重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應用的制作方法

重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，將來源于HSV-1VP22的蛋白轉導域通過SOE-PCR方法與形成PCV2空衣殼蛋白所需的抗原Cap基因連接起來，克隆到桿狀病毒轉運載體獲得同源重組載體，包裝產生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞，表達融合了PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組Cap-VP22蛋白，形成病毒樣粒子（VLPs）。研究表明，本發明的VLPs單獨或者輔以佐劑接種動物，可有效刺激PCV2特異性抗體產生。因此，應用本發明可研制具有良好免疫效果的新型高效PCV2亞單位疫苗。
【專利說明】重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于豬圓環病毒2型【技術領域】，尤其涉及一種重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)是作為一種豬腎細胞系PK-15培養污染物而被發現的，其基因組為共價閉合的單股環狀DNA分子，基因組全長約1.7kb。PCV是迄今為止人們發現的最小動物病毒，病毒粒子表面無囊膜，呈二十面體對稱，粒子直徑在17-20nm之間。根據PCV的致病性、血清型和基因型特點，將其分為非致病性的PCVl和致病性的PCV2兩種類型。其中，PCV2是引起豬圓環病毒病(PCVD)的主要病原。PCV2基因組全長為1767bp或1768bp，由11個開放閱讀框(ORF)組成，ORFs之間差異懸殊，并且大部分ORFs都有部分重疊，ORFl和0RF2是PCV2最大的編碼基因，ORFl編碼與病毒基因組復制相關的R印蛋白，而0RF2編碼病毒的主要結構蛋白Cap。Cap蛋白是組成病毒衣殼的唯一結構蛋白和主要的抗原表位聚集區，其氨基末端有序列高度保守的精氨酸富集區，與病毒DNA的結合密切相關，Cap蛋白是公認的PVC2的主要保護性抗原。
[0003]眾所周知，疫苗是防控傳染病的最有效手段。2006年，法國梅里亞公司率先研制出經歐盟認證的首例PCV2全病毒滅活苗；在國內，劉長明等成功研制出我國首例PCV2滅活苗(LG株)，此外姜平等研制的PCV2疫苗(SH株)也已注冊上市，這兩種疫苗的成功研制和應用一定程度上防控了我國PCV2的流行。但是，由于滅活苗具有免疫持續時間短，免疫注射副作用大，不能刺激機體產生細胞免疫等缺點，使得其免疫效果不盡人意。弱毒苗通常能誘導機體產生堅實的免疫力和持 久保護力，但是弱毒苗毒力易反強、致弱毒力評價難，安全性存在隱患，因此國內外對PCV2弱毒苗的研究鮮有報道。DNA疫苗有制備簡單、免疫效果好等諸多優點，但由于缺少高效的基因輸送系統，外源基因在體內的表達調控及其在體細胞間的轉移，可能會產生意外的免疫病理反應等瓶頸問題難以突破使得大部分DNA疫苗的研究僅局限于實驗室。其它一些重組病毒疫苗、亞單位疫苗對PCV2有一定的保護效果，但都由于安全性低，免疫效果差等種種原因還處于研發階段。因此，克服目前PCV2活苗、滅活苗以及基因工程疫苗缺點，尋找新的技術策略，研發一種安全、高效非復制的病毒疫苗是有效免疫防控PCV2的重要科學前提。
[0004]病毒樣粒子(Virus-like particles, VLPs),是由病毒主要衣殼蛋白或包膜蛋白自主包裝形成的衣殼結構，不含有遺傳物質，其形態、大小、結構及表面抗原和多肽表位與天然病毒粒子非常相似，因而能夠被宿主抗原提呈細胞所識別，能有效刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答，具有良好的免疫原性，并且無潛在的毒副作用。目前，國外已有部分VLPs疫苗上市，如乙肝VLPs疫苗、乳頭瘤VLPs疫苗、流感VLPs疫苗等，此外還有戊型肝炎VLPs疫苗等多個品種在臨床研究中，顯示出該類疫苗的巨大潛力。研究證實，PCV2的Cap蛋白在體外表達過程中具有自我組裝成病毒樣粒子的特點，近年來，先后有利用大腸桿菌表達系統、酵母表達系統和昆蟲/桿狀病毒表達系統在體外制備出Cap蛋白的VLPs,在小鼠和豬體內免疫實驗中，這些病毒樣粒子都表現出良好的免疫原性。來源于HSV-1VP22轉錄因子的轉導域具有強大的蛋白轉導功能，能將與其偶聯的外源蛋白帶入細胞并通過MHC-1類分子介導的抗原提呈，激發抗原特異性CTL效應。VP22轉導域的功能已廣泛應用于DNA疫苗及腫瘤疫苗的研究中。

