全人源抗cd26抗體及其應用的制作方法

全人源抗 cd26 抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種新的可與CD26特異性結合的高親和力全人源抗體、制備方法及其應用，屬于基因工程抗體【技術領域】。CD26是一種普遍存在的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有多種生物學功能，可以和多種蛋白相互作用，如ADA、CD45、FAP-alpha等。本發明提供的一種來源于人源的抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結合人CD26，優選特異性結合CD26胞外區，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8一組序列的6個互補決定區的任何區域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯物，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。本發明得到的抗CD26單鏈抗體與CD26具有高特異性結合，同時也可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移。
【專利說明】全人源抗CD26抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程抗體【技術領域】，尤其是涉及一種新的可與CD26特異性結合的高親和力全人源抗體、制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]⑶26是一種普遍存在的多功能II型跨膜糖蛋白，具有多種生物學功能，也可以以溶解形式存在于血漿中。CD26常以同源二聚體形式存在，其單體含766個氨基酸，相對分子質量約llOkDa。氨基酸殘基從內向外分為5個部分:胞內區(I~6)、跨膜區(7~28)、高度糖基化區(29~323)、富含半胱氨酸區(324~551)和C端催化結構域(552~766)，⑶26分子三維結構與功能密切相關。⑶26的C端催化結構域發揮二肽基肽酶IV (Dipeptidylpeptidase4,DPPIV)活性，可以水解體內多種底物發揮生物學作用，富含半胱氨酸區可以和體內多種分子相互作用，從而參與體內免疫功能。CD26在免疫調節中的作用已被廣泛研究，CD26是T細胞活化的分子標志，也在T細胞信號轉導過程中作為共刺激分子，還涉及多種T細胞功能，包括T細胞發生成熟及遷移，細胞因子分泌，T細胞依賴的抗體產生，B細胞免疫球蛋白轉型等。CD26在自身免疫性疾病的發生發展過程中發揮重要作用，已成為臨床疾病的分子標志，并被認為是某些免疫性疾病的治療或診斷靶點。(Ohnuma et al.(2011)AdvClin Chem, 53，51-84)
[0003]⑶26由于可以和多種蛋白相互作用，如ADA、⑶45、FAP-alpha等，還可以結合ECM,導致表達CD26細胞浸潤活性的增加或降低，可見CD26在腫瘤生物學發揮重要作用。⑶26 的表達量在多種的新生瘤細胞表面或血清中會升高，例如，⑶26高表達于某些進攻性T細胞惡性腫瘤，惡性間皮瘤，腎瘤，某些結腸癌(Havre et al.(2008) FrontBiosci, 13，1634-1645)。某些⑶26+結腸癌細胞亞群，⑶26+惡性間皮瘤細胞都有明顯腫瘤干細胞特征(Ghani et al.(2011)Biochem Biophys Res Commun, 404，735_742and Pang etal.(2010)Cell Stem Cell, 6，603-615)，因此CD26可作為多種腫瘤的分子標志。
