一種芒、粒長及每穗粒數的調控基因及其應用的制作方法

一種芒、粒長及每穗粒數的調控基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種芒、粒長及每穗粒數的調控基因及其應用。首次揭示通過在禾谷類作物中定向調控An-1基因表達水平，可顯著調節作物的產量、芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構等重要的性狀，進而達到改良禾谷類作物、增加產量等目的。
【專利說明】-種芒、粒長及每穗粒數的調控基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及一種芒、粒長及每穗粒 數的調控基因及其應用。

【背景技術】
[0002] 隨著全球耕地面積的逐年減少，農作物的產量難以維持人類的發展。雖然糧食作 物的畝產在增加，但總產量難以維持增勢。根據聯合國糧農組織發布的報告，全球面臨較大 的糧食危機。一些主要糧食作物的品種改良顯得極為迫切。
[0003] 水稻是全世界一半以上人口的主要糧食作物。亞洲栽培稻（Oryza sativa L.)主 要分為秈稻（Oryza sativa L. ssp. Indica)和粳稻（Oryza sativa L. ssp. Japonica)兩個 亞種。就其起源，研究顯示亞洲栽培稻可能是由普通野生稻（Oryza rufipogon GrifT.)經 過馴化而來的。在人工選擇的作用下，與野生稻相比，栽培稻的性狀發生了明顯的變化，這 些變化使得栽培稻更加適合早期的農業種植，為人類提供了可靠的食物來源。如落粒性的 降低，直立生長，枝梗數目和小穗數目的增加，種子附屬物芒的退化消失，甚至種子殼色和 果皮顏色都發生了變化。因此人工馴化基因的克隆，不僅讓本發明人逐步了解人工選擇的 機制和栽培稻性狀的起源，也為新一代分子育種提供性狀改良的分子調控信息。
[0004] 人工馴化基因一般是通過圖位克隆技術完成的，即通過野生祖先種和栽培種雜 交，利用雜交后代對數量性狀（Quantitative Irait Locus, QTL)進行遺傳作圖分析，同 時制備高世代回交材料將QTL位點分離為孟德爾遺傳的單因子，再進行精細定位和基因克 隆。目前水稻中已有多個與馴化相關的基因被克隆，比如控制落粒的基因 qSHl、SH4,控制 分蘗角度的基因 PR0G1，控制紅色米皮的基因 Rc，控制黑色穎殼的基因 Bh4、控制粒寬的基 因 qSW5和控制糯質的基因 Wx。對馴化基因的研究顯示性狀變化的分子機制十分復雜。有 些基因的自然突變直接破壞基因功能從而使表型發生變化，如PR〇Gl、Bh4、Rc。有些基因則 是通過蛋白質修飾或者調控變化來改變表型，如qSHl在5'調控區的一個SNP變化導致離 層的缺失，SH4在編碼區的一個SNP變化引起單氨基酸替換使落粒性降低。栽培稻分為粳 稻和秈稻加大了水稻馴化的復雜性，最近的研究表明SH4、PR0G1、qSW5、Bh4的等位變異在 粳稻和秈稻中固定下來，Rc和Wx只在粳稻群體中固定。
[0005] 野生稻的種子普遍具有長芒，芒在種子傳播和防止鳥獸食用起著重要的作用；但 是具芒的種子不易收獲和儲存，芒在人工選擇中逐漸退化喪失，致使大部分栽培稻無芒。很 多禾谷類作物種子都有芒，如大麥、小麥、燕麥、黑麥和水稻等，芒是這些植物穗部的一個重 要組成部分。在小麥中，芒是重要的光合器官之一，其同化產物直接運往所著生的小穗，特 別是在灌漿后期對籽粒充實起重要的作用，從農業生產上看，小麥的有芒品系普遍具有較 高的產量，芒在小麥中的增產作用使其在漫長的作物馴化過程中被保留下來。與小麥相比， 水稻的芒在從野生稻馴化到栽培稻的過程中慢慢退化，因而現在的大部分栽培稻是無芒或 短芒品種。
[0006] 長期的QTL研究顯示野生稻的芒是由多基因控制的，且易受到環境因素影響，控 制芒的QTL分布在多條染色體上，但目前尚未見相關基因克隆和功能研究的詳細報道。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種芒、粒長及每穗粒數的調控基因及其應用。
[0008] 在本發明的第一方面，提供一種調控禾谷類作物農藝性狀和/或產量性狀的方 法，所述方法包括：調節禾谷類作物中An-I基因的表達。
[0009] 在一個優選例中，所述的禾谷類作物是禾本科植物；較佳地，所述的禾本科植物是 水稻，大麥、小麥、燕麥、黑麥；和/或
[0010] 所述的農藝性狀包括：芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構（如枝梗數）。
[0011] 在另一優選例中，所述的An-ι基因編碼：
[0012] (a)如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽（An-Ι多肽）；
[0013] (b)將SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4氨基酸序列經過一個或多個（如1-20個；較 佳地1-10 ;更佳地1-5個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能 的由（a)衍生的多肽；或
[0014] (c)與（a)限定的多肽序列有80%(較佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98%)以上同 源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽。
[0015] 在另一優選例中，所述的An-I基因具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示的核苷 酸序列或其簡并的序列。
[0016] 在另一優選例中，所述調控禾谷類作物農藝性狀和/或產量性狀的方法包括：降 低禾谷類作物中An-I的表達；從而：增加產量；降低粒長；增加每穗種子顆粒數；增加每穗 枝梗數；縮短種子的芒長；和/或減少種子的有芒率。
[0017] 在另一優選例中，所述降低禾谷類作物中An-I基因的表達包括：
[0018] 將下調An-I基因轉錄、蛋白表達或蛋白活性的下調劑轉入禾谷類作物中；較佳 地，所述的下調劑是特異性干擾An-I基因轉錄的干擾分子。
[0019] 在另一優選例中，所述的干擾分子是以An-I基因或其轉錄本為抑制或沉默靶標 的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA,或能表達或形成所述dsRNA、反義核酸、小干擾 RNA、微小RNA的構建物；較佳地，所述的干擾分子是以SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3 (較佳 地，針對SEQ ID N0:1或3序列的3'UTR的一部分（SEQ ID N0:5))作為沉默靶標的dsRNA 或構建物。
[0020] 在另一優選例中，所述的干擾分子是構建物，含有式（I)所示的結構：
[0021] Seq正向-X-Seq反向 式⑴，
[0022] 式⑴中，SeqttS SEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq反向為與Seqtt互補的多核 苷酸；
[0023] X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向 不互補。
[0024] 在另一優選例中，所述降低禾谷類作物中An-I基因的表達的方法包括：
[0025] (i)提供攜帶可干擾基因表達的載體的農桿菌，所述的載體選自下組：
[0026] (a)含有反方向啟動的An-I基因或基因片段（反義分子）的載體；
[0027] (b)含有可在植物體內形成特異性干擾An-I基因表達（或轉錄）的成分的干擾分 子（如式⑴構建物）的載體；
[0028] (ii)將植物的組織或器官與步驟（i)中的農桿菌接觸，從而使所述載體轉入植物 組織或器官。
[0029] 較佳地，所述降低禾谷類作物中An-I基因的表達的方法還包括：
[0030] (iii)選擇出轉入了所述載體的植物組織或器官；和
[0031] (iv)將步驟（iii)中的植物組織或器官再生成植物。
[0032] 在另一優選例中，所述調控禾谷類作物農藝性狀和/或產量性狀的方法包括：提 高禾谷類作物中An-I基因的表達，從而：增加種子的粒長；減少每穗種子顆粒數；減少每穗 枝梗數；增加種子的芒長；和/或增加種子的有芒率。
[0033] 在另一優選例中，所述提高禾谷類作物中An-I基因的表達包括：將An-I基因轉入 禾谷類作物，獲得轉化的禾谷類作物。
[0034] 在另一優選例中，所述提高禾谷類作物中An-I基因表達的方法包括：