【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其制備方法和應用。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:Cap_VP22融合基因，該基因由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉導域核苷酸序列形成。
[0007]上述Cap-VP22融合基因，具有序列表SEQ.1D.N0.1的喊基序列。
[0008]上述Cap_VP22融合基因在制備預防豬圓環病毒病(PCVD)的疫苗(PCV2疫苗)中的應用。
[0009]重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，該病毒樣粒子由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉導域核苷酸序列形成的Cap-VP22融合基因所編碼。
[0010]上述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，具有序列表SEQ.1D.N0.2的氨基酸序列。
[0011]上述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子的制備方法，將來源于HSV-1VP22的蛋白轉導域通過SOE-PCR方法與形成PCV2空衣殼蛋白所需的抗原Cap基因連接起來，克隆到桿狀病毒轉運載體獲得同源重組載體，包裝產生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞，表達融合了 PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組Cap-VP22蛋白，形成病毒樣粒子(VLPs )。
[0012]上述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)克隆目的基因Cap_VP22，并通過BamHI/Notl和Nhel/Kpnl雙酶切位點分別在
[0014]pFastBac Dual轉移載體PlO和Ph啟動子之后各插入一個拷貝的目的基因Cap-VP22，獲得含雙拷貝目的基因的重組桿狀病毒轉移載體pFastBac Dual_2Cap-VP22 ；
[0015](2)用步驟(1)獲得的pFastB Dual_2Cap-VP22轉移載體轉化DHlOBac感受態細胞，進行同源重組；
[0016](3)篩選鑒定獲得攜帶有目的基因Cap_VP22的重組桿狀病毒DNA ；
[0017](4)用步驟(3)獲得的重組桿狀病毒DNA以脂質體法轉染對數生長期的Sf9細胞，產生表達融合基因Cap-VP22的重組桿狀病毒；
[0018](5)用步驟(4)獲得的重組桿狀病毒感染對數生長期的Sf9細胞，使感染細胞表達Cap-VP22 基因；
[0019](6)收集步驟(5)獲得的感染細胞培養液并裂解感染有Cap_VP22基因重組桿狀病毒的宿主細胞，純化獲得重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子(Cap-VP22VLPs)。
[0020]上述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子在制備預防豬圓環病毒病(PCVD)的疫苗(PCV2疫苗)中的應用。
