一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法
【專利摘要】本發明涉及一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，該方法以大豆糖蜜作為唯一碳源，再添加所需的培養基，采用黑曲霉菌發酵生產檸檬酸；采用大豆糖蜜質量濃度26%，發酵溫度35℃，起始pH4.5，發酵時間96h，接種量5%，在此條件下，大豆糖蜜發酵檸檬酸得到的總酸度為9.02%。本發明選用大豆糖蜜發酵生產檸檬酸，充分利用了大豆糖蜜這一寶貴資源，對其開發和利用，一方面可減輕對環境壓力，另一方面也可以大大提高大豆糖蜜的利用價值，變廢為寶。另外由于大豆糖蜜價格低廉，采用其作為發酵底物可以明顯降低生產成本。
【專利說明】一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法。
【背景技術】
[0002]檸檬酸又名枸櫞酸，是一種三元羧酸，其學名為3—羥基一3—羧基戊二酸。檸檬酸是生物體主要代謝產物之一，在自然界中分布廣泛，主要存在于檸檬、柑橘、梅子等果實中。檸檬酸被廣泛地應用于食品、醫藥和化學工業中。 [0003]大豆糖蜜是醇法生產大豆濃縮蛋白過程中的副產物。1963年，Daniel Chajuss把乙醇提取大豆蛋白質過程中產生的棕色粘稠的漿狀物質命名為“大豆糖蜜”。大豆糖蜜成分較為復雜，是多種植物性化合物的集合體。在生產大豆濃縮蛋白的過程中產生的大豆糖蜜是制約生產企業擴大生產規模的主要因素之一，由于大豆糖蜜物料的特殊性，目前只作為價格低廉產品出售主要用作飼料，有效成分得不到充分利用，造成資源浪費。因此，對大豆糖蜜的開發和利用顯得尤為重要，若能充分利用這一寶貴資源，對其開發和利用，一方面可減輕對環境壓力，另一方面也可以大大提高其利用價值。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是:提供一種生產成本低的大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，該方法不僅充分利用了大豆糖蜜中的有效成分，大大提高了其的利用價值，變廢為寶，而且減輕了大豆糖蜜對環境的壓力。
[0005]解決上述技術問題的技術方案是:一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，包括以下步驟:
(1)培養基的制備
菌種活化培養基的制備:取去皮土豆加蒸懼水煮沸25-35 min, 土豆與蒸懼水的比例為:lg:3.8-4.2 mL,過濾,取濾液,按Ig土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0.095g瓊脂計加入葡萄糖和瓊脂，用蒸餾水定容，土豆與定容后溶液的比例為:lg:4.8-5.2 mL，滅菌后鋪斜面，制備成斜面培養基備用；
種子培養基的制備:取55-65g/L的大豆糖蜜溶液，按ImL大豆糖蜜溶液加入
0.05-0.06g葡萄糖計加入葡萄糖，用蒸餾水定容，大豆糖蜜溶液與定容后溶液的體積比為:1:1.9-2.1，滅菌后冷卻備用；
發酵培養基的制備:調節大豆糖蜜初糖質量濃度為23-28%，加入新制配的石灰乳調pH8.8-9.2，加熱煮沸，過濾，濾液用硫酸回調至pH5.8-6.2，再加草酸除去多余的Ca2+,在2500-3500 r/min的轉速下離心分離15-25 min,取上清液，按ImL上清液加入
0.005-0.00681^2?04和().01-0.015尿素計，先加入KH2PO4，滅菌后，再加入尿素，再在無菌操作條件下利用鹽酸或者氫氧化鈉溶液調節PH4.3-4.8，冷卻備用；
(2)菌種活化:以無菌操作方式用接種環取一環的黑曲霉菌菌種到菌種活化培養基中劃斜面，放在28-33°C恒溫培養65-80 h后，用無菌水將斜面上的孢子洗下制備孢子懸濁液，利用無菌水調節孢子懸濁液中孢子濃度0.8 X IO6-L 2X106spore/mL ；
(3)種子培養:取孢子懸浮液接入種子培養基中，孢子懸浮液與種子培養基的體積比為:1:45-55，于32-38°C、150-250 r/min的搖床中培養35_45h得種子發酵液；
(4)糖蜜發酵產檸檬酸:按4-6%的接種量將種子發酵液接種到發酵培養基中，將接種好的培養基放到32-38°C、150-250 r/min的搖床上培養90_100h。
[0006]本發明的進一步技術方案:所述的發酵培養基的制備步驟中，所述的石灰乳的質量濃度為10-20%，所述的鹽酸或者氫氧化鈉溶液的濃度為l-2mol/L。 [0007]所述的菌種活化培養基的制備和種子培養基的制備步驟中，滅菌是指在121°C滅菌20 min,所述的發酵培養基的制備步驟中，尿素是指在108°C滅菌5min后的尿素，鹽酸或者氫氧化鈉溶液是指在121°C滅菌15min后的鹽酸或者氫氧化鈉溶液。
[0008]以干基計，大豆糖蜜中碳水化合物占總固形物含量的60%左右，是一種良好的天然微生物發酵劑，因大豆糖蜜價格低廉，作為發酵底物可以明顯降低生產成本，使其有效地轉換為具有更高利用價值的生物能源和化工原料，同時，大豆糖蜜制備發酵產品的副產物還是良好的飼料添加劑，可達到物盡其用。本發明選用大豆糖蜜發酵生產檸檬酸(以大豆糖蜜作為唯一碳源)，充分利用了大豆糖蜜這一寶貴資源，對其開發和利用，一方面可減輕對環境壓力，另一方面也可以大大提高大豆糖蜜的利用價值。因此，選用大豆糖蜜發酵生產檸檬酸，無論是從經濟角度還是從可行性角度，都是值得考慮選擇利用的。本發明采用大豆糖蜜發酵生產檸檬酸得到的總酸度為9.02%。
