一種抑制麥蚜唾液腺體分泌多肽基因表達的dsRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抑制麥蚜唾液腺體分泌多肽基因表達的dsRNA及其應用。本發明提供了一種雙鏈RNA分子，如序列表的序列2所示。本發明還保護編碼所述RNA分子的DNA分子。本發明還保護所述RNA分子或所述DNA分子的應用，為如下（1）至（4）中的至少一種：（1）防治蚜蟲；（2）促進蚜蟲死亡；（3）抑制蚜蟲生長；（4）抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。本發明對于農業生產上蚜蟲的防治具有重要應用價值。
【專利說明】—種抑制麥蚜唾液腺體分泌多肽基因表達的dsRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及ー種抑制麥長管蚜唾液腺體分泌多肽基因表達的dsRNA及其應用。【背景技術】
[0002]麥蚜(尤其是麥長管蚜)是危害中國小麥生產的主要害蟲之一，據統計，中國毎年小麥蚜蟲危害面積可高達0.17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產15%-30%，嚴重時可高達50%。近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應性顯著增強，其危害日趨嚴重。目前，蚜蟲防治以噴灑農藥為主，大量使用農藥不僅對人畜有害，而且造成了嚴重的環境污染。培育抗蚜蟲小麥品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現有種質資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機制尚不明確，常規育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥抗蚜新種質具有重要意義。[0003]植物介導的RNAi技術已成為農作物抗蟲基因工程的熱點之一，通過寄主植物表達相應昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應的基因從而達到控制害蟲危害的目的。RNAi的過程是雙鏈RNA (dsRNA)進入生物體內，被Dicer酶切割成21_23nt的siRNA, siRNA與RNA誘導沉默復合物結合，與互補序列的靶mRNA結合，被Dicer識別，造成靶基因表達量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標基因，導致靶標基因表達和沉默，已經廣泛應用于昆蟲生長發育關鍵基因的鑒定和功能分析。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供ー種抑制麥蚜唾液腺體分泌多肽基因表達的dsRNA及其應用。
[0005]本發明提供了一種雙鏈RNA分子，如序列表的序列2所示。
[0006]本發明還保護編碼所述RNA分子的DNA分子。所述DNA分子為序列表的序列I所示的DNA分子。
[0007]含有所述RNA分子的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒均屬于本發明的保護范圍。
[0008]含有所述DNA分子的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒均屬于本發明的保護范圍。
[0009]本發明還保護所述RNA分子或所述DNA分子在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(I)至(4)中的至少ー種:(I)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；
(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有唾液腺體分泌多肽基因的蚜蟲。所述唾液腺體分泌多肽基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0010]本發明還保護ー種產品，其活性成分為所述RNA分子或所述DNA分子；所述產品的用途為如下(I)至(4)中的至少ー種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有唾液腺體分泌多肽基因的蚜蟲。所述唾液腺體分泌多肽基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0011]本發明還保護所述RNA分子或所述DNA分子的應用，為如下(I)至(4)中的至少ー種:(I)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有唾液腺體分泌多肽基因的蚜蟲。所述唾液腺體分泌多肽基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0012]本發明還保護用于抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達的物質在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(c): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有唾液腺體分泌多肽基因的蚜蟲。所述唾液腺體分泌多肽基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0013]本發明還保護ー種產品，其活性成分為抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達的物質；所述產品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(c): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有唾液腺體分泌多肽基因的蚜蟲。所述唾液腺體分泌多肽基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0014]本發明基于麥長管蚜的唾液腺體分泌多肽的cDNA的保守序列，提供了ー種dsRNAo體外飼喂本發明提供的dsRNA，可以通過RNAi沉默麥長管蚜體內唾液腺體分泌多肽基因，進而對麥長管蚜產生致死效應，且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸増大。本發明對于農業生產上蚜蟲的防治具有重要應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】[0015]圖1為制備dsRNA-1和dsRNA-2的過程中的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016]圖2為dsRNA-1和dsRNA-2的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0017]圖3為用P3-F和P3-R組成的引物對鑒定內參基因的擴增曲線和標準曲線。
[0018]圖4為用P2-F和P2-R組成的引物對鑒定唾液腺體分泌多肽基因的擴增曲線、標準曲線和溶解曲線。
【具體實施方式】
[0019]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。T7體外轉錄試劑盒:NEB公司。
[0020]麥長管蚜:參考文獻:錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的研究.植物保護，1982，01，14-15.;公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得；將麥長管蚜接種到小麥品種科農199的幼苗上，放入人工氣候箱中(20±2°C、60%-80%濕度、16小時光照/8小時黑暗)進行繁殖。
[0021 ] 實施例1、用于沉默唾液腺體分泌多肽基因的dsRNA的制備
[0022]1、提取麥長管蚜的總RNA并反轉錄為cDNA。
[0023]2、以步驟I得到的cDNA為模板，用PトF和PトR組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1A。