[0021]針對目前缺乏安全高效防控豬圓環病毒病的疫苗(PCV2疫苗)的問題，發明人首次提出了用桿狀病毒表達系統表達融合PCV2Cap與VP22融合基因，設計并制備了一種重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，包括利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中大量表達C端融合具有細胞穿膜功能的VP22蛋白轉導域的PCV2重組Cap蛋白，體外組裝形成嵌合病毒樣粒子。具體操作是首先對PCV2Cap全基因序列進行擴增，再用SOE-PCR的方法在Cap的C端引入VP22蛋白轉導域，構建包含目的基因Cap、VP22的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒感染Sf9細胞獲得相應的PCV2病毒樣粒子。研究表明，該重組融合蛋白基因具有高度組裝成病毒樣粒子的能力；融合表達PCV2Cap蛋白和VP22蛋白轉導域的重組桿狀病毒能夠對目的蛋白Cap-VP22進行有效表達，并且表達的目的蛋白免疫原性好，并形成病毒樣粒子；表達的重組蛋白(即病毒樣粒子，VLPs)能誘導針對PCV2的特異抗體，與單純的Cap蛋白相比，具有增強免疫的效果；形成的VLPs可以單獨或者輔以佐劑接種動物，可有效刺激PCV2特異性抗體產生。因此，應用本發明可研制具有良好免疫效果的新型高效PCV2亞單位疫苗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是Cap、VP22、Cap-VP22基因克隆電泳圖。
[0023]圖2是pEASY-Cap-VP22克隆載體鑒定電泳圖，圖中Ml:DNA Marker III，I和2:pEASY-Cap PCR 鑒定，3 和 4:pEASY-Cap 酶切鑒定，5 和 6:pEASY-Cap-VP22PCR 鑒定，7 和 8:pEASY-Cap-VP22 酶切鑒定，M2:lkb DNA Ladder。
[0024]圖3 是 pFastBac Dual_2Cap_VP22 重組載體鑒定電泳圖，圖中 Ml:DNA Marker III,I:pFastBac Dual-Cap 酶切鑒定，2 和 3:pFastBac Dual_2Cap 酶切鑒定，4:pFastBac_2CapPCR 鑒定，5:pFastBac-Cap-VP22 酶切鑒定，6 和 7:pFastBac-2Cap-VP22 酶切鑒定，8:pFastBac-2Cap-VP22PCR 鑒定。
[0025]圖4是Bacmid重組子鑒定電泳圖，圖中M:lkb DNA Ladder, I:Bac-2Cap重組子PCR 鑒定，2:Bac-2Cap-VP22 重組子 PCR 鑒定。
[0026]圖5是Sf9細胞觀察圖，圖中A:正常培養Sf9細胞，B:轉染Bac_2Cap細胞，C:轉染 Bac-2Cap-VP22 細胞。
[0027]圖6是間接免疫熒光檢測圖，圖中A:正常Sf9，B:Bac-2Cap接種細胞，C:Bac-2Cap-VP22 接種細胞。
[0028]圖7是病毒樣粒子電鏡觀察圖，圖中A =Cap蛋白形成病毒樣粒子，B:Cap_VP22蛋白形成病毒樣粒子。
[0029]圖8是PCV2抗體檢測圖，圖中ICap為注射Cap VLPs亞單位疫苗組，2Cap_VP22為注射Cap-VP22VLPs亞單位疫苗組，3NC為陰性對照組。
【具體實施方式】
[0030]本發明的重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子及其亞單位疫苗按以下構建:
[0031]一、研究方法
[0032]1、Cap-VP22基因的擴增、克隆，根據GenBank公布的PCV2 (GenBank登錄號:GU450328) 0RF2序列設計合成擴增Cap蛋白基因的特異性引物，并合成VP22蛋白轉導域序列，以及將Cap蛋白基因序列與VP22蛋白轉導域序列融合的引物。以常規方法提取PCV2病毒DNA，采用SOE-PCR方法擴增得到Cap_VP22融合基因，將融合基因測序后，通過BamHI/Notl和Nhel/Kpnl酶切，將兩個Cap_VP22基因先后插入桿狀病毒轉移載體pFastBacDual的多克隆位點中，經PCR、酶切及測序鑒定，獲得陽性重組桿狀病毒轉移載體pFastBacDual_2Cap_VP22。