[0009]下面，結合附圖和實施例對本發明之一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法的技術特征作進一步的說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1:本發明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例1:一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，包括以下步驟:
(I)培養基的制備
菌種活化培養基的制備:50 g去皮土豆加蒸餾水200mL煮沸30 min，過濾，取濾液，加入5 g葡萄糖，4.5 g瓊脂，蒸餾水定容至250 mL，在121°C滅菌20 min后倒入試管中鋪斜面，制備成斜面培養基備用。
[0012]種子培養基的制備:于250 ml三角瓶加入60 g/L的大豆糖蜜溶液50 mL，加入2.5g葡萄糖，蒸餾水定容至100 mL，12rC滅菌20 min，冷卻備用。
[0013]發酵培養基的制備:調節大豆糖蜜初糖含量為26% (質量濃度)，加入新制配的15%石灰乳調PH9.0，加熱煮沸，過濾，濾液用硫酸回調至pH6.0，再加草酸除去多余的Ca2+，在3000 r/min的轉速下離心分離20 min,取上清液，以每瓶50 mL分裝到500 mL的三角瓶中，添加KH2PO4 0.3g,在121 °C下高壓滅菌20 min,在無菌操作條件下加入尿素0.5g (尿素事先108°C滅菌5min)，再在無菌操作條件下利用lmol/L鹽酸或者氫氧化鈉溶液調節pH4.5(lmol/L鹽酸或者氫氧化鈉事先121°C滅菌15min)，冷卻備用。
[0014](2)菌種活化:以無菌操作方式用接種環取一環的黑曲霉菌菌種到菌種活化培養基中劃斜面，把接好菌種的試管放在30°C恒溫培養72 h后，用無菌水將斜面上的孢子洗下制備孢子懸濁液，利用無菌水調節孢子懸濁液中孢子濃度約106SpOre/mL。
[0015](3)種子培養:吸取約2 mL孢子懸浮液接入已裝有100 mL的種子培養基的250mL的三角瓶中，35 0C 200 r/min的搖床中培養40 h得種子發酵液。
[0016](4)糖蜜發酵產檸檬酸
利用大豆糖蜜按照發酵培養基的制備方法制得發酵培養基，按5% (質量分數)的接種量將種子發酵液接種到發酵培養基中，將接種好的培養基放到35°C，200r/min的搖床上培養96h。在此條件下，大豆糖蜜 發酵檸檬酸得到的總酸度為9.02%。
【權利要求】
1.一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)培養基的制備 菌種活化培養基的制備:取去皮土豆加蒸懼水煮沸25-35 min, 土豆與蒸懼水的比例為:lg:3.8-4.2 mL,過濾,取濾液,按Ig土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0.095g瓊脂計加入葡萄糖和瓊脂，用蒸餾水定容，土豆與定容后溶液的比例為:lg:4.8-5.2 mL，滅菌后鋪斜面，制備成斜面培養基備用； 種子培養基的制備:取55-65g/L的大豆糖蜜溶液，按ImL大豆糖蜜溶液加入0.05-0.06g葡萄糖計加入葡萄糖，用蒸餾水定容，大豆糖蜜溶液與定容后溶液的體積比為:1:1.9-2.1，滅菌后冷卻備用； 發酵培養基的制備:調節大豆糖蜜初糖質量濃度為23-28%，加入新制配的石灰乳調pH8.8-9.2，加熱煮沸，過濾，濾液用硫酸回調至pH5.8-6.2，再加草酸除去多余的Ca2+,在2500-3500 r/min的轉速下離心分離15-25 min,取上清液，按ImL上清液加入 0.005-0.00681^2?04和().01-0.015尿素計，先加入KH2PO4，滅菌后，再加入尿素，再在無菌操作條件下利用鹽酸或者氫氧化鈉溶液調節PH4.3-4.8，冷卻備用； (2)菌種活化:以無菌操作方式用接種環取一環的黑曲霉菌菌種到菌種活化培養基中劃斜面，放在28-33°C恒溫培養65-80 h后，用無菌水將斜面上的孢子洗下制備孢子懸濁液，利用無菌水調節孢子懸濁液中孢子濃度0.8 X IO6-L 2 X IO6SporeAiL ； (3)種子培養:取孢子懸浮液接入種子培養基中，孢子懸浮液與種子培養基的體積比為:1:45-55，于32-38°C、150-250 r/min的搖床中培養35_45h得種子發酵液； (4)糖蜜發酵產檸檬酸:按4-6%的接種量將種子發酵液接種到發酵培養基中，將接種好的培養基放到32-38°C、150-250 r/min的搖床上培養90_100h。
2.根據權利要求1所述的一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，其特征在于:所述的發酵培養基的制備步驟中，所述的石灰乳的質量濃度為10-20%，所述的鹽酸或者氫氧化鈉溶液的濃度為l-2mol/L。
3.根據權利要求1或2所述的一種大豆糖蜜發酵生產檸檬酸的方法，其特征在于:所述的菌種活化培養基的制備和種子培養基的制備步驟中，滅菌是指在121°C滅菌20 min，所述的發酵培養基的制備步驟中，尿素是指在108°C滅菌5min后的尿素，鹽酸或者氫氧化鈉溶液是指在121°C滅菌15min后的鹽酸或者氫氧化鈉溶液。
【文檔編號】C12R1/685GK103614421SQ201310583223
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】程謙偉, 孟陸麗, 易弋, 孫庭廣, 黃繼偉 申請人:廣西科技大學