[0004]已有多種結合⑶26的鼠源抗體報道(Havre et al.(2008)FrontBiosci, 13，1634-1645)，在治療某些⑶26高表達癌癥，以及抑制細胞遷移，血管形成方面都能發揮作用。有文獻報道抗CD26的鼠單克隆抗體1F7與CD26的結合導致細胞周期停滯在G1/S限制點，并且CD26的結合通過增強表達細胞周期調節蛋白質p21來誘導CD26Jurkat轉染子停滯在Gl，用1F7抗體治療可以抑制CD26+腫瘤的形成，并在小鼠模型中增強存活率。其他抗CD26的鼠單克隆抗體E19和E26，這些抗體表現出抑制成纖維細胞和創傷細胞的細胞遷移來形成單層的抑制作用、對血管形成的抑制效果、以及對人皮膚微血管內皮細胞的侵入和毛細管新支的形成具有抑制效果。由此可見，抗CD26單克隆抗體可通過改變CD26的活性在治療多種疾病中發揮作用。但是，鼠單克隆抗體在直接應用于人體治療時會產生人抗鼠抗體反應(Human Ant1-Mouse Antibody, HAMA),人體會產生抗小鼠抗體的抗體，不僅會減弱療效，也會導致急性致敏反應。為了克服鼠源單抗的缺點，基因工程抗體技術發展出了人-鼠嵌合抗體，嵌合抗體由鼠源性抗體的V區基因與人抗體的C區基因拼接為嵌合基因，使鼠源性成分減少70%左右，以及人源化抗體，在嵌合抗體的基礎上進一步用人抗體可變區的骨架區(FR)替代鼠FR，大大減少了抗體的鼠源成分。但殘留的少量鼠抗體的序列仍有可能潛在引發HAMA。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題:本發明旨在提供一種能有效的、特異性結合人CD26的全人源抗體，及其在制備治療以CD26的表達，特別是過量表達為特征的疾病，診斷CD26變化性表達疾病的藥物中的新用途。更具體地說:
[0006]本發明第一個目的是提供一種來源于人源的抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結合人CD26，優選特異性結合CD26胞外區，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8一組序列的6個互補決定區的任何區域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯物，或通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
[0007]優選的是本發明中的抗體或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2, SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:4所示序列的重鏈可變區的互補決定區。
[0008]優選的是本發明中的抗體或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7和SEQ ID N0:8所示序列的輕鏈可變區的互補決定區。
[0009]更為優選的是本發明中的抗體或其片段，其重鏈可變區的氨基酸序列含有以下的互補決定區:如序列SEQ ID NO:2所示的CDRH1，如序列SEQ ID NO:3所示的CDRH2，如序列 SEQ ID NO:4 所示的 CDRH3 ；
[0010]以及其輕鏈可變區的氨·基酸序列含有以下的互補決定區:如序列SEQ ID NO:6所示的CDRL1，如序列SEQ ID NO:7所示的CDRL2和如序列SEQ ID NO:8所示的CDRL3。
[0011]更為優選的是本發明中的抗體或其片段含有重鏈可變區如SEQ ID NO:1所示序列和輕鏈可變區如SEQ ID N0:5所示序列。
[0012]本發明第二個目的是提供一種來源于人源的單鏈抗體，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0013]本發明第三個目的是提供一種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO: 10 所示。
[0014]本發明第四個目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達載體。
[0015]本發明第五個目的是提供一種含有上述表達載體的重組宿主菌。
[0016]本發明第六個目的是提供一種生產上述單鏈抗體的方法，包括:
[0017]I)在合適的條件下培養上述重組宿主菌表達抗體；
[0018]2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
[0019]本發明第七個目的是提供上述抗體或其片段在制備治療CD26高表達腫瘤的藥物中的新用途。可治療以CD26的表達，特別是過量表達為特征的疾病，并為診斷CD26變化性表達疾病提供了基于抗體的方法，相關疾病包括但不限于自身免疫病和癌癥。