[0033]2、重組質粒 pFastBac Dual_2Cap_VP22 轉化 Ε.coli DHlOBac 感受態細胞，在輔助質粒作用下，重組質粒與桿狀病毒骨架載體Bacmid發生同源重組，外源基因插入桿狀病毒載體骨架，經兩次藍白斑篩選，挑取白色菌落培養，提取重組Bacmid質粒，經PCR鑒定后獲得包含目的基因2Cap-VP22的重組Bacmid質粒。
[0034]3、提取重組 Bacmid 質粒 Bac_2Cap-VP22,通過 Lipofectamine2000 轉染 Sf9 細胞，收取上清，提取病毒DNA，以目的基因Cap-VP22基因引物鑒定重組病毒，確定重組質粒在Sf9細胞內包裝產生表達融合基因Cap-VP22的重組桿狀病毒。重組桿狀病毒命名為cBac_2Cap_VP22。
[0035]4、重組桿狀病毒感染對數生長期的Sf9細胞，并表達導入的Cap_VP22基因；收集感染細胞培養液并裂解，純化獲得Cap-VP22VLPs。
[0036]5、Cap-VP22VLPs單獨或與佐劑配制制備成重組豬圓環病毒顆粒疫苗，免疫小鼠，評價其免疫效果。
[0037]二、研究實驗
[0038]l、PCV2Cap_VP22融合基因擴增、克隆和鑒定
[0039]1.1引物設計合成
[0040]根據GenBank公布的PCV2 (GenBank登錄號:⑶450328) 0RF2序列設計合成擴增Cap蛋白基因特異性引物，人工合成VP22蛋白轉導域序列，同時設計將PCV2Cap與VP22融合的引物。
[0041]VP22蛋白轉導域序列`及引物序列如下:
[0042]VP22蛋白轉導域序列(序列表SEQ.1D.N0.3):
[0043]GACGCGGCCACGGCGACTCGAGGGCGTTCTGCGGCGTCGCGCCCCACCGAGCGACCTCGAGCCCCAGCCCGCTCCGCTTCTCGCCCCAGACCCAGACGGCCCGTCGAGTGA
[0044]引物序列:
[0045]Pl (序列表 SEQ.1D.N0.4):
[0046]5， -GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGA-3’ (BamHI)
[0047]P2 (序列表 SEQ.1D.N0.5):
[0048]5， -CCCTCGAGTCGCCGTGGCCGCGTCAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGA-3’
[0049]P3 (序列表 SEQ.1D.N0.6):
[0050]5， -TTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTGACGCGGCCACGGCGAC-3，
[0051]P4 (序列表 SEQ.1D.N0.7):
[0052]5， -GCGGCCGCTCACTCGACGGGCCGTCTGGGTCT-3， (NotI)
[0053]P5 (序列表 SEQ.1D.N0.8):
[0054]5’ -GCTAGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGA-3’ (NheI)
[0055]P6 (序列表 SEQ.1D.N0.9):
[0056]5， -GGTACCTCACTCGACGGGCCGTCTGGGTCT-3， (KpnI)
[0057]1.2PCR擴增目的基因
[0058]采用常規方法提取PCV2病毒DNA，應用SOE-PCR技術分兩次擴增得到C端引入VP22蛋白轉導域序列的Cap-VP22融合基因。第一次PCR以PCV2基因組為模板，以P1\P2、P5\P2為引物，擴增出兩條Cap基因片段，同時以PUCK-VP22質粒為模板，以P3\P4、P3\P6為引物，擴增VP22序列；第二次PCR以第一次PCR產物為模板，PCR反應10個循環后，再分別以P1\P4、P5\P6為引物擴增出兩端分別含BamHI/Notl和Nhel/Kpnl酶切位點的Cap_VP22融合基因，結果見圖1。
[0059]PCR體系(參照北京全式金公司Fast pfu DNAPolymerase試劑盒說明書):DNA (或質粒)模板 20ng,上游引物(20 μ Μ) I μ L，下游引物(20 μ Μ) I μ L，dNTPs (2.5mM) 3 μ L,5xFastBuffer5 μ L, DNA polymerasel μ L,去離子水補足 25 μ L。