[0035] (SI)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有An-I基因；
[0036] (S2)將植物的細胞或組織或器官與步驟（SI)中的農桿菌接觸，從而使所述的多 核苷酸轉入植物組織、器官或種子。
[0037] 較佳地，所述提高禾谷類作物中An-I基因表達的方法還包括：
[0038] (S3)選擇出轉入了所述的An-I基因的植物組織、器官或種子；和
[0039] (S4)將步驟（S3)中的植物組織、器官或種子再生成植物。
[0040] 在本發明的另一方面，提供一種An-I基因的用途，用于調控禾谷類作物農藝性狀 或產量性狀；所述的農藝性狀包括：芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構（如枝梗 數）。
[0041] 在本發明的另一方面，提供一種An-I基因的用途，用于作為鑒定禾谷類作物農藝 性狀或產量性狀的分子標記；所述的農藝性狀包括：芒性狀、種子形態或飽滿度性狀、種子 數量性狀、穗型結構（如枝梗數）。
[0042] 在本發明的另一方面，提供一種降低An-I基因表達的物質，所述物質含有式（I) 所示的結構：
[0043] Seq正向-X-Seq反向 式⑴，
[0044] 式⑴中，SeqttS SEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq反向為與Seqtt互補的多核 苷酸；和
[0045] X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向 不互補。
[0046] 在本發明的另一方面，提供一種降低An-I基因表達的物質的用途，用于調控植物 農藝性狀或產量性狀；包括：增加產量；降低粒長；增加每穗種子顆粒數；增加每穗枝梗數； 縮短種子的芒長；和/或減少種子的有芒率。
[0047] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖UAn-I的克隆及功能驗證。
[0049] (A)SL4/GLA4/CSSL-Z3 的穗型比較（Bar = 10mm)。
[0050] (B)SL4/GLA4/CSSL-Z3 的芒長比較（Bar = 10mm)。
[0051] (C)SL4中第4號染色體芒QTL定位，An-I位于M6298和M6285之間，An-2位于 Ml 108 和 Ml 160 之間。
[0052] (D)An-I精細定位，最后定在FM3和FM6之間約70Kb的區域，對應于兩個日本晴 BAC和一個W1943的BAC。FM1-9代表精細定位的分子標記，箭頭顯示基因方向。
[0053] (E)在FM3和FM6之間W1943和日本晴序列比較及基因注釋比較。黑色代表基因 組片段，灰色代表共線性區域，紅色代表轉座子或重復序列，綠色代表正向預測基因，藍色 代表反向預測基因。
[0054] (F)An-I基因結構和用于功能分析的質粒。pCPL代表An-I互補質粒，pOX代表 An-I過表達質粒，pRNAi代表An-I-RNAi質粒。
[0055] 圖2、An-I轉錄激活活性和核定位。
[0056] ㈧酵母激活系統中An-I蛋白轉錄激活活性。
[0057] (B)An-I-GFP 定位在核中。
[0058] (C)對照35S-GFP定位在核中和細胞膜上。
[0059] 圖3、栽培稻和野生稻中三種典型的單倍型
[0060] ⑷粳稻中主要單倍型an-1 (Tn+)。
[0061] (B)秈稻中主要單倍型an-1 (G-)。
[0062] (C)野生稻中主要單倍型An-1。
[0063] 圖4、芒長比較。
[0064] (A) GLA4和NIL-An-I的一次枝梗頂粒照片。
[0065] (B)日本晴、互補CPL和過表達OX的一次枝梗頂粒照片。
[0066] (C) Kasalath和RNAi-6的一次枝梗頂粒照片。
[0067] (D) GLA4和NIL-An-I的一次枝梗頂粒芒長比較。
[0068] (E)日本晴、互補CPL和過表達OX的一次枝梗頂粒芒長比較。
[0069] (F) Kasalath和RNAi的一次枝梗頂粒芒長比較（Bar = 10mm)。
[0070] 圖5、粒長比較。
[0071] (A) GLA4 和 NIL-An-I 的 10 粒種子照片。
[0072] (B)日本晴、互補CPL和過表達OX的10粒種子照片。
[0073] (C)Kasalath、RNAi-2 和 RNAi-610 粒種子照片。
[0074] (D) GLA4 和 NIL-An-I 粒長比較。
[0075] (E)日本晴、互補CPL和過表達OX粒長比較。
[0076] (F) Kasalath 和 RNAi 粒長比較（Bar = 10mm)。
[0077] 圖6、每穗粒數比較和單株產量比較。
[0078] (A) GLA4 和 NIL-An-I 的整穗照片。
[0079] (B) Kasalath、RNAi-2 和 RNAi-6 的整穗照片。
[0080] (C) GLA4和NIL-An-I的每穗粒數比較。
[0081] (D)Kasalath和RNAi的每穗粒數比較。
[0082] (E)日本晴、互補CPL和過表達OX的整穗照片。
[0083] (F)日本晴、互補CPL和過表達OX的每穗粒數比較。
[0084] (G)日本晴、互補CPL-I和CPL-2單株產量比較。
[0085] 圖7、An-I表達水平比較。
[0086] (A) An-I表達水平在GLA4和NIL-An-I之間的比較。
[0087] (B)An-I表達水平在日本晴、互補CPL-I和CPL-2之間的比較。
[0088] (C)An-I表達水平在Kasalath4和RNAi株系之間的比較。
[0089] (D) LOG表達水平在日本晴、互補CPL-I和CPL-2之間的比較。
[0090] 圖8、芒的發育及An-I和Histone H4的表達模式。
[0091] (A1-A5)在不同發育時期GLA4小穗的電鏡掃描照片，箭頭所指外莩頂端。
[0092] (B1-B5)在不同發育時期NIL-An-I小穗的電鏡掃描照片，箭頭所指芒原基。
[0093] (C1-C5)An-I在GLA4小穗不同發育時期的時空表達模式，箭頭所指外莩頂端。
[0094] (D1-D5) An-I在NIL-An-I小穗不同發育時期的時空表達模式，箭頭所指芒原基。 [0095] (El)在SpSl期，GL4小穗組織切片染色的照片，箭頭所指外莩頂端。
[0096] (E2-E5)Histone H4在GLA4小穗發育中的時空表達模式，箭頭所指外莩頂端。
[0097] (Fl)在SpSl期，NIL-An-I小穗組織切片染色的照片，箭頭所指芒原基。
[0098] (F2-F5)Histone H4在NIL-An-I小穗發育中的時空表達模式，箭頭所指芒原基 (Bars=IOO μ m) Sp81 :Sp8 晚期。
[0099] 圖9、種子表面娃質化細胞比較分析和Histone Hs的表達分析。
[0100] (A)完整種子的掃描電鏡照片，箭頭1代表種子表面放大的區域，箭頭2代表沿水 平長軸對種子表面娃質化細胞計數區間。Bars=lmm。
[0101] (B)Kasalath種子表面放大的區域。
[0102] (C) RNAi-6種子表面放大的區域Bars=IOO μ m。
[0103] (D)Kasalath和RNAi種子表面硅質化細胞計數比較。
[0104] (E) Kasalath 和 RNAi 小于 4cm 幼穗中 Histone Hl 表達比較。
[0105] (F)日本晴種子表面放大的區域。
[0106] (G) CPL-1種子表面放大的區域Bars=IOO μ m。
[0107] (H)日本晴和CPL-I種子表面硅質化細胞計數比較。
[0108] (I)日本晴和CPL-1小于4cm幼穗中Histone Hl表達比較。
[0109] 圖10、芒的發育及An-I和Histone H4的表達模式（Bars=IOO μ m)。
[0110] (A-D)An-I在NIL-An-I花序發育不同時期的時空表達模式。
[0111] (E-H)An-I在GLA4花序發育不同時期的時空表達模式。
[0112] (I-L)An-I在CPL-I花序發育不同時期的時空表達模式。
[0113] (M-P)OSHl在NIL-An-I花序發育不同時期的時空表達模式。
[0114] 圖1UW1943中An-I 1978bp全長cDNA序列，其編碼262氨基酸，下劃線部分是保 守的bHLH結構域。
[0115] 圖12、GLA4中an-Ι基因的1979bp全長cDNA編碼263氨基酸，下劃線部分是保守 的bHLH結構域。第一個代表在GLA4中插入的丙氨酸，第二個0代表的因一個堿基替 換造成的丙氨酸代替甘氨酸。