[0020]發明進一步說明:
[0021]本發明中全人源抗⑶26單鏈抗體基因序列全長723個核苷酸，預期有241個氨基酸。具有115個氨基酸的重鏈可變區(SEQ ID NO:1)和111個氨基酸的輕鏈可變區(SEQ IDNO: 5)，重鏈可變區和輕鏈可變區之間由15個氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID N0:9)。
[0022]含有本發明CD26單鏈抗體基因的表達載體和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增本發明單鏈抗體基因的任意片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
[0023]本發明的有益效果有:
[0024]本發明中的抗體或其片段具有多種特性，包括結合并中和CD26的能力。具體而言，本發明得到的抗CD26單鏈抗體與CD26具有高特異性結合，體外可以抑制腫瘤細胞通過CD26介導的細胞粘附作用，體外抑制腫瘤細胞生長實驗結果表明，本發明得到的單鏈抗體可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是單鏈抗體ZHB_2cF9的結構示意圖。VH代表重鏈可變區結構域(SEQ IDNO: 1)，VL代表輕鏈可變區結構域(SEQ ID NO: 5)，Linker為連接VH，VL的柔性肽(SEQ IDN0:9)。
[0026]圖2是⑶26胞外區蛋白的鑒定圖。A是純化后蛋白的SDS-PAGE圖，LaneI為標準蛋白，Lane2為純化后⑶26胞外區蛋白(箭頭所指);B是純化后⑶26胞外區蛋白的WesternBlot鑒定圖，Lanel為標準蛋白，Lane2為純化后(D26胞外區蛋白(fir頭所指),一抗為抗CD26鼠抗(購自MBL)，二抗為兔抗鼠-HRP抗體(購自life technology)。
[0027]圖3A、圖3B是噬菌體抗體與⑶26胞外區蛋白結合的ELISA測定結果。圖3A是多克隆噬菌體ELISA，⑶26胞外區蛋白包被濃度為I μ g/mL，稀釋4輪篩選擴增的噬菌體，與包被⑶26胞外區蛋白的酶標板孵育，抗M13-HRP抗體再次孵育，測定450nm，650nm吸光值，并以OD45tlm1-OD65tlnm作為最終值。結果表明，展示有CD26特異性單鏈抗體的噬菌體得到了明顯的富集。圖3B是單克隆噬菌 體ELISA測定結果，挑選單克隆至96孔板中表達噬菌體抗體，與包被CD26胞外區蛋白的酶標板孵育，抗M13-HRP抗體檢測結果，測定OD45tol-OD65tlnm作為最終值，結果顯示90%以上的單克隆與CD26胞外區蛋白產生陽性結合作用。
[0028]圖4是單鏈抗體ZHB-2cF9的鑒定圖。A是鎳柱純化后的ZHB_2cF9的SDS-PAGE圖,Lane2為ZHB-2cF9樣品蛋白，蛋白fif頭所指為目的蛋白大小條帶；Lanel為標準蛋白；B是純化后ZHB-2cF9的Western Blot鑒定圖，一抗為抗myc鼠抗,二抗為兔抗鼠-HRP抗體，Lanel為ZHB_2cF9樣品，蛋白箭頭所指為目的蛋白大小條帶，Lane2為標準蛋白。
[0029]圖5展示單鏈抗體ZHB_2cF9與CD26胞外區蛋白結合的Western Blot鑒定圖。一抗為抗myc鼠抗，二抗為兔抗鼠-HRP抗體。Lanel為標準蛋白，Lane2為ZHB_2cF9與⑶26胞外區蛋白結合作用，箭頭所指顯示了與圖2中CD26胞外區蛋白大小一致的條帶。結果表明表明抗⑶26單鏈抗體ZHB-2cF9可以特異性與⑶26胞外區蛋白結合。
[0030]圖6展示單鏈抗體與人間皮瘤細胞NC1-H2452結合的免疫熒光圖。A是ZHB_2cF9與NC1-H2452細胞的免疫熒光，B是陰性對照抗體與NC1-H2452細胞免疫熒光結合檢測的陰性結果，抗體濃度均由5%MPBS稀釋至10 μ g/mL。
[0031]圖7展示單鏈抗體抑制人間皮瘤細胞NC1-H2452結合ECM的檢測結果。實驗所用ECM為纖連蛋白，實驗分為Binding組，Blank組,抗體試驗組,考察單鏈抗體作用12h后的細胞對纖連蛋白的粘附情況。
