雜交瘤細胞株15號及其產生的抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】雜交瘤細胞株15號及其產生的抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體，屬于免疫化學【技術領域】。本發明通過常規的細胞融合技術制備了一株鼠源的雜交瘤細胞株15號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.7215。該細胞株分泌的單克隆抗體采用間接競爭酶聯免疫法測定，和10種擬除蟲菊酯存在交叉反應，分別為甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯和順式氯氰菊酯的單克隆抗體，IC50范圍在3.2-50ng/mL之間；其產生的抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體，可用于膠體金免疫層析試紙條和免疫傳感器的研制，為農產品中擬除蟲菊酯殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。
【專利說明】雜交瘤細胞株15號及其產生的抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株鼠源的雜交瘤細胞株15號及其產生的能同時識別10種擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體，可用于膠體金免疫層析試紙條和免疫傳感器的研制，屬于免疫化學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]據統計，目前世界上已有70多種擬除蟲菊酯類殺蟲劑，占全世界殺蟲劑市場的20%;其殺蟲活力比以前提高了十倍甚至百倍；再加上擬除蟲菊酯類殺蟲劑對于哺乳動物和鳥類的毒性非常低，因此，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的應用得到了前所未有的發展，也使農業生產獲得了巨大的經濟效益。然而，隨之也帶來了擬除蟲菊酯的殘留問題。盡管擬除蟲菊酯類農藥屬于環境友好型農藥，但使用不當很容易造成殘留超標；污染水源、大氣和土壤；通過呼吸、食物和滲入等方式進入人體，危害人類健康。據報道，長期食用擬除蟲菊酯殘留超標的食品，很可能會引起人類的慢性中毒，導致疾病的發生如發生皮膚瘙癢，甚至會影響下一代的健康。另外，自我國加入世貿組織以來，由于我國農產品中農殘標準與歐美國家的差距較大，造成了多種具有競爭潛力的農產品包括水果、蔬菜、蜂蜜、茶葉以及大米等，屢遭國際貿易綠色壁壘的阻礙而不能出口，如茶葉中擬除蟲菊酯的最高殘留限量參考值(20ppm)比國外實施的標準(Ippm)高出了 20倍，嚴重地影響了我國的對外貿易聲譽，造成了巨大的經濟損失。
[0003]目前，擬除蟲菊酯類農藥的分析方法有比色法、色譜法、免疫分析法和傳感檢測技術。其中色譜法應用的最為廣泛，包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜分析方法(HPLC)、氣質聯用(GC-MS)、液質聯用(LC-MS)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細管電泳(CE)等。然而這些方法(除了 TLC外)需要昂貴的儀器、專業的操作人員和復雜的樣品凈化，不適用于農產品中擬除蟲菊酯 殘留的日常快速檢測。隨著檢測擬除蟲菊酯免疫分析技術的發展，不僅可以解決上述問題，并且具有高通量和低成本的優勢，適于現場的批量檢測。建立擬除蟲菊酯類農藥的免疫檢測技術，首先要獲得擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供了雜交瘤細胞株15號及其產生的抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體。
[0005]本發明的技術方案:一株分泌抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體的雜交瘤細胞株15號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.7215。
[0006]所述的雜交瘤細胞株15號產生的單克隆抗體，能夠廣譜性地識別10種擬除蟲菊酯，且靈敏度好，半數抑制濃度(IC50)在3.2-50 ng/mL之間；
10種擬除蟲菊酯為:甲氰菊酯(CAS 39515-41-8)、氯氰菊酯(CAS 52315-07-8)、高效氯氰菊酯(CAS-65731-84-2 )、氟氯氰菊酯(CAS 68359-37-5 )、高效氯氟氰菊酯(CAS91465-08-6)、氰戊菊酯(CAS 51630-58-1)、溴氰菊酯(CAS 52918-63-5)、氟胺氰菊酯(CAS102851-06-9)、苯醚氰菊酯(CAS 39515-40-7)，順式氯氰菊酯(CAS 67375-30-8)。
[0007]所述的單克隆抗體的應用，在于在擬除蟲菊酯總量檢測中的應用。
[0008]本發明將半抗原I (hapten 1，結構a)通過活性酯法和血藍蛋白偶聯，用作免疫原；將半抗原2 (hapten 2，結構b)通過羧基二咪唑法和雞卵清蛋白偶聯，用作包被原。通過小鼠免疫、抗血清測定、細胞融合、篩選和亞克隆技術得到穩定分泌抗擬除蟲菊酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株15號，通過體內誘生法制備腹水，辛酸-硫酸銨沉淀法純化得到相應的單克隆抗體。
[0009]半抗原I (haptenI, a)和半抗原 2 (hapten2, b)的結構:
【權利要求】
1.一株分泌抗擬除蟲菊酯的群選性單克隆抗體的雜交瘤細胞株15號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7215。
2.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株15號產生的單克隆抗體，其特征在于能夠廣譜性識別10種擬除蟲菊酯，且靈敏度好，半數抑制濃度IC5tl在3.2-50 ng/mL之間； .10種擬除蟲菊酯為:甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯、苯醚氰菊酯，順式氯氰菊酯。
3.權利要求2所述的單克隆抗體的應用，其特征在于在擬除蟲菊酯總量檢測中的應用。
【文檔編號】C12N5/20GK103509757SQ201310276061
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月3日 優先權日:2013年7月3日
【發明者】匡華, 陳秀金, 徐利廣, 胥傳來, 宋姍姍, 任國艷, 張勛, 馬偉 申請人:江南大學