【具體實施方式】
[0116] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次揭示通過在禾谷類植物（作物）中定向調 控An-I基因表達水平，可顯著調節植物的產量、芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結 構等重要的性狀，進而達到改良禾谷類作物、增加產量等目的。
[0117] 如本文所用，所述的"禾谷類作物"可以是禾本科植物或有芒植物（作物）。較佳 地，所述的禾本科植物是水稻，大麥、小麥、燕麥、黑麥。有芒植物是指種子殼上存在針狀物 植物。
[0118] 如本文所用，An-I基因編碼的多肽命名為"An-Ι"。在本發明中，術語"An-Ι"指具 有An-I活性的SEQ ID N0:2或4序列的多肽。該術語還包括具有與An-I相同功能的、SEQ ID N0:2或4序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：若干個（通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個）氨基酸的缺 失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個（通常為20個以 內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內）氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相 似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加 一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括An-I的活性片段和活性 衍生物。
[0119] 任何一種An-I的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這里，An-I的生物活 性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的An-I的全部或部分功能。通常情況 下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長An-I的活性。在更優選的條件下，所述活性 片段能夠保持全長An-I的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
[0120] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突 變體。
[0121] 任何與所述的An-I同源性高（比如與SEQ ID N0:2或4所示的序列的同源性為 70%或更高；優選的，同源性為80%或更高；更優選的，同源性為90%或更高，如同源性95%， 98%或99%)的、且具有An-I相同功能的多肽也包括在本發明內。
[0122] 本發明還涉及編碼本發明An-I或其保守性變異多肽、衍生物的多核苷酸序列。所 述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的 DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼 區序列可以與SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 3所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如 本文所用，"簡并的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQ ID N0:2或4的蛋白質，但與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示的編碼區序列有差別的核酸序列。"編碼多肽的多核苷酸"可 以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷 酸。
[0123] 本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%， 更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸 可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指：（1)在較低離子強度和較高溫度下的 雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C ;或（2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺， 0. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上， 更好是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0:2或4 所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
[0124] 應理解，雖然本發明的An-I基因優選獲自水稻，但是獲自其它植物的與水稻An-I 基因高度同源（如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性）的其它基因也 在本發明考慮的范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。
[0125] 本發明的An-I核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合 成的方法獲得。
[0126] 本發明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或An-I編碼序列 經基因工程產生的宿主細胞。
[0127] 所述的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會 使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于 啟動子以增強基因的轉錄。
[0128] 本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
[0129] 用重組DNA轉化宿主可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。轉化植物可使用 農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植 物組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得性狀發生改變的植物。
[0130] 本發明提供了所述的An-I基因的用途，用于調控植物農藝性狀或產量性狀；或用 于篩選對于調控植物農藝性狀或產量性狀有用的物質（即：所述物質通過調節An-I基因的 表達來調節植物農藝性狀或產量性狀）。作為一種優選方式，所述的An-I基因可用于：增 加種子的粒長；減少每穗種子顆粒數；減少每穗枝梗數；增加種子的芒長；和/或增加種子 的有芒率。
[0131] 本發明還涉及An-I上調劑或下調劑及其用途。由于An-I的上調劑或下調劑可調 節An-I的表達和/或活性等，因此，所述的上調劑或下調劑也可通過對An-I的影響來調控 植物農藝性狀或產量性狀，從而達到改良植物的目的。
[0132] 任何可提高An-I的活性、提高其的穩定性、促進其表達、延長其有效作用時間、或 促進其基因轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，作為可用于調控植物農藝性狀或產量性狀 的物質。
[0133] 任何可降低An-I的活性、降低其穩定性、抑制其表達、減少其有效作用時間、或降 低其轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，作為An-I的下調劑、拮抗劑或抑制劑，如干擾所 述An-I基因表達的干擾分子（如可形成microRNA的干擾分子）。所述的下調劑、拮抗劑或 抑制劑可用于調控植物農藝性狀或產量性狀。在得知了靶序列后，制備干擾特定基因表達 的干擾分子的方法是本領域人員熟知的。
[0134] 本發明還涉及一種調控植物農藝性狀或產量性狀的方法，該方法包括調節所述植 物中An-I基因的表達。