[0032]0D450 (Binding 組)-0D450 (Blank 組)=完全粘附細胞值；[0033]0D450 (抗體試驗組)-0D450 (Blank組)=樣品組的細胞粘附值；
[0034]IgG control為陰性對照抗體；
[0035]細胞粘附率(％)=樣品組的細胞粘附值/完全粘附細胞值
[0036]結果表明，與陰性對照IgG control相比，ZHB_2cF9及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452細胞粘附均有明顯抑制作用。
[0037]圖8展示單鏈抗體對人間皮瘤NC1-H2452細胞增殖抑制的檢測結果。細胞以I X IO4/孔的數量孵于96孔板中，在單鏈抗體ZHB-2CF9，scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG(鼠)作用48h后，采用CCK-8試劑反應30min，測定450nm的吸光度值，細胞的增殖抑制率以0D450nm的減少率％表示。實驗結果表明ZHB_2cF9及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。
[0038]圖9展示單鏈抗體對人結腸癌HCT116細胞增殖抑制的檢測結果。細胞以8X IO4/孔的數量孵于96孔板中，在單鏈抗體ZHB-2cF9，scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG (鼠)作用48h后，采用CCK-8試劑反應30min，測定450nm的吸光度值，細胞的增殖抑制率以0D450nm的減少率％表示。實驗結果表明ZHB-2cF9及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。
【具體實施方式】
[0039]定義
[0040]“抗體”是能夠通過可變區內至少一個抗原識別位點特異性結合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如糖、多核苷酸、脂、多肽等。該術語不僅包括完整的多克隆和單克隆抗體，也包括其片段(例如Fab、Fab ’、F (ab ’)2、Fv )、單鏈抗體(scFv )、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白和任一包含抗原識別位點的其他改變構型的免疫球蛋白分子。抗體包括任一類的抗體，如IgG、IgA或IgM (或其亞類)，并且抗體不需要為任一特定類。
[0041]如本文所用，“單鏈抗體”指的是免疫球蛋白重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(')由10~25個氨基酸多肽連接形成的單一鏈融合蛋白，連接肽(linker),通常富含甘氨酸和絲氨酸，以利于單鏈抗體的穩定性與柔韌性。連接方式可將\的N端連接至Vh的C末端，或者相反。盡管去除了恒定區并引入linker，單鏈抗體依然保留了免疫球蛋白對抗原的特異性。
[0042]“嵌合抗體和人源化抗體”，一般來說指的是組合了來自不止一個物種的區域的抗體。“嵌合抗體”在傳統上包含來自小鼠(或某些情況下為大鼠)的可變區和來自人的恒定區。“人源化抗體” 一般是指非人(例如鼠)抗體形式，其為含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的特定嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或抗體的其它抗原結合子序列)。一般而言，在人源化抗體中，除CDR外，整個抗體是由人來源的多核苷酸編碼，或者與由人來源的多核苷酸編碼的抗體在CDR之外具有同一'丨生。一些或所有的CDR是由非人生物體來源的核酸編碼的，將它們移植到人抗體可變區的片層框架區以產生抗體，該抗體的特異性由植入的CDR決定。
[0043]如本文所用，“人源抗體”表示具有與人產生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體、和/或用本領域已知或本文公開的制備人源抗體的任一技術制備的抗體。人源抗體可以用多種本領域已知技術產生。例如，人源抗體選自噬菌體文庫，其中所述的噬菌體文庫表達人源抗體。人源抗體也可以通過將人免疫球蛋白基因座(loci)引入轉基因動物來制備，其中所述的轉基因動物例如已將內源免疫球蛋白基因部分或完全滅火的小鼠。備選地，人抗體可以通過永生化產生抗靶抗原的抗體的人B淋巴細胞(該B淋巴細胞可以從個人獲得或者已在體外進行免疫)來制備。在一些實施方案中，人源抗體為“全人源”，這表示抗體包含人重鏈和輕鏈多肽。