[0024]Pl-F (上游引物):TAATACGACTCACTATAGGG AG CGAGGGCGTCATAGCACGGTTT ；
[0025]Pl-R (下游引物):TAATACGACTCACTATAGGG AG CCTCTAGGGTACGGGTACGAACAAGGC。
[0026]下劃線標注的區域為17啟動子序列。
[0027]PCR 反應體系:10XPCR Buffer5 U L.dNTP (2.5mmol ?じ1)4 ii L、rTaq0.5 ii L、上游引物(20 u mo I ?じ1) I u L、下游引物(20 u mo I ?じ1) I u L、模板I U L,用ddH20補足至50 Uし
[0028]PCR 反應條件:94で 4min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s，39 個循環；72で IOmin ；
4°C保存。
[0029]3、dsRNA-1 的制備
[0030]回收步驟2得到的PCR擴增產物并作為模板，采用17體外轉錄試劑盒進行體外轉錄(42°C孵育16小時)，用DNaseI和RNaseA消化殘留的模板DNA和單鏈RNA，得到dsRNA-1。
[0031]dsRNA-1的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2A。將dsRNA_l進行測序，測序結果表明，dsRNA-1為序列表的序列2所示的雙鏈RNA。用無RNase水溶解dsRNA-1，用分光光度計(波長260nm)進行定量，然后置于_20°C冰箱中保存。
[0032]實施例2、用于沉默GFP基因的dsRNA的制備
[0033]1、合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。
[0034]2、以步驟I得到的雙鏈DNA分子為模板，用P4-F和P4-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1B。
[0035]P4-F (上游引物):TAATACGACTCACTATAGGG ACGGGAACTACAAGACACG ；
[0036]P4-R (下游引物):TAATACGACTCACTATAGGG C TTTGGAAAGGGCAGATT。
[0037]PCR反應體系和PCR反應條件同實施例1的步驟2中的PCR反應體系和PCR反應條件。
[0038]3、dsRNA-2 的制備
[0039]回收步驟2得到的PCR擴增產物并作為模板，采用17體外轉錄試劑盒進行體外轉錄(42°C孵育16小時)，用DNaseI和RNaseA消化殘留的模板DNA和單鏈RNA，得到dsRNA-2。
[0040]dsRNA-2的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2B。將dsRNA_2進行測序，測序結果表明，dsRNA-2為序列表的序列4所示的雙鏈RNA。用無RNase水溶解dsRNA-2，用分光光度計(波長260nm)進行定量，然后置于_20°C冰箱中保存。
[0041]實施例3、dsRNA在抑制蚜蟲生長中的應用
[0042]一、蚜蟲人工飼料的配制和飼育器的準備
[0043]人工飼料配制方法和飼育器的結構見參考文獻(李彩霞，高麗鋒，高玲玲，李潤植.全純人工營養液飼養蚜蟲的研究.山西農業大學學報，1997，17(3):225-228.LiCX, ^ao L Fj ^ao L Lj Li R Z.Study on the rearing 01 aphids on a artmciallyholidic diets.Journal of Shanxi Agricultural University, 1997, 17(3):225-228.(inChinese))。用0.2 u m孔徑的細菌過濾器過濾人工飼料，分裝到2.0mL滅菌的離心管中，保存于-20°C的冰箱中，避免反復凍融。
[0044]二、dsRNA在抑制蚜蟲生長中的應用
[0045]麥長管蚜的飼喂方法見參考文獻:糾敏，劉樹生.利用人工飼料飼養蚜蟲技術.華東昆蟲學報，2004，13(2): 102-109.Jiu M, Liu S S.Aphid rearing with artificialdiets.Entomological Journal of East China, 2004，13 (2):102-109。
[0046]1、分組處理
[0047]DSR32組:每個飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用混合飼料甲(混合飼料甲的制備方法:每100 u L人工飼料中加入750ng dsRNA-1)飼喂蚜蟲，每兩天更換新的混合飼料甲、每兩天統計死亡率并取存活的麥長管蚜檢測唾液腺體分泌多肽基因的相對表達量。
[0048]GFP組:每個飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用混合飼料こ(混合飼料こ的制備方法:姆100 V- L人工飼料中加入750ng dsRNA-2)飼喂姆蟲,姆兩天更換新的混合飼料こ、每兩天統計死亡率并取存活的麥長管蚜檢測唾液腺體分泌多肽基因的相對表達量。
[0049]對照組:每個蚜蟲飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用人エ飼料飼喂蚜蟲，每兩天更換新的人工飼料、每兩天統計死亡率并取存活的麥長管蚜檢測唾液腺體分泌多肽基因的相對表達量。
[0050]每組設置5個重復處理(即5個飼育器)。
[0051]養殖條件:20±2°C、·濕度60%_80%，16小時光照/8小時黑暗。
[0052]2、死亡率統計結果
[0053]使用EXcel2003軟件對死亡率進行統計學分析，計算平均值與方差，并進行顯著性差異的分析(t-test，P〈0.01或0.05)。結果見表1。
[0054]表1各組的死亡率統計分析結果，平均值土標準差(％)
[0055]
【權利要求】
1.一種雙鏈RNA分子,如序列表的序列2所不。
2.編碼權利要求1所述RNA分子的DNA分子。
3.含有權利要求1所述RNA分子或權利要求2所述DNA分子的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒。
4.權利要求1所述RNA分子或權利要求2所述DNA分子在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(I)至(4)中的至少ー種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。
5.ー種產品，其活性成分為權利要求1所述RNA分子或權利要求2所述DNA分子；所述產品的用途為如下(I)至(4)中的至少ー種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。
6.權利要求1所述RNA分子或權利要求2所述DNA分子的應用，為如下(I)至(4)中的至少ー種:(I)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達。
7.如權利要求4所述的應用，如權利要求5所述的產品，或，如權利要求6所述的應用，其特征在于:所述蚜蟲為麥蚜。
8.用于抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達的物質在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(c): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。
9.ー種產品，其活性成分為抑制蚜蟲體內唾液腺體分泌多肽基因的表達的物質；所述產品的用途為如下(a)和/或(·b)和/或(c): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。
10.如權利要求8所述的應用，或，如權利要求9所述的產品，其特征在于:所述蚜蟲為麥蟲牙。
【文檔編號】C12N15/113GK103589729SQ201310556636
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】夏蘭琴, 王大海, 孫永偉, 杜文明 申請人:中國農業科學院作物科學研究所