[0135] 一方面，本發明提供了另一種調控植物（如作物）農藝性狀或產量性狀的方法，所 述的方法包括：降低所述植物中An-I基因的表達（包括使An-I基因不表達或低表達）；從 而增加產量；降低粒長；增加每穗種子顆粒數；增加每穗枝梗數；縮短種子的芒長；和/或 減少種子的有芒率。
[0136] 另一方面，本發明提供了一種調控植物（如作物）農藝性狀或產量性狀的方法，所 述的方法包括：使所述植物過量表達An-I基因，從而：增加種子的粒長；減少每穗種子顆粒 數；減少每穗枝梗數；增加種子的芒長；和/或增加種子的有芒率。
[0137] 在得知了所述的An-I基因的用途后，可以采用本領域人員熟知的多種方法來調 節所述的An-I基因的表達。比如可通過本領域人員已知的途徑將攜帶An-I基因的表達單 位（比如表達載體或病毒等）遞送到靶點上，并使之表達活性的An-1。
[0138] 此外，可以采用本領域人員熟知的多種方法來降低An-I基因的表達或使之缺失 表達，比如將攜帶反義An-I基因的表達單位（比如表達載體或病毒等）遞送到靶點上，使 得細胞或植物組織不表達或降低表達An-I。
[0139] 作為本發明的一種實施方式，將An-I基因通過常規的方法克隆到適當的載體中， 將所述的帶有外源基因的重組載體導入到植物組織或器官中，使所述的植物表達An-I基 因。可通過將所述植物組織或器官再生成植物，獲得過量表達An-I基因的植物。
[0140] 優選的，提供了一種制備轉基因植物的方法，包括：
[0141] (1)將外源的An-I基因轉入植物器官或組織，獲得轉化入所述基因的植物組織、 器官或種子；和
[0142] (2)將步驟（1)獲得的轉入了外源An-I基因的植物組織、器官或種子再生成植物 植株。
[0143] 作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟：
[0144] (si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有An-I基因；
[0145] (s2)將植物組織、器官或種子與步驟（si)中的農桿菌接觸，使An-I基因轉入植 物，并整合到植物細胞的染色體上；
[0146] (S3)選擇出轉入An-I基因的植物組織、器官或種子；以及
[0147] (s4)將步驟（S3)中的植物組織、器官或種子再生成植物。
[0148] 其它增加 An-I基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用強 啟動子驅動從而增強An-I基因或其同源基因的表達。或者通過增強子（如水稻waxy基因 第一內含子、Actin基因第一內含子等）來增強該An-I基因的表達。適用于本發明方法的 強啟動子包括但不限于：35S啟動子，水稻、玉米的Ubi啟動子等。
[0149] 優選的，提供了一種降低植物中An-I基因表達的方法，所述的方法包括：
[0150] (1)將干擾An-I基因表達的干擾分子轉入植物組織、器官或種子，獲得轉化入所 述干擾分子的植物組織、器官或種子；和
[0151] (2)將步驟（1)獲得的轉入了所述干擾分子的植物組織、器官或種子再生成植物。
[0152] 作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟：
[0153] (i)提供攜帶可干擾基因表達的載體的農桿菌，所述的載體選自下組：
[0154] (a)含有反方向啟動的An-I基因或基因片段（反義分子）的載體；
[0155] (b)含有可在植物體內形成特異性干擾An-I基因表達（或轉錄）的成分的干擾分 子的載體；
[0156] (ii)將植物的組織或器官或種子與步驟（i)中的農桿菌接觸，從而使所述載體轉 入植物組織或器官或種子。
[0157] 較佳地，所述方法還包括：
[0158] (iii)選擇出轉入了所述載體的植物組織或器官或種子；和
[0159] (iv)將步驟（iii)中的植物組織或器官或種子再生成植物。
[0160] 其它抑制An-I基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。
[0161] 本發明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括：轉入了 An-I基 因或其同源基因的轉基因植物；或者An-I表達量（包括低表達或不表達）降低的植物等。
[0162] 可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。
[0163] 此外，本發明還涉及利用An-I基因作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。本發 明還涉及利用An-I基因作為一種分子標記，通過檢測植物中An-I基因表達情況，鑒定植物 的芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構。還可利用An-I基因相關的植物相關性狀特 性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
[0164] 在本發明的具體實施例中，利用圖位克隆的方法克隆了控制水稻芒發育的An-I 基因，利用遺傳轉化對該基因進行了驗證。對An-I基因的近等基因型系（NIL-An-I)，An-l 互補（CPL)和過表達（OX)的轉基因株系表型考察，發現An-I引起長芒表型并使粒子變長， 同時降低了每穗粒數。而RNAi的轉基因植株則引起相反的表型。進一步的實驗顯示，An-I 的表達上調降低了單株產量；An-I的表達下調則增加了單株產量。在具有野生稻An-I基 因的近等基因型系中，掃描電鏡顯示當小穗發育的SP6期，外莩頂端因為細胞持續分裂延 伸形成芒原基，芒原基中細胞進一步分裂導致芒原基繼續延伸。An-I基因的原位雜交顯示， An-I在小穗發育的SP6期，在外莩原基頂端開始強烈表達，其表達一直持續到SP8期晚期， 這種特異的表達引起芒原基的起始和延伸。An-I基因的上調表達引起細胞持續分裂，調控 組蛋白Hl和H4的表達上調，也引起粒子的變長。An-I基因也在幼穗中表達，其表達的上調 會引起一個重要的細胞分裂素調控基因 LOG的下調表達，從而引起每穗粒數的減少。比較 野生稻An-I和栽培稻an-Ι序列發現，主要差異存在于啟動子區域。本發明人還發現An-I 落在水稻受到強烈馴化選擇區域（domestication sweeps)，顯示該基因在人工馴化中成為 一個主要的選擇對象，究其根本原因可能在于An-I引起芒發育的同時降低了水稻的產量。 因此栽培稻中被固定的基因型an-Ι導致無芒性狀并同時提高產量，滿足了農業生產的需 要。
[0165] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0166] I、材料和方法
[0167] 1、實驗材料
[0168] 實驗中用于An-I定位和功能研究的水稻材料有：無芒的秈稻廣陸矮4號 (Guangluai4, GLA4)，有芒的單染色體替換系SL4、有芒的單片段替換系CSSL-Z3和有芒的 近等基因系NIL-An-I。
[0169] SL4由日本植物基因組中心提供，是以GLA4遺傳背景，第4號染色體被普通野生 稻（Oryza rufipogon)W1943所替代的單染色體替換系，在野生稻W1943與秈稻GLA4回交 BC4F2群體中由分子標記篩選得到。
[0170] CSSL-Z3是SL4與秈稻GLA4回交BC5F3由分子標記篩選得到的單片段替換系，在 分子標記IN6298-IN6265之間是W1943片段，覆蓋主效芒長位點An-I。
[0171] NIL-An-I是由CSSL-ZSXGy^BC1F3群體中篩選得到GLA4背景，包含An-I位點的 近等基因系。
[0172] 野生稻W1943獲自日本國立遺傳研究所。
[0173] Kasalath獲自日本國立遺傳研究所。
[0174] 日本晴獲自日本農業資源研究所。
[0175] 2、An-I精細定位群體的構建
[0176] 本發明人利用GLA和CSSL-Z3雜交構建了 1個精細定位群體，雜交F1代表型與 CSSL-Z3相同，自交得到F2包含10500個體的大群體，表型分離為有芒和無芒，對其進行鑒 定基因型，得到的重組子移栽到田間，考察表型。
[0177] 3、野生稻BAC的篩選和制備
[0178] 應用普通野生稻W1943的BAC文庫，保存在80塊384孔板中。通過PCR擴增，可 以逐步篩選在兩個不同分子標記中均有擴增的單個BAC。利用QIAGEN公司的BAC提取試劑 盒進行BAC DNA制備。
[0179] 4、野生稻BAC測序和基因注釋