[0044]現在結合以下實施例說明本發明。提供這些實施例僅用于說明的目的，本發明不限于這些實施例，而是包含明顯由本文提供的教導產生的所有改變。用于構建載體和質粒、將質粒導入宿主細胞和基因，以及基因產物的表達鑒定等常規方法的詳細描述可以從各種出版物上獲得，例如《分子克隆實驗指南第三版》。實施例中涉及的百分比，其中固體試劑為重量百分比，液體試劑為體積百分比。
[0045]部分材料來源說明于此:
[0046]細胞系:HLF細胞，是人的未分化的肝癌細胞，獲自JCRB cell bank (JapaneseCollection of Research Bioresources Cell Bank)。NC1-H2452,是人間皮瘤細胞，獲自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。HCT116，是人結腸癌細胞，獲自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
[0047]培養基和緩沖液等試劑:RPM1-1640(GIBC0，Cat#31800022，添加NaHCO3 1.5g/L,glucose2.5g/L, Sodium Pyruvate0.llg/L), 90% ;優質胎牛血清，(GIBCO) 10%。
[0048]2YT 培養基:IL 內含 Trptone (OXID) 16g, Yeast Extract (OXID) IOg, NaC15g.[0049]2YT-AK培養基:2YT含100 μ g/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL卡那霉素.[0050]2YT-AG培養基:2YT含100 μ g/mL氨芐青霉素和2%葡萄糖.[0051]10XPBS:(購自北京索萊寶，Cat#P1022).[0052]5%MPBS 或 2%MPBS:含有 5% 或 2% 脫脂奶粉(OXID)的 PBS.[0053]0.1%PBST:含有 0.l%Tween20 (購自北京索萊寶)的 PBS.[0054]2%BSA:含有 2%BSA (購自 MP Biomedicals)的 PBS
[0055]Amp:氨芐青霉素(購自上`海生工).[0056]Kan:卡那霉素(購自上海生工).[0057]IPTG:(購自 Amresco).[0058]其他常見試劑如鹽酸，NaCl, Tris,甘氨酸等購自國藥集團化學試劑有限公司。
[0059]菌株:TG1，大腸桿菌(獲自中國微生物菌種網)；HB2151，大腸桿菌(獲自中國微生物菌種網)
[0060]質粒:p3XFLAG_CMV9(購自 Sigma-Aldrich) ；pHEN2 (獲自 Medical ResearchCouncil(UK))
[0061]實施例1⑶26胞外區蛋白的制備
[0062]本研究的目的在于通過重組質粒轉染真核細胞，G418抗性篩選獲得穩轉細胞株，分泌表達⑶26胞外區蛋白，經親和層析分離純化出⑶26胞外區蛋白。
[0063]CD26胞外區基因是選自Uniprot:P27487序列中氨基酸29-766位“Extracellular”區域的合成基因，將⑶26胞外區基因連入質粒p3XFLAG_CMV9，酶切位點為Hind III，Xba I，構建重組質粒(J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南.第三版.科學出版社.2002.P68)。
[0064]采用Lipofectamine LTX Reagent(購自Invitrogen)并按照說明書方法將含⑶26胞外區基因的重組質粒轉入HLF細胞。根據穩定轉染細胞系構建方法(Current Protocolsin Molecular Biology, P9.5.5)獲得CD26胞外區穩定表達細胞株，記為HLF-4D9，無血清大量培養，分泌表達⑶26胞外區蛋白，該蛋白帶有Flag標簽，采用ANT1-FLAG M2 AffinityGel (購自Sigma-Aldrich)，對無血清培養上清進行純化獲得⑶26胞外區蛋白純品，SDS-PAGE (圖2A)分析及Western Blot (J.S.博尼費斯農.精編細胞生物學實驗指南.科學出版社.2007.P177)鑒定(圖2B)，一抗為抗⑶26鼠抗(購自MBL)，二抗為兔抗鼠-HRP抗體(購自 life technology)。
