖滴度較低，故ST細胞和IBRS-2細胞更適合重組病毒的大量培養。
`[0039]2.5重組病毒的理化特性研究
重組病毒用氯仿、胰蛋白酶處理10min、5%石碳酸處理2min、紫外線照射30min、l%氫氧化鈉處理IOmin均能使病毒失去活性，接種ST細胞后不引起任何細胞病變，而對照組接種ST細胞后12h即能觀察到綠色熒光并在24h左右出現特征性空泡病變。
[0040]2.6重組病毒PGO株的安全性研究結果
注射后Id和2d有個別發生應激，精神狀況和食欲均有所下降，但是注射后3-4d后精神狀況、食欲恢復正常，試驗結果表明該重組病毒PGO株對小鼠是安全的。
[0041]2.7重組病毒DNA的PCR結果
提取重組病毒DNA并進行PCR擴增、電泳，出現I條長約702bp的特異條帶，與預期的目的條帶大小一致。
[0042]2.8表達PCV2 0RF2基因的重組病毒的鑒定
2.8.1 RT-PCR 結果
從重組病毒感染的病變細胞中提取總RNA，用豬圓環病毒2型0RF2基因的特異性引物進行RT-PCR擴增。結果表明，獲得I條約705bp的的特異性帶，與預期擴增大小相一致。
[0043]2.8.2 IPMA 結果
用重組病毒感染細胞與健康細胞進行IPMA方法檢測，結果表明PCV2陽性血清能夠與重組病毒感染的細胞發生反應并呈現棕紅色，而對照組健康細胞反應則不著色，該實驗結果表明重組病毒表達了特異性PCV2 0RF2蛋白。
[0044]2.9遺傳穩定性評價
獲得的單克隆重組病毒在ST細胞中傳15代后依然有綠色熒光存在(如圖6),隨機挑取10個空斑進行0RF2基因的PCR擴增鑒定，結果10個空斑均擴出了 0RF2目的基因片段，證實傳代后的重組病毒含有0RF2基因(如圖7)。并對PCR產物送至華大基因公司進行測序測定，測序結果與通用質粒中0RF2基因序列一致(Genbank登錄號:HQ693092)，上述結果表明攜帶了 0RF2基因的重組病毒遺傳穩定。重組病毒0RF2基因RT-PCR的核苷酸測序結果如下:
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60 cagatcctcc gccgccgccc ctggctcctc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120 aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180 acagtcaaaa cgcccccctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240 cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300 gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360 agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420 tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480 tttaccccca aacctatcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540 aatcagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600 gcgttcgaaa acagtat ata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660 ttcagagaat ttaatcttaa agaccccccc cttaaccctt aa702
3結論與討論 3.1關于構建豬圓環病毒II型0RF2基因重組豬偽狂犬活載體病毒的思路豬圓環病毒可引起豬呼吸道綜合征、仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征、豬增生和壞死性肺炎、豬皮炎與腎病綜合征、先天性震顫、繁殖障礙等多種疾病，其中PMWS最早是1991年由Clark EG首次報道，隨后法國、北愛爾蘭、美國、墨西哥等國也確認了該病的存在，并且現階段我國大多數地區的各類豬群中也普遍存在PCV2感染。PCV2全病毒能夠在PK-15細胞上進行增殖，但增殖滴度較低，須借助間接免疫熒光試驗(IFA)和免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)進行毒價測定，故使用制備全病毒滅活疫苗技術難度大、操作繁瑣、成本較高。所以DNA疫苗、亞單位疫苗及病毒活載體疫苗的研制成為防制豬圓環病毒病的重要方向。亞單位疫苗生產成本較高、DNA疫苗存在安全隱患及嵌合病毒疫苗的滴度較低，本實驗所選取的病毒活載體疫苗研究更能滿足未來疫苗的發展要求。
[0045]3.2關于PCV2病毒的抗原性基因的利用
PCV2有2個主要的閱讀框:0RF1和0RF2。其中ORFl開放閱讀框架位于正鏈(病毒基因組鏈)上并以順時針方向排列，該閱讀框編碼與病毒復制相關的Rep蛋白；0RF2開放閱讀框架位于負鏈(病毒基因組互補鏈)上以逆時針方向排列，該閱讀框編碼病毒的結構蛋白(Cap蛋白)，該蛋白為PCV2囊膜的主要成分，目前對0RF2的研究已成為PCV2研究的熱點。McNeilly等研究結果表明0RF2表達的蛋白中含有PCV2病毒的中和抗原表位。Nawagitgul等將PCV2的0RF2基因進行克隆并使其在昆蟲細胞中表達，電鏡觀察結果表明其表達產物能夠自動組裝為病毒核衣殼樣粒子，此研究進一步證實了 0RF2基因能夠編碼病毒核衣殼蛋白。故本研究選取了 PCV2的0RF2基因作為免疫原性基因并將其克隆到了通用載體PG中。
[0046]3.3關于轉移質粒PGO的構建