[0180] 采用shotgun法對所挑選的野生稻BAC進行測序，用GENESCAN的軟件進行基因注 釋。
[0181] 5、An_l轉基因載體構建
[0182] (I)An-I的互補質粒（pCPL)構建
[0183] 篩選并提取包含An-I基因的野生稻W1943BAC，利用BamHI酶切回收IOkb長度片 段包含An-I基因上游6kb到下游0. 5kb的基因組序列，連接到載體pCAMBIA1301載體上， 構建An-I-CPL質粒，S卩pCPL。
[0184] (2) An-I的過表達質粒（pOX)構建
[0185] 所用的過表達載體是以PCAMBIA1300為骨架，利用玉米Ubquitin啟動子作為啟 動子，以NOS終止子為終止子，且在終止子前添加了一段90bp左右的HAtag序列，cDNA插 入可與之構成融合蛋白。該片段序列如SEQ ID N0:20(其中1-1980位為玉米UBI啟動 子，2105-2360位為NOS終止子，2000-2104為HAtag序列），插入pCAMBIA1300多克隆位點 HindIII/EcoRI 位點。
[0186] 將野生稻W1943An-10RF連接到PNCGR的UBI啟動子之后，分別構建An-1-pOX載 體，即pOX。
[0187] 其中，以野生稻W1943cDNA為模板，擴增W1943An-10RF，其上游引物為AGGCGCGCCT GGCAGGCTGTCCCGTGTCT(SEQ ID N0:6);下游引物GGGGTACCGCT GGCTCGGCCTTCATGTG(SEQ ID NO:7)〇
[0188] (3) An-I 的 RNA 干擾質粒（pRNAi)構建
[0189] 使用的RNA干擾載體是pTCK303 (獲自北京植物研究所）。將An-I基因的282bp cDNA序列（3'UTR的一部分）雙向連接到pTCK303載體上，構建An-I-RNAi載體，S卩pRNAi。
[0190] 282bp cDNA 序列如下（SEQ ID N0:5):
[0191] GGTTTTCCAAGGCTTAACTTTTTCCAGATGCAGTGTCATATTGTTTAGGCAAAGAACTTGTTTTGATGT TGTG ATGCTTGTAGGACAGAGGAGTATATGTGTAGTATGTCTGGAAATGGCAAGGCAGGGGAGCTGTGTGACCTT TGTGTGTGCTGGTTGCATGCCCTAACTGTAGAAAAAAAAAAGAGGAGGATTGTGCTAGTGATGTTAGTAGT GGTAG TGGCTTTGTAGGATTTGGCATGCATGGGGATGTATGTACTATGTATGTAGAGATTGGAGAGG
[0192] 該282bp cDNA序列正向連接入載體的BamHI/Kpnl位點，反向連接入載體的SpeI/ SacI位點。
[0193] (4) An-I 的 promoter GUS 載體構建
[0194] 所用的 promoter ⑶S 載體是 pCAMBIA1300GN:⑶S。選取 An-IATG 上游 2kb 或 6kb 片段，通過SmaI和XbaI定向克隆到pCAMBIA1300GN載體（獲自上海植物生理生態所林鴻 宣實驗室）的⑶S基因前面，構建An-Ι::⑶S載體。
[0195] 其中，以野生稻W1943基因組為模板，擴增An-IATG上游2kb或6kb片段引物分別 為：
[0196] 擴增 An-IATG 上游 6KB 片段的上游引物：TTTTGCTTACGCGTTTGTTG TGTTG(SEQ ID N0:8);下游引物 TCCCCCGGGGTGGTTGACCGTTATATAAG A AA(SEQ ID N0:9)。
[0197] 擴增 An-IATG 上游 6KB 片段的上游引物：ACGCGTCGACCAGTTGAAG AAAAAGGATCCAG(SEQ ID N0:10);下游引物TCCCCCGGGGTGGTTG ACCGTTA TATAAGAAA(SEQ ID N0:11)。
[0198] 6、農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0199] 水稻轉基因采用的方法為農桿菌介導的遺傳轉化法，所采用的農桿菌菌株為 EHA105。pCPL和pOX用于轉化日本晴，pRNAi用于轉化Kasalath。
[0200] 7、穗部性狀考察和粒型掃描
[0201] (1)親本及轉基因植株的芒種長考察
[0202] 芒長性狀的考察：在單株種子成熟后，取其主穗測量所有一次枝梗頂粒芒長取其 平均值代表整穗的芒長，每個株系取20個個體，記錄親本的芒長范圍。
[0203] 有芒率的考察：在種子成熟后，取單株的主穗，統計總粒數和有芒的粒數，有芒粒 數除以總粒數，即為有芒率。每個株系取20個個體，計算平均值。
[0204] (2)穗部性狀考察
[0205] 在水稻籽粒灌漿后期、穗子還未變黃的時候取一個單株上不同分蘗的三個穗子進 行穗部性狀考察。主要考察的性狀包括：穗長、一次枝梗長度、一次枝梗數、二次枝梗數、總 粒數、未灌漿癟粒數、有芒粒數和頂粒芒長。不同材料取20單株，每株3個主分蘗上的穗子， 計算各性狀的平均值。
[0206] (3)粒型掃描
[0207] 種子的飽滿度會影響粒長、粒寬，在種子完全成熟后，單株收種用于粒型考察。每 個單株隨機取100粒左右的種子，去芒后使用MICROTEK ScanMaker i800掃描儀進行粒型 掃描。得到的掃描圖像使用"種子大米外觀品質檢測軟件"計算每個種子的長度和寬度，計 算平均值。
[0208] 8、掃描電鏡觀察
[0209] (1)掃描電鏡觀察幼穗。
[0210] ⑵掃描電鏡觀察種子表皮。
[0211] 9、實時定量PCR
[0212] 新鮮植物組織或者_8(TC凍存的組織用Trizol Reagent提取。總RNA樣品中的 DNA經過DNA 酶消化后，用 Invitrogen 的 SuperScript?II Reverse Transcriptase 進行反 轉錄為cDNA第一鏈，進一步為實時定量PCR的模版。定量PCR采用Takara公司的SYBR:'_'3 Premix Ex TaqTM試劑盒，在Applied Biosystems7500real time PCR儀上進行。根據基因 序列設計特異基因引物，選擇水稻基因 eEF-Ια (GenBank accession no. AK061464)作為內 參。
[0213] KKAn-I的亞細胞定位
[0214] (I)An-I的GFP融合蛋白構建
[0215] 使用的GFP融合蛋白載體是PA7-GFP載體（獲自上海交通大學楊洪全實驗室）。 使用加酶切接頭的PCR正反向引物（正向CCGCTCGAGATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:12); 反向 GGACTAGTACTGGCTCGGCCT TCATGTGGTT(SEQ ID N0:13))擴增 An-IcDNA片段，雙酶切連 接到PA7載體的GFP蛋白編碼序列前面，構建GFP融合蛋白載體。
[0216] (2)基因槍電擊轉化洋蔥表皮細胞及GFP信號觀察。
[0217] 11、An-I酵母單雜交驗證轉錄激活活性
[0218] (I)An-I酵母單雜交誘餌載體的構建
[0219] 使用Clontech公司的酵母單雜交系統驗證An-I的轉錄激活活性，用pGBKT7載體 (Clontech)構建酵母單雜交誘館載體。
[0220] 根據An-I的cDNA序列設計引物，分別擴增An-I全長ORF序列、An-I的N-端蛋白 (N端第1-82位）編碼序列和C-端蛋白（C端第82-263位）編碼序列，在保證不移碼的情 況下連接到載體PGBKT7上，接到GAL4binding domain后面，構建成酵母單雜交誘館載體。
[0221] 擴增 An-I 全長 ORF 序列正向引物 CCGGAATTCATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:14); 反向引物 CGGGATCCTTATGGC TCGGCCTTCATGTGGT(SEQ ID N0:15)。
[0222] 擴增An-I的N-端蛋白（N端第1-82位）編碼序列正向引物 CCGGAATTCATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:16);反向引物 CGGGATCCTCACGCCCTC ACATGGATGTAGTCTTT(SEQ ID N0:17)。
[0223] 擴增An-I的C-端蛋白（C端第82-263位）編碼序列正向引物 CCGGAATTCAGGCGGGGGCAAGCCA(SEQ ID N0:18);反向引物 CGGGATCCTCACATGGCT CGGCCTTCATGTGGTT(SEQ ID N0:19)。