[0065]結果如圖2所示，圖2A是SDS-PAGE對純化蛋白的鑒定圖，經一步親和層析獲得電泳純級目的蛋白大小的單條帶(Lane2),圖2B是對純化的蛋白進行Western Blot鑒定圖，Lane2所示條帶與SDS-PAGE鑒定結果蛋白大小一致，表明⑶26胞外區基因經克隆重組轉染真核細胞并表達，純化后獲得電泳純級CD26胞外區蛋白。
[0066]實施例2全人源抗⑶26單鏈抗體的分離
[0067]該單鏈抗體從人單鏈抗體噬菌體展示庫，采用CD26胞外區蛋白的固相親和篩選得到，該人單鏈抗體噬菌體展示庫由江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司構建。該含有人細胞產生的抗體的重鏈及輕鏈可變區的噬菌體展示庫構建自人外周血淋巴細胞，通過使用抗體可變區基因特異的引物進行首輪擴增，二輪擴增將重鏈輕鏈可變區采用柔性連接肽基因連接形成單鏈抗體基因，并將單鏈抗體基因克隆入質粒PHEN2中轉化大腸桿菌TGl，獲得IO8p.f.u.噬菌體單鏈抗體展示庫。(沈倍奮.重組抗體.科學出版社.2005.P107)
[0068]將該單鏈抗體庫原種培養到對數生長階段，用M13K07輔助噬菌體感染，在2YT-AK培養基中，30°C搖床培養過夜。·噬菌體用4%PEG/2.5M NaCl沉淀，并重懸于PBS中并測定抗體庫滴度，獲得滴度為IO11P.f.u的噬菌體單鏈抗體庫。(甄永蘇.抗體工程藥物.化學工業出版社.2002.P51)以PBS稀釋⑶26胞外區蛋白至50 μ g/mL ;包被至酶標板(Max1-sorp96, Nunc)中，同時設置空白對照孔(不含⑶26胞外區蛋白)，隨后進行封閉。將噬菌體單鏈抗體庫懸浮于2%MPBS，取100 μ L加入到封閉過的空白孔中，室溫放置60min后，加入到含有⑶26胞外區蛋白的孔中，室溫放置2h ；0.P/oPBST及PBS分別洗滌10次，加入IOOyL0.1M鹽酸(用甘氨酸調至pH2.2)，室溫振蕩IOmin, 15 μ LlM Tris (ρΗ9.0)用于迅速中和洗脫下來的噬菌體；中和后的噬菌體感染5mL對數期的大腸桿菌TG1，取IOOuL,做I~3次100倍系列稀釋，然后將系列稀釋物鋪TYE固體培養基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，剩余的菌液再加入20mL含2X 101QM13K07輔助噬菌體的2YT-AG進行擴增和制備噬菌體庫，用于下一輪篩選過程，共進行4輪篩選。
[0069]被展示在噬菌體顆粒表面的抗體片段被稱為噬菌體抗體，本實驗先通過多克隆噬菌體ELISA鑒定4輪篩選后⑶26特異性噬菌體抗體的富集情況，后通過單克隆噬菌體ELISA進一步鑒定挑選出髙親和力的噬菌體抗體。
[0070]多克隆噬菌體ELISA鑒定，包被抗原即I μ g/mL⑶26胞外區蛋白至酶標板，封閉后，取10 μ L每輪篩選后獲得的噬菌體，2%MPBS稀釋后加入到抗原包被酶條中。室溫孵育90min，洗滌后加入鼠抗M13噬菌體-HRP抗體(購自北京義翹神州生物技術公司)室溫孵育Ih，洗滌后，加入IOOyL TMB顯色液(購自AMRESC0)。室溫孵育IOmin后，IM稀硫酸終止反應。測定OD45tl和OD65tl，并以OD45tl-OD65tl作為最后檢測結果。如圖3A所示，以BSA包被的酶標板作為陰性對照，隨著篩選輪數增加，噬菌體抗體與CD26胞外區蛋白的結合增強，表明帶有CD26特異性抗體的噬菌體得到了明顯的富集。