一個良好的轉移質粒必須具有較強的啟動子、有效的Poly(A)及兩端足夠長的同源側翼。本研究所構建表達綠色熒光蛋白gG缺失的通用轉移載體PG含有偽狂犬病病毒自身晚期基因gG啟動子、hCMV、SV40 Poly(A)、上下游側翼分別為0.8 kb和1.7 kb，完全可以滿足同源重組的需要。本研究在gG基因啟動子的下游^I酶切位點處插入0RF2基因，成功構建了攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)的偽狂犬病毒基因缺失轉移載體(PG0)，并在ST細胞上轉染成功。
[0047]3.4關于轉染條件的優化
影響轉染的因素很多，其中轉移載體質粒(PGO)的提取極為重要，因為如果提取的質粒中含有大腸桿菌內毒素及質粒的純度不高均能會大大降低轉染效率，甚至導致轉染失敗，所以我們使用B10MIGA無內毒素質粒小提試劑盒進行質粒的提取。目前主要的轉染方法有電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法及脂質體法等，其中脂質體與生物膜有較大的相似性及組織相容性，具有毒性小、高效、操作相對簡單、無污染的優點，并且同其它轉染方法相比，其轉染效率提高了十多倍，故本實驗采用脂質體法轉染。且由于脂質體對細胞膜有一定的損傷作用，故轉染時間不宜太長，以4-6 h為宜，時間過長會導致ST細胞大批脫落和死亡，從而導致轉染失敗。此外，還要考慮細胞狀態及脂質體與轉移載體質粒之間的比例等因素，且六孔板轉染體系中三者的最優比例為PRV DNA =PGO質粒:Lipofectamine? 2000為10 μ g:4 μ g: 10 μ L。
[0048]3.5關于重組病毒的空斑篩選
為實現外源0RF2基因的穩定整合表達，本實驗利用脂質體和病毒性載體共轉染的方式進行同源序列介導的基因重組，即將PRV疫苗株DNA與含有豬圓環病毒0RF2基因的重組質粒PGO在ST細胞上通過脂質體轉染系統進行同源序列重組。通過在熒光顯微鏡下進行的挑斑技術挑取單個綠色熒光蝕斑，通過3輪蝕斑純化后獲得了重組病毒單克隆毒株。單克隆毒株接種24孔板后各孔均能通過PCR擴增出攜帶的0RF2基因目的條帶，結果證實了PCV2 0RF2目的基因己經成功整合到重組病毒基因組中，綜上述我們獲得了純化的重組病毒，且PCV2的0RF2基因蛋白在重組病毒中得到了表達，并且具有生物學活性。純化的重組病毒在ST、ΡΚ15、VERO及IBRS-2細胞上的增殖滴度分別為106 125/0.lml、104 125/0.1ml、104.625/0.lmlU06 25/0.1ml，結果表明重組病毒在IBRS-2細胞和ST細胞上的增殖滴度與疫苗親本毒株的增殖滴度(106_ 125/0.1ml)相似，而PK細胞和VERO細胞增殖滴度較低，故ST細胞和IBRS-2細胞更適合重組病毒的大量培養。理化特性試驗結果表明重組病毒具有PRV通性。
[0049]試驗二豬圓環病毒II型0RF2基因重組豬偽狂犬病毒免疫效力觀察 I材料與方法
. 1.1材料
. 1.1.1試驗動物
.6周齡雌性昆明小鼠30只，購自河南省試驗動物中心。
[0050]1.1.2疫苗及毒種豬圓環病毒滅活疫苗購自武漢科前生物制品公司；PCV2病毒HZ09保藏編號CCTCC NO:V201312及獲得的偽狂犬活載體重組病毒PGO株保藏編號CCTCC NO:V201315。
[0051]PCV2病毒HZ09株由河南農業大學于2009年8月采自鄭州某豬場疑似斷奶后多系統衰竭綜合征豬的淋巴結、肺臟和脾臟等組織分離。
[0052]1.1.3主要試劑
海克隆DMEM細胞培養液、四季青胎牛血清購自鄭州賽斯生物科技有限公司；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司、豬圓環病毒II型ELISA檢測試劑盒購自武漢科前生物制品公司、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG抗體購于北京博奧森生物技術發展公司。
[0053]1.2動物分組免疫
將30只6周齡雌性小鼠隨機分為3組，10只/組。其中A為重組病毒免疫組，B為PCV2疫苗免疫組，C為DMEM培養液免疫對照組，免疫途徑均采用兩后肢脛骨前肌多點注射100 μ I/只。免疫方案見表1。
[0054]表1試驗鼠分組及免疫情況
【權利要求】
1.一種表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株，其特征在于:重組豬偽狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO:V201315。
2.如權利要求1所述的表達豬圓環病毒II型0RF2基因的重組豬偽狂犬病毒毒株的制備方法，包括設計與合成引物，增殖偽狂犬病毒，提取偽狂犬病毒DNA，轉染，純化，其特征在于:所述轉染步驟如下: (1)取100μ L TCID50為10_6125/0.Iml的PRV TK7gG7gE_病毒接種到六孔板中并用DMEM培養液補至350 μ L，置細胞培養箱中吸附2h，每隔30min搖晃一次； (2)將240 μ I 無血清培養基 OPT1-MEM 和 10 μ I Lipofectamine 2000 于 EP 管中混合均勻，得到溶液A ; (3)將4μ g去內毒素質粒PGO補OPT1-MEM至總體積250 μ L并于EP管中混合均勻，孵育5min，得到溶液B ; (4)將溶液A和溶液B混合后在室溫下靜置20-30min，得到溶液C； (5)將步驟(1)中六孔板中的細胞用無血清培養基沖洗兩遍后，加入2ml無血清培養基; (6)將步驟(4)中溶液C逐滴加入六孔板中，搖動培養板，輕輕混勻，在37°C,體積濃度為5%的CO2中保溫5-6h ； (7)6h后，更換有血清的 全培養基，37°C，5%C02中48-72h檢測轉染水平。
【文檔編號】C12N15/63GK103509761SQ201310242909
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年6月19日 優先權日:2013年6月19日
【發明者】陳紅英, 崔保安, 鈔安軍, 鄭蘭蘭, 朱前磊, 魏戰勇, 李新生, 李坤 申請人:河南農業大學