[0224] 12、石蠟切片及原位雜交
[0225] 用于組織學觀察和原位雜交的材料用4%多聚甲醛固定，系列乙醇脫水，二甲苯透 明并包埋在石蠟中。原位雜交的探針用羅氏公司的地高辛標記試劑盒進行標記。標記好的 原位正義反義探針在8-um的石蠟切片上進行雜交。
[0226] II、實施例
[0227] 實施例1、野生稻第4號染色體芒長QTL定位和芒長基因 An-I的精細定位及驗證
[0228] GLA4是栽培稻秈稻品種，全部粒子無芒。SL4具有長芒，幾乎全部粒子有芒。 CSSL-Z3具有穩定較長芒，大部分籽粒有芒，有芒率超過80%。NIL-An-I具有穩定較長芒，大 部分籽粒有芒，有芒率超過60% (圖IA和1B)。
[0229] 本發明人利用SL4XGLA4F2群體，共255個個體，在野生稻第4號染色體上定位了 兩個芒長QTL位點，分別命名為An-I和An-2 (圖1C)。An-I和An-2都是野生稻W1943基 因型對芒為正效應，促進芒的生長。An-I初定位在分子標記M6298和M6285之間，對于芒長 的貢獻率為52. 5% ;An-2初定位在分子標記Ml 108和Ml 160之間，對于芒長的貢獻率為12%。
[0230] CSSL-Z3是SL4與GLA4回交的BC5F3群體中，經過分子標記檢測得到的染色體單 片段替換系。CSSL-Z3是在分子標記M6298-M6265之間為W1943基因型，其余背景為GLA4 的單片段替換系。本發明人利用包含An-I位點的CSSL-Z3和GLA4構建的定位群體，對芒 長基因 An-I進行精細定位。CSSL-Z3與GLA4雜交F1代的表型與CSSL-Z3相同，具長芒，說 明An-I為顯性基因，自交匕代的表型出現長芒和無芒分離，分離比符合3:1，說明An-I為 單基因控制。本發明人利用CSSL-Z3XGLA4F 2精細定位群體（包含10500個體），使用分 子標記FM1-9鑒定基因型，最終將An-I定位到分子標記FM3和FM6之間，根據日本晴基因 組序列（IRGSP V4. 0)計算物理距離為70kb (圖1D)。本發明人利用FM3和FM6篩選野生 稻W9143BAC庫，得到相應于該區域的0RW1943Ba0047B01，并進行了測序和基因注釋。由于 日本晴與GLA4在該區域具有很高的同源性，沒有其它基因插入。因此本發明人直接比較了 FM3和FM6區域內日本晴和W1943之間序列，發現在這一區域存在很多插入和缺失片段（圖 1E)，這種互相的插入和缺失造成GLA4與W1943在這一區域進一步重組較為困難，因此無法 進一步縮小定位范圍。
[0231] 比較FM3和FM6區間內W1943與日本晴基因的預測情況，篩選得到2個候選基因， 一個是與細胞分裂、分化相關的bHLH基因（0s04g0350700)，另外一個是與線粒體功能相關 的RFl基因（0s04g0350133)。本發明人對這兩個候選基因分別構建了互補質粒轉化日本 晴。包含RFl基因區及其上游啟動子區的IOkb互補質粒轉化日本晴得到的轉基因植株沒 有長芒，不能進行功能互補，因此排除了 RFl作為候選基因的可能性。
[0232] 選取候選野生稻W1943基因 bHLH的上游6kb啟動子區加上整個基因區，約IOkb 的互補片段連接到PCAMBIA1301構建pCPL質粒（圖1F)。同時構建了過表達質粒，以野生 稻W1943的cDNA為模板，將0. 8kb的ORF連接到PNCGR載體的玉米UBI啟動子后面構建過 pOX質粒（圖1F)。將pCPL和pOX質粒分別轉化日本晴，Ttl代80%CPL轉基因植株和90%0X 轉基因植株表現出明顯的長芒表型，有芒率超過50%。
[0233] 同時構建An-I的RNA干擾質粒，以野生稻W1943的cDNA為模板擴增282bp片段 并將其正反向連接到PTCK303載體上（圖1F)。pRNAi質粒轉化有芒的秈稻品種Kasalath， Ttl代50%RNAi植株出現芒變短變少。
[0234] 上述結果證明，0s04g0350700的確是An-I基因，具有控制芒發育的功能。
[0235] 實施例2、野生稻與栽培稻An-I等位基因序列比較及共同變異的篩選
[0236] 結構域分析結果顯示，An-I是一個含有堿性螺旋-環-螺旋（bHLH)保守結構域的 基因。本發明人利用5'RACE和3'RACE技術擴增了 An-I的全長cDNA序列。在W1943中， 該基因全長cDNA序列為1978bp(F0681395)(SEQ ID N0:1)，編碼262氨基酸的蛋白（SEQ ID N0:2)。在GLA4中該基因全長cDNA為 1979bp(F0681475)(SEQIDN0:3)，編碼 263 氨基酸 的蛋白（SEQ ID N0:4)。兩者差異在于，GLA4中在Ist外顯子有一個CCG的插入導致多了一 個丙氨酸，在2 nd外顯子中存在一個SNP將甘氨酸變為丙氨酸，兩處差異均在bHLH保守結構 域外面。最后在3' UTR區存在2個堿基的缺失和1個堿基替換（圖11和圖12)。
[0237] 本發明人利用酵母單雜交系統驗證了 An-I蛋白具有轉錄激活活性（圖2A)。通過 激光共聚焦顯微鏡觀測An-I-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞內的核定位（圖2B和2C)。因 此證明了 An-I基因編碼是一個具有轉錄激活活性的bHLH蛋白。
[0238] 本發明人對W1943、GLA4和日本晴的An-I基因序列比較。測序結果顯示日本晴和 GLA4之間，除了啟動子區有兩個SNP外，其余序列完全一致。而W1943和GLA4比較顯示， 在基因區的差異與上述cDNA差異一致；在啟動子區則差異較大，包括一些插入缺失和多個 SNP，包括日本晴和GLA4中在An-I轉錄起始位點上游40bp左右有一個4. 4kb的轉座子插 入。
[0239] 本發明人測定了 43個栽培稻品種（22個秈稻，21個粳稻）和27個野生稻品系的 An-I基因（包括4. 5kb啟動子區域和3. 5kb基因區）以比較其序列差異。通過序列比較， 發現栽培稻和野生稻之間存在共同變異，包括12個SNP，4個Ibp的缺失插入，和1個4. 4kb 的轉座子缺失插入。根據這些共同變異，本發明人把栽培稻和野生稻分為兩個單倍型即栽 培稻的an-Ι型和野生稻的An-I型（圖3)。進一步根據轉座子的有無和2 nd外顯子Ibp缺 失插入的有無，可將栽培稻的單倍型進一步分為兩個亞型，an-l(Tn+)和an-l(G-)(圖3A 和3B)。大多數的無芒粳稻具有日本晴和GLA4的an-l(Tn+)單倍型（圖3A)，而大多數的 無芒秈稻具有an-1 (G-)單倍型（圖3B)。
[0240] 在大多數的無芒秈稻中，例如HP228,2nd外顯子Ibp的缺失導致該基因編碼框移位 (framshift)，產生一個新的終止位點，導致該基因編碼一個97氨基酸的截短蛋白，并導致 該基因在秈稻中功能喪失。
[0241] 但是在野生稻中，An-I基因存在較大的變異。其中約30%的品系具有秈稻 an-1 (G-)單倍型，其它品系基因型均包括上述W1943單倍型中的共同變異，可能這些共同 變異直接影響了野生稻和栽培稻的芒表型差異（表4)。
[0242] 實施例3、An-I促進芒的發育
[0243] 為了研究An-I的功能，本發明人篩選了一個近等基因系，NIL-An-1。NIL-An-I 是從CSSL-ZSXGy^BC1F3群體中篩選得到，以GLA4為背景，包含野生稻120K片段（包括 An-I位點在內）。自交得到的An-I近等基因系，其芒長為14. 68±2. 45mm，而有芒率為 52. 81±12· 8% (圖 4A 和 4D)。
[0244] 考慮到轉基因植株中的拷貝數對表型的影響，本發明人利用潮霉素抗性篩選法 鑒定出單拷貝插入T 2代純合植株進行表型分析和其它分析，其中包括互補的CPL-1、2， RNAi-l、2、5、6株系。而過表達OX則選擇Ttl代表OX-I和0X-5株型進行分析。
[0245] 在轉基因互補株系中，CPL-I和CPL-2的芒長分別是3L 84±6. 36mm和 31. 90±6. 98mm，而有芒率分別為54. 48± 14. 41%和53. 21 ±15. 14%。在過表達株系中，OX-I 和0X-5芒長分別是33. 82±5. 81mm和34. 04±6· 99mm，而有芒率分別為63. 41±14· 19%和 65. 74 ± 16. 82%。其對照日本晴（Nipponbare)基本無芒（圖4B和4E)。
[0246] 對于 RNAi 株系，與 Kasalath(芒長 23. 30±3. 05mm，有芒率 56. 32±4. 11%)相 t匕，芒長下降，其長度到從〇.82±l. 29mm到9. 14± 1.87mm，而有芒率也同時下降分別為從 4. 25 ±3. 44% 到 23. 84 ±9. 49% (圖 4C 和 4F)。