[0071]單克隆噬菌體ELISA鑒定，隨機挑選第三輪第四輪篩選過程的滴度測定平板上挑取單克隆到96孔細菌培養板(購自Corning)中，每孔已經添加2YT培養基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，37°C培養至對數期，每孔加109p.f.u.M13K07輔助噬菌體37°C靜置感染30min，37°C培養lh。1800g離心lOmin，棄上清。將菌體沉淀重懸于200 μ L2YT-AK培養基，30°C搖床培養過夜。次日1800g離心IOmin獲得的含噬菌體的培養上清，用1/10體積的20%MPBS室溫孵育lh，再加入到包被有重組⑶26胞外區蛋白的酶標板中，ELISA鑒定(方法及試劑同多克隆噬菌體ELISA鑒定)。測定OD45tl和OD65tl，并以OD45tl-OD65tl作為最后檢測結果。選出讀數高的克隆進行DNA序列測定。圖3B顯示了部分單克隆噬菌體ELSIA的檢測結果，90%以上的單克隆顯示陽性結合作用，進一步表明通過4輪篩選，帶有⑶26特異性抗體的噬菌體得到了明顯的富集。從中挑選50個讀數高的單克隆測序，獲得核苷酸編碼序列如SEQ ID NO: 10所示的單鏈抗體(記為ZHB-2cF9)。所對應的單鏈抗體ZHB_2cF9的氨基酸序列為SEQ ID NO: 11。
[0072]實施例3抗⑶26單鏈抗體的可溶性表達及分離純化
[0073]pHEN2是一個雙功能噬菌粒載體，在表達檢測標簽(c-my tag)與外殼蛋白基因之間有一個琥珀型終止密碼子(Amber) TAG。如果噬菌體感染琥珀突變(SupE)抑制型菌株，如TG1，TAG密碼子被翻譯為谷氨酸，序列可以通讀翻譯，抗體片段與外殼蛋白p3融合表達于噬菌體表面；當噬菌體感染非琥珀突變抑制型菌株時，如HB2151，翻譯在TAG處終止，可得到可溶型表達的抗體片段。抗體片段C端帶有6XHis tag及c-myc tag,利于純化和檢測鑒定。ZHB-2cF9單鏈抗體采用大腸桿菌周質空間的可溶性表達，純化采用高滲透法提取細胞周質蛋 白，再利用鎳柱親和層析一步分離純化獲得純度較高的目的蛋白。
[0074]采用質粒小提試劑盒從菌體TGl中提取出含有編碼單鏈抗體ZHB_2cF9基因的質粒(記為2cF9-pHEN2)，用于轉化非抑制子大腸桿菌HB2151，轉化采用氯化鈣法制備和轉化感受態大腸桿菌HB2151(J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南.第三版.科學出版社.2002.P96)，所得轉化后菌株記為HB2151-2cF9。
[0075]HB2151-2cF9在2YT-AG培養基中，37°C培養至對數期時(OD6tltl=0.8)，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導過夜(16~20h)，表達可溶性單鏈抗體ZHB_2cF9。6000rpm，4°C離心15min，收集菌體，高滲溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA, pH8.0)重懸菌體，緩慢攪拌lh，4°C，1000Og離心lOmin，倒出上清進行鎳柱親和層析(購自GE)，純化步驟按照GE的標準操作流程進行，即采用含有5mM咪唑的平衡緩沖液(Tris50mM，NaC1500mM，pH7.5)平衡ImL鎳柱，10個柱體積后上樣，再次采用含有5mM咪唑的平衡緩沖液洗滌鎳柱上非特異性結合的雜蛋白，用含有50mM咪唑的平衡緩沖液洗滌非特異性雜蛋白，最后用含有IOOmM咪唑的平衡緩沖液洗脫目的蛋白。15%SDS-PAGE檢測收集的樣品，Western Blot進一步鑒定單鏈抗體，一抗為抗c-myc鼠抗(購自恩晶生物),二抗為兔抗鼠-HRP抗體。圖4A顯示純化后樣品中含有目的蛋白大小條帶(箭頭所指)，Western Blot (圖4B)鑒定結果與SDS-PAGE —致，表明經過鎳柱一步親和層析ZHB-2cF9單鏈抗體得到了較好的純化。
[0076]實施例4抗⑶26單鏈抗體與⑶26胞外區蛋白結合的Immunoblot鑒定[0077]該實驗目的是為了驗證篩選獲得的抗⑶26單鏈抗體ZHB_2cF9與⑶26胞外區蛋白的特異性結合作用。重組⑶26胞外區蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干轉法lh，將蛋白轉印到NC膜(購自Millipore);轉印結束，將膜在5%MPBS中室溫封閉Ih ;用5%MPBS稀釋ZHB-2cF9單鏈抗體至I μ g/mL,室溫孵育lh，TBS洗滌3遍；用鼠anti_Myc抗體(購自恩晶生物)室溫孵育lh，TBS洗滌3遍；用兔抗鼠-HRP 二抗孵育Ih后凝膠成像儀(ImageQuantLAS4000, GE)曝光，結果如圖5所示，在⑶26胞外區目的蛋白大小處有明顯條帶，表明抗⑶26單鏈抗體ZHB-2cF9可以特異性與⑶26胞外區蛋白結合。