[0060]PCR反應程序(參照北京全式金公司Fast pfu DNAPolymerase試劑盒說明書):950C 2min ；95°C 20s, 68°C 35s, 30 個循環；72°C 7min。
[0061]1.3PCR產物的克隆
[0062]1.3.1PCR產物回收與純化
[0063]PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，切下含目的條帶的瓊脂膠塊，參照DNA快速回收純化試劑盒(北京天根)說明書回收目的片段。
[0064]1.3.2PCR產物克隆與測序
[0065]PCR回收產物分別連接到PEASY克隆載體上，轉化DH5 α感受態細胞，挑取單個菌落培養，提取質粒，通過PCR、酶切及測序鑒定，結果見圖2，獲得PEASY-Cap質粒及含目的基因序列(序列表 SEQ.1D.N0.1)的 PEASY-Cap-VP22 質粒。
[0066]2、重組質粒 pFastBac Dual_2Cap_VP22 的構建
[0067]2.1酶切產物回收與純化
[0068]將PEASY-Cap_VP22質粒及pFastBac Dual載體進行酶切，純化回收目的片段Cap-VP22及線性化載體骨架。
[0069]2.2目的基因克隆進入pFastBac Dual載體
[0070]首先通過BamHI/Notl酶切位點，將2.1純化的Cap_VP22基因插入供體質粒pFastBacDual 中，獲得重組質粒 pFastBac Dual_Cap-VP22,再通過 Nhel/Kpnl 雙酶切pFastBac Dual_2Cap-VP22載體，回收線性骨架，與2.1回收的Cap_VP22基因片段再連接，進而將另一個Cap_VP22基因插入pFastBac Dual載體中，最終獲得含兩個拷貝目的基因的重組質粒 pFastBac Dual_2Cap_VP22。
[0071]2.3重組質粒的提取和鑒定
[0072]重組質粒pFastBac Dual_2Cap-VP22采用雙酶切鑒定，結果如圖3。
[0073]3、重組Bacmid質粒Bac_2Cap-VP22的構建與鑒定
[0074]3.1 重組 Bacmid 質粒 Bac_2Cap_VP22 構建
[0075]按照Bac-to-Bac表達系統說明書，將重組質粒pFastBac Dual_2Cap_VP22轉化DHlOBac感受態細胞，在輔助質粒的作用下與桿狀病毒骨架載體發生同源重組，獲得包含兩個Cap-VP22基因的重組Bacmid質粒Bac-2Cap-VP22，最終將外源基因插入到桿狀病毒骨架載體中。
[0076]3.2重組細菌的挑選和質粒提取
[0077]將轉入重組質粒的DHlOBac感受態細胞以100倍稀釋，取50 μ L涂布于新鮮的含四環素(10 μ g/ml)、卡那霉素(50 μ g/ml)、慶大霉素(7 μ g/ml)、β -半乳糖苷(100 μ g/ml)和IPTG (40 μ g/ml)的SOB平板中，培養48-72小時后，再挑取大的白色菌落重新接種于新的SOB平板中，37°C培養過夜，挑取白色單克隆接種于含(50μ g/ml)卡那霉素，(7yg/ml)慶大霉素，(10 μ g/ml)四環素的LB培養液中，37°C培養8_12h。提取重組Bacmid質粒Bac_2Cap_VP22。
[0078]3.3 重組 Bacmid 質粒 Bac_2Cap_VP22 的鑒定
[0079]以提取的重組Bac-2Cap_VP22質粒為模板，以M13F (序列表SEQ.1D.N0.10):5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’、M13R (序列表 SEQ.1D.N0.11):5’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 為引物，按照Bac-to-Bac表達系統說明書進行PCR鑒定，結果見圖4。
[0080]4、VLPs的獲得與鑒定
[0081]4.1重組質粒轉染Sf9細胞
[0082]將Sf9細胞于6孔板中培養，待細胞匯合度至60-70%時，按照Lipofectamine2000(invitrogen)說明書進行質粒轉染。具體步驟如下:
[0083](I)待轉染的細胞轉染前換上雙無TNM-FH培養基(無雙抗，無FBS)；
[0084](2)將 2 μ g Bacmid 重組質粒 Bac_2Cap_VP22 加入到 200 μ L 雙無 TNM-FH 培養基中，輕輕混勻；
[0085](3)將8 μ L Lipofectamine2000脂質體加入到200 μ L雙無TNM-FH培養基中，輕輕混勻；
[0086](4)將步驟⑵和步驟(3)液體混合均勻，室溫放置15min ；
[0087](5)將步驟(4)混合液逐滴滴入細胞中，補加雙無ΤΝΜ-Π1培養基至1.5mL, 27°C培養4~6h后換成含2.5%胎牛血清`培養基正常培養。
[0088]4.2重組桿狀病毒的獲得與增殖
[0089]轉染后每天觀察細胞病變情況，第三天開始細胞出現明顯的病變，細胞變大，變圓或不規則，開始出現上漂，結果如圖5所示；收集細胞及上清，提取細胞RNA及培養上清中的重組桿狀病毒，進行PCR鑒定，檢測到目的條帶存在；繼續培養5天后，反復凍融收集細胞及培養物上清，4°C，12000rpm,離心lOmin，收集上清，此為Pl代重組細胞毒。將Pl按照1:10接種Sf9細胞，27°C培養4-5天，細胞出現病變時收獲P2代毒，按同樣方法培養P3代毒。重組病毒4°C保存。
[0090]4.3重組桿狀病毒滴度測定
[0091]按照Bac-to-Bac表達系統說明書進行重組病毒滴度計算。將收獲的重組病毒進行10倍稀釋，于24孔板中分別接種長滿單層的Sf9細胞，每個稀釋度進行兩個重復，每孔接種100 μ L，27°C培養Ih后，棄掉病毒液，每孔加入0.5mL瓊脂，27°C培養7_10天，染色后計算孔中空斑數，計算出病毒滴度為2X 107pfu/mL。
[0092]4.4 重組 Cap_VP22 蛋白 IFA 鑒定
[0093]將重組桿狀病毒感染96孔板培養的Sf9細胞，設置非感染組對照。27°C培養48-72h，細胞出現病變后以80%預冷丙酮固定2h。PBST洗滌3次，5%脫脂奶粉(TBST)封閉Ih0加入150 μ L100倍稀釋的針對PCV2的多克隆抗體，37°C孵育lh，PBST洗滌3次，加入150 μ L含有0.02%的伊文斯藍的FITC熒光標記的IgG (1:100倍稀釋)，37°C孵育lh，PBST洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并記錄結果，重組桿狀病毒感染的細胞有綠色熒光出現，而對照組觀測不到熒光。結果如圖6所示。
[0094]4.5重組病毒樣粒子形成[0095]將重組桿狀病毒接種Sf9細胞，27°C培養，表達重組蛋白，反復凍融收集細胞及培養物上清,4°C，12000rpm,離心20min，收集上清，進行電鏡觀察，檢測病毒樣粒子的形成,結果如圖8所示。表明融合VP22蛋白轉導域的Cap蛋白能在體外有效形成病毒樣粒子。5、PCV2重組病毒樣粒子疫苗制備及小鼠免疫試驗
[0096]5.1重組病毒樣粒子疫苗制備
[0097]將收獲的第二代培養物上清接種Sf9細胞，27°C培養，3天后收取細胞上清及培養物，經反復凍融后，4°C，12000rpm,離心20min，收集上清，測定蛋白濃度。將獲得的重組蛋白濃度調整為400ng/mL，按照抗原/佐劑體積比例1:1加入弗氏不完全佐劑乳化，制備成亞單位疫苗。
[0098]5.2小鼠免疫試驗
[0099]選取24只8周齡的BALB/c小鼠隨機分3組，每組8只，其中1、2組分別注射CapVLPs、Cap-VP22VLPs亞單位疫苗，3組作為陰性對照。經肌肉注射(150 μ L/只)和皮下注射(150 μ L/只)免疫小鼠，間隔2周以相同途徑和劑量加強免疫一次。在首免后每間隔7天進行小鼠尾尖靜脈采血，收集小鼠血清測定血清PCV2抗體水平。
[0100]5.3PCV2特異性抗體檢測