[0247] 因此An-I不僅控制了芒長而且控制了有芒率。
[0248] 實施例4、An-I促進水稻粒子變長
[0249] 本發明人在穗部性狀考察的過程中，發現與GLA4相比，NIL-An-I除了芒長發生變 化之外，還出現了粒型、穗粒數等性狀的變化。每穗粒數、粒型大小都是與水稻產量密切相 關的重要農藝性狀，因此本發明人進行了詳細考察。
[0250] 種子的飽滿度會影響粒型，在種子完全成熟后，每個材料單株收種，去掉灌漿不飽 滿的種子后，隨機取100粒左右的種子去芒后放到掃描儀上進行粒型掃描，得到的掃描圖 像使用專用軟件計算每粒種子的長度和寬度。
[0251] 首先對GLA4和NIL-An-I的粒長進行統計比較，發現NIL-An-I粒子比GLA4粒子 長3. 19% (圖5A和OT)。CPLl和CPL2的粒子分別比日本晴長13. 90%和11. 97% ;而OX-I和 0X-5的粒子分別比日本晴長19. 99%和16. 74% (圖5B和5E)。RNAi的粒子卻比Kasalath 短一些，RNAi不同株系粒子分別比Kasalath粒子短3. 30%-9. 60% (圖5C和5F)。
[0252] 實施例5、An-I調控每穗粒數和單株產量
[0253] 除了影響芒長和粒長，An-I基因還影響每穗粒數。在NIL-An-I中每穗粒數比GLA4 少10. 58%左右（圖6A和6C)。
[0254] 本發明人考察An-I-RNAi的每穗粒數，發現與Kasalath相比，RNAi植株的每穗粒 數增加 13. 60%-38· 4% (圖 6B 和 6D)。
[0255] 互補和過表達轉基因植株的情況與NIL-An-I相似。日本晴通常產生9. 67± 1.57 一次枝梗，19. 76±3. 95二次枝梗和111. 56±19. 29每穗粒子。在CPL和OX轉基因植株中， 一次枝梗和二次枝梗數目均減少，CPL和OX轉基因植株中一次枝梗數一般為7-8個，二次枝 梗數平均值也在7-8左右。CPL-I和CPL-2每穗粒數分別為63. 61 ±9. 17和68. 47± 12. 19， 與日本晴相比分別下降42. 08%和38. 62%。而OX-I和0X-5每穗粒數分別為51. 79±9. 57 和55. 82 ±14. 34,與日本晴相比分別下降54. 58%和49. 96% (圖6E和6F)。本發明人同時 發現與日本晴相比，CPL和OX的轉基因植株未灌漿癟粒增加。
[0256] 本發明人進一步對CPL和日本晴的單株產量進行了比較分析。結果顯示，與日本 晴相比，CPL-I和CPL-2單株產量分別下降34. 83%和30. 80% (圖6G)。
[0257] 這些表型數據都證明，An-I除了控制水稻芒的生長之外，還影響水稻的穗粒數和 粒長。野生稻W1943的An-I基因使一次枝梗數和二次枝梗數明顯減少，從而減少穗粒數及 單株產量。
[0258] 實施例6、NIL-An-I和轉基因植株中An-I表達水平變化
[0259] 本發明人取穗長小于4cm的幼穗提取總RNA，反轉錄為cDNA第一鏈，以此為模板 進行定量PCR分析。分析結果顯示，An-I基因在NIL-An-I的表達水平是GLA4的二倍左右 (圖7A)。與日本晴相比，在轉基因互補CPL-I和CPL-2植株中An-I基因的表達水平上調 了 40-45倍（圖7B)。考慮到CPL-I和CPL-2都只包含一個拷貝的外源轉基因，因此表達量 上調主要是外源基因在這個遺傳背景中的緣故。而在RNAi植株中，與對照kasalath相比， An-I基因表達下調，下調程度與表型程度一致（圖7C)。表達水平變化與表型結合起來顯 示，An-I基因表達水平與芒長和粒長正相關，而與每穗粒數則呈現負相關。
[0260] 以前的研究顯示，LOG和Gnla這兩個基因直接影響細胞分裂素的濃度并控制水稻 的穗粒數。LOG基因編碼一個酶，催化無活性的細胞分裂素變成有活性的細胞分裂素；而 GnIa編碼細胞分裂素氧化酶2 (0sCKX2)，降解細胞分裂素。由于CPL植株中每穗粒數下降嚴 重，本發明人檢測了 CPL和日本晴中的LOG和0sCKX2的表達水平。發現在小于Icm的幼穗 中，CPL-I和CPL-2中LOG基因的表達水平下降到只有日本晴中的一半（圖7D);而0sCKX2 表達在CPL和日本晴之間則沒有明顯變化。
[0261] 實施例7、An-I基因引導細胞分裂和芒的發育
[0262] 水稻的花由四輪組成：最外一輪包括外稃和內稃，第二輪由兩個漿片組成，第三輪 由六個雄蕊組成，最內輪是雌蕊。根據Ikeda等對水稻小穗發育時期的劃分，小穗發育分為 8個時期：Spl期護穎原基形成；Sp2期護穎原基形成；Sp3期外稃原基形成；Sp4期內稃原基 形成；Sp5期楽片原基形成；Sp6期雄蕊原基形成；Sp7期心皮原基形成；Sp8期胚珠和花粉 形成。穗長4cm之后進入花器官成熟期，即InS期。
[0263] 掃描電鏡觀察顯示，Sp4期內稃原基形成（圖8A1和8B1)，直到Sp6期雄蕊原基 形成，GLA4和NIL-An-I的小穗原基在形態上基本沒有差異（圖8A2和8B2)。當心皮原基 起始的Sp7期出現變化，NIL-An-I的外稃頂端向往延伸形成芒原基（圖8B3)，而GLA4中 的外稃頂端沒有明顯伸長（圖8A3)。到SpS早期，內外稃開始閉合、胚珠原基形成的時候， 可以看到GLA4的外稃頂端仍然沒有伸長，形成一個圓形的結構（圖8A4)而NIL-An-I的芒 原基繼續伸長（圖8B4)。在大于4cm的穗中，開始進入小花器官成熟期，即SpS晚期，此時 NIL-An-I的芒已經很長（圖8B5)，GLA4的外稃尖端終止為稃尖（圖8A5)。
[0264] 為了探究An-I在芒發育中的功能，本發明人采用RNA原位雜交技術來檢測An-I 在小穗不同發育時期的表達情況。在小穗發育中，An-I在護穎和副護穎原基、內外稃原基 (圖8C1和8D1)、雄蕊原基（圖8C2和8D2)及隨后的心皮原基（圖8C3和8D3)都有表達。 An-I在小穗發育早期，GLA4和NIL-An-I中的表達沒有太大差異。差異從Sp6期開始，An-I 的表達在NIL-An-I的外稃頂端開始加強（圖8D2)，隨后在芒原基強烈表達（圖8D3)，這種 強烈表達持續到SP8早期（圖8D4)，接著在Sp8后期逐漸減弱（圖8D5)。在GLA4中An-I 的表達一直較弱且比較均勻（圖8C2-C3)，但是在外稃頂端卻沒有表達（圖8C4)，在SpS后 期，An-I的表達在內外稃中幾乎消失，主要在花藥和心皮處有較明顯的信號（圖8C5)。
[0265] 組織切片觀察比較顯示，在Sp8晚期的小穗中，NIL-An-I芒原基細胞數目是GLA4 小穗稃尖細胞數目的三倍多（圖8E1和8F1)，因此可以認為芒的發育與細胞分裂直接相關。
[0266] Histone Hl和H4在細胞周期Gl期-S期表達，它們的表達通常被用作細胞分裂的 標記物。Histone H4的原位雜交分析表明，在Sp6期之前,Histone H4在GLA4和NIL-An-I 的所有花器官原基內均有表達，沒有明顯差異（圖8E2和8F2)。在Sp7期，NIL-An-I外稃 原基頂端開始向外突出，Histone H4在內外稃、雄蕊原基和芒原基上都有很高的表達；而 GLA4中在小穗外稃原基的表達量比NIL-An-I中低（圖8E3和8F3)。在Sp8早期，Histone H4在GLA4小穗的雄蕊原基中表達較強，內外稃原基的表達開始減弱；而在NIL-An-I小花 的雄蕊、內外稃和芒原基上仍有很強的表達（圖8E4和8F4)。在Sp8后期，Histone H4在 在GLA4和NIL-An-I內外稃中表達量都很低，基本上只在雄蕊和心皮中還有表達（圖8E5 和 8F5)。
[0267] 以上結果說明，在NIL-An-I中，An-I在外稃尖端特異表達，引起外稃尖端細胞持 續分裂，細胞數目增多，進一步引導芒原基的起始和延伸。因此An-I的高表達是芒原基中 細胞持續分裂的基礎。而栽培稻GLA4中，an-Ι的基因型將An-I的表達從外稃尖端排除， 從而導致外稃尖端細胞失去分裂能力，產生無芒表型。
[0268] 實施例8、An-I調控細胞分裂從而影響粒子長度
[0269] 水稻種子由穎殼包裹，分為內稃和外稃，穎殼的大小是影響粒型的一個重要因素。 硅質化細胞組成穎殼的表皮，呈方格狀有尖銳突起，具有堅硬的表皮毛，在種子表明規則排 布，起到保護支持作用。
[0270] 與粒型相關的基因通常會通過調控穎殼的細胞數量或者細胞大小來影響種子的 大小，比如qSW5基因功能的缺失使表層硅質化細胞的數量增加，PGL2基因過表達使穎殼細 胞長度增加，造成粒型變長。本發明人進一步研究An-I是否通過控制穎殼細胞的數量變化 來影響粒長的。本發明人取An-I轉基因植株和其轉化親本的成熟種子，包括CPL-I和日本 晴，RNAi-6和Kasalath，使用掃描電鏡的方法觀察種子表面，考察統計硅質化細胞數目變 化。統計種子外稃靠近內外稃分界線第10-11行硅質化細胞數目，因在其靠近稃尖處，外稃 上的一條維管束在其終點形成一個容易識別的突起，統一選取這個突起作為統計界限（圖 9A)。