[0101]將重組Cap蛋白100 μ L/孔包被酶標板，37°C作用2h或4°C包被過夜，用PBST洗滌3次，每次5min，在吸 水紙上拍干，加封閉液(10%小牛血清)200 μ L/孔，37°C水浴作用2h或4°C封閉過夜，同上洗滌3次，加入血清樣品，進行2倍倍比稀釋，37°C孵育1.5h，同上洗滌3次，加入工作濃度(1:8000稀釋)的羊抗鼠HRP-1gGjOyL/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3次，加入新鮮配制的OPD底物顯色液50 μ L/孔，37°C反應5_10min，加入2M硫酸50 μ L/孔終止反應，在酶標儀上讀取OD450數值，分析抗體產生情況。結果如圖8所示，兩種亞單位疫苗均能刺激小鼠產生特異性抗體，并且Cap-VP22VLPs組要優于Cap VLPs組。
[0102]本發明制備了含VP22蛋白轉導域的PCV2重組VLPs，并將其與佐劑配制亞單位疫苗，通過免疫小鼠具有較好的免疫原性，若進一步優化接種條件、佐劑類型等，可以進一步進行豬體的免疫試驗，具有更好的免疫保護效力，可用于PCV2的預防。
【權利要求】
1.Cap-VP22融合基因，其特征在于:該基因由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉導域核苷酸序列形成。
2.根據權利要求1所述的Cap-VP22融合基因，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列。
3.權利要求1所述Cap-VP22融合基因在制備預防豬圓環病毒病的疫苗中的應用。
4.一種重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，其特征在于:該病毒樣粒子由融合PCV2Cap蛋白基因和VP22蛋白轉導域核苷酸序列形成的Cap-VP22融合基因所編碼。
5.根據權利要求4所述的重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.2的氨基酸序列。
6.根據權利要求5所述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子的制備方法，其特征在于:將來源于HSV-1VP22的蛋白轉導域通過SOE-PCR方法與形成PCV2空衣殼蛋白所需的抗原Cap基因連接起來，克隆到桿狀病毒轉運載體獲得同源重組載體，包裝產生含有PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞，表達融合了 PCV2Cap蛋白和HSV-1VP22蛋白轉導域的重組Cap-VP22蛋白，形成病毒樣粒子。
7.根據權利要求6所述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)克隆目的基因Cap-VP22，并通過BamHI/Notl和NheI/KpnI雙酶切位點分別在PFastBac Dual轉移載體PlO和Ph啟動子之后各插入一個拷貝的目的基因Cap_VP22，獲得含雙拷貝目的基因的重組桿狀病毒轉移載體pFastBac Dual_2Cap-VP22 ； (2)用步驟(1)獲得的pFas`tBDual_2Cap-VP22轉移載體轉化DHlOBac感受態細胞，進行同源重組； (3)篩選鑒定獲得攜帶有目的基因Cap-VP22的重組桿狀病毒DNA； (4)用步驟(3)獲得的重組桿狀病毒DNA以脂質體法轉染對數生長期的Sf9細胞，產生表達融合基因Cap-VP22的重組桿狀病毒； (5)用步驟(4)獲得的重組桿狀病毒感染對數生長期的Sf9細胞，使感染細胞表達Cap-VP22 基因； (6)收集步驟(5)獲得的感染細胞培養液并裂解感染有Cap-VP22基因重組桿狀病毒的宿主細胞，純化獲得重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子。
8.權利要求3所述重組豬圓環病毒2型病毒樣粒子在制備預防豬圓環病毒病的疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N15/62GK103555746SQ201310470020
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】謝振強, 劉金鳳, 鄭文文, 吳健敏, 金宏麗, 覃紹敏, 楊佳, 陳鳳蓮, 段旖, 林俊 申請人:長春西諾生物科技有限公司, 廣西壯族自治區獸醫研究所