[0271] 首先，比較了 RNAi-6和Kasalath種子表皮硅質化細胞，發現細胞的大小沒有明顯 變化（圖9B和9C)。而細胞計數的結果顯示在RNAi-6種子表皮細胞數目比Kasalath減少 9. 68%(圖9D)。定量PCR顯示，與Ksalath相比，RNAi-6小于4cm幼穗中Histone Hl的表 達水平下降50%左右（圖9E)。
[0272] 接著，比較了 CPL-I和日本晴種子表皮硅質化細胞，發現它們的細胞大小同樣沒 有明顯變化（圖9F和9G)。細胞計數的結果顯示CPL-I種子表皮細胞數目比日本晴增加 14. 16%(圖9H)。定量PCR顯示，與日本晴相比，CPL-I小于4cm幼穗中Histone Hl的表達 量上調2倍還多（圖91)。原位雜交顯示在Sp8晚期的小穗中，Histone H4仍在CPL-I持 續表達（圖9K)而在日本晴中幾乎沒有表達（圖9J)。
[0273] 所以，當An-I上調表達時（在CPL-I植株中）由于細胞分裂持續進行引起種子外 稃硅質化細胞數目顯著變多，導致粒子變長。而當An-I下調表達時（在RNAi植株中）細 胞分裂減少引起種子外稃硅質化細胞數目明顯減少，導致種子變短。
[0274] 實施例9、An-I在花序中的表達與每穗粒數的關系
[0275] Ikeda等人將水稻花序發育分為9個時期。在花序發育的早期，An-I在GLA4、 NIL-An-I和CPL-I中的表達模式沒有明顯區別。在In-I期萼片原基形成，頂端分生組織轉 變為花序軸分生組織。An-I在GLA4和NIL-An-I的花序軸分生組織表層微弱表達（圖IOA 和10E);而在CPL-I中，An-I不僅表達量上升而且其表達由表層擴展到髓部及原維管束組 織中（圖101)。在In2-In3期，An-I開始在GLA4和NIL-An-I的一次枝梗原基中表達，表 達量中等（圖IOB和10F)而在CPL-I中則強烈表達（圖10J)。在In5期當二次枝梗起始 時，An-I在GLA4、NIL-An-1和CPL-I的二次枝梗原基中表達（圖10CU0G和10H)。從In-6 期小穗原基開始起始，An-I的表達轉移到GLA4、NIL-An-1和CPL-I的小穗原基中表達（圖 10D、IOH和10L)。在所有發育時期，An-I的表達在NIL-An-I中比GLA4略高，而在CPL-I表 達最強烈，原位表達結果與實時定量PCR結果非常吻合。
[0276] 本發明人進一步比較OSHl和An-I基因在NIL-An-I的表達模式。在Inl-In5期， OSHl基因強烈地表達在花序軸分生組織、一次枝梗原基和二次枝梗原基中（圖10M-100)， 而An-I基因也在這些組織中微弱表達。它們的表達差異出現在In6期，OSHl只表達在小 穗分生組織中而An-I則開始在花器官原基中表達（圖IOD和10P)。盡管兩個基因在花序 發育早期有共同的表達模式，但是NIL-An-I的穗部表型和轉基因植株表型說明，An-I在維 持分生組織屬性方面的作用與OSHl相反。
[0277] 綜上所述，An-I的表達模式和表達量的同時變化引起了 NIL-An-I和轉基因植株 中穗部表型的變化。
[0278] 總結
[0279] 本發明人克隆了野生稻An-1，該基因具有多效性，同時控制水稻芒發育、粒長和每 穗粒數。當該基因引入無芒栽培稻會導致長芒表型并增加粒長，但同時引起每穗粒數減少 和單株產量下降。An-I的表達量和表達模式對這些表型的出現非常重要。An-I基因上調 表達會維持細胞分裂，增加細胞數目，從而誘導芒的發育和粒長增加，因此An-I是個細胞 周期調控因子。An-I基因在花序軸分生組織、一次枝梗和二次枝梗原基中上調表達，會同 時下調細胞分裂素調控因子LOG的表達，從而導致每穗粒數的減少和單株產量的下降。因 此An-I是一個重要的人工選擇基因，受到強烈的選擇壓力。而在栽培稻中兩種單倍型，粳 稻an-l(Tn+)降低了其表達水平并改變了表達模式，秈稻an-l(G-)喪失了基因功能，這樣 的變化導致芒的喪失和每穗粒數的增加，從而導致產量的增加，達到馴化的目的。
[0280] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【權利要求】
1. 一種調控禾谷類作物農藝性狀和/或產量性狀的方法，其特征在于，所述方法包括： 調節禾谷類作物中An-ι基因的表達。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禾谷類作物是禾本科植物；較佳地， 所述的禾本科植物是水稻，大麥、小麥、燕麥、黑麥；和/或 所述的農藝性狀包括：芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的An-Ι基因編碼： (a) 如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4氨基酸序列的多肽； (b) 將SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽；或 (c) 與（a)限定的多肽序列有80%以上同源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多 肽。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低禾谷類作物中An-Ι的 表達；從而： 增加產量； 降低粒長； 增加每穗種子顆粒數； 增加每穗枝梗數； 縮短種子的芒長；和/或 減少種子的有芒率。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述降低禾谷類作物中An-Ι基因的表達包 括： 將下調An-Ι基因轉錄、蛋白表達或蛋白活性的下調劑轉入禾谷類作物中；較佳地，所 述的下調劑是特異性干擾An-Ι基因轉錄的干擾分子。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的干擾分子是以An-Ι基因或其轉錄本 為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，或能表達或形成所述dsRNA、 反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構建物；較佳地，所述的干擾分子是以SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3作為沉默靶標的dsRNA或構建物。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：提高禾谷類作物中An-1基 因的表達，從而： 增加種子的粒長； 減少每穗種子顆粒數； 減少每穗枝梗數； 增加種子的芒長；和/或 增加種子的有芒率。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，包括：將An-Ι基因轉入禾谷類作物，獲得轉 化的禾谷類作物。
9. 一種An-Ι基因的用途，用于調控禾谷類作物農藝性狀或產量性狀；所述的農藝性狀 包括：芒性狀、種子形態、種子數量性狀、穗型結構。
10. -種An-Ι基因的用途，用于作為鑒定禾谷類作物農藝性狀或產量性狀的分子標 記；所述的農藝性狀包括：芒性狀、種子形態或飽滿度性狀、種子數量性狀、穗型結構。
11. 一種降低An-ι基因表達的物質，其特征在于，所述物質含有式（I)所示的結構： Seq正向_x_Seq反向 式（I)， 式（I)中，Seq^^jSSEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq^^為與互補的多核苷酸； 和 X為位于Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqtt和Seq &@不互 補。
12. -種降低An-Ι基因表達的物質的用途，用于調控植物農藝性狀或產量性狀；包 括： 增加產量； 降低粒長； 增加每穗種子顆粒數； 增加每穗枝梗數； 縮短種子的芒長；和/或 減少種子的有芒率。
【文檔編號】C12N15/82GK104278051SQ201310287408
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月9日 優先權日:2013年7月9日
【發明者】韓斌, 劉惠, 羅江虹, 周桃英, 顧本國, 朱靜潔, 上官穎穎 申請人:中國科學院上海生命科學研究院