[0078]實施例5可溶性單鏈抗體ZHB_2cF9與人間皮瘤細胞NC1-H2452的免疫熒光
[0079]CD26在人間皮瘤細胞NC1-H2452細胞表面高表達(Inamoto et al.(2007)ClinCancer Res, 13，4191-200)，本實驗通過鑒定ZHB_2cF9與NC1-H2452細胞的免疫熒光結合情況，進一步驗證篩選獲得的單鏈抗體ZHB-2cF9可以與高表達⑶26的NC1-H2452細胞特異性結合，同時證明ZHB-2cF9可以與細胞表面的CD26特異性結合。
[0080]將人間皮瘤細胞NC1-H2452消化，離心后重懸，I X IO5/孔包被24孔板讓細胞貼壁12h，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，5%MPBS室溫封閉lh。PBS洗3次，不同孔分別加入抗體ZHB-2cF9或陰性對照抗體IgG (鼠)(購自life technology)，37°C孵育2h，以PBS洗滌3次，ZHB-2cF9抗體孔加入鼠抗myc-FITC抗體(購自Sigma-Aldrich),對照抗體孔加入羊抗鼠熒光二抗(購自life technology)，37°C孵育lh，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡(Olympus)觀察并拍照，結果如圖6所示ZHB-2cF9單鏈抗體與NC1-H2452有明顯的熒光顯色，而對照抗體無明顯熒光顯色，表明篩選獲得的單鏈抗體ZHB-2cF9可以與高表達⑶26的NC1-H2452細胞特異性結合，進一步證明ZHB-2cF9可以與細胞表面的CD26特異性結合。
[0081]實施例6抗⑶26單 鏈抗體對人間皮瘤細胞NC1-H2452的粘附抑制作用
[0082]⑶26通過與細胞外基質蛋白(ECM)的結合，介導腫瘤細胞的粘附作用，纖連蛋白是常見的ECM之一，CD26與纖連蛋白發生特異性結合作用，從而介導細胞的粘附，而這種結合作用可被抗 CD26 抗體所阻斷(Inamoto et al.(2007)Clin Cancer Res, 13，4191-200)，從而阻斷腫瘤細胞的粘附作用。
[0083]YSllO為Y’s Therapeutics公司開發的抗0)26單克隆鼠抗的人源化抗體，目前已開展抗⑶26高表達腫瘤的臨床實驗。根據YSllO抗體的重鏈及輕鏈可變區基因序列(CN101282994)，全合成構建YSllO的單鏈抗體型式，即scFv-YSllO作為本實驗的陽性對照，表達及純化過程同ZHB-2cF9。
[0084]粘附實驗采用24孔板，五組平行實驗，每組4個復孔，其中一組為空白對照組(Blank),直接用2%BSA封閉，其余四組用10 μ g/mL纖連蛋白(購自BD Biosciences)室溫20 ~25°C包被 90min。PBS 洗 3 次后加入 2%BSA37°C封閉 Ih。同時將 10 X IO5 個 NC1-H2452細胞用PBS洗3次后分成等量的五組，三組為抗體試驗組，細胞分別用含50 μ g/mL的ZHB-2cF9，陽性對照scFv-YSllO，陰性對照抗體IgG (鼠)的RPM1-1640培養基處理2h，另外兩組為對照組(Binding組，Blank組)用與試驗組含等量PBS的RPM1-1640培養基處理2h后，等分加入五組封閉后的24孔板中，培養箱繼續培養12h。用PBS洗孔3次，洗掉未粘附的細胞，每孔加入270 μ L RPM1-1640及30 μ L的CCK-8 (購自同仁化學研究所)，37°C繼續培養30min，在酶標儀450nm波長處測定光吸收值(0D值)，OD值的大小與活細胞數量成正比，據此計算細胞的粘附率。細胞粘附率(％)=[0D (抗體試驗組)-OD (Blank組)]/[0D(Binding組)-OD (Blank組)]。圖7顯示，用scFv-YSllO及ZHB_2cF9處理后的細胞對纖連蛋白的粘附下降，而陰性對照抗體IgG (鼠)則不影響細胞粘附，表明ZHB-2cF9可以抑制CD26對ECM的結合，抑制CD26介導的腫瘤細胞粘附效應，抑制了腫瘤細胞的向其他器官的
侵襲轉移。
[0085]實施例7抗⑶26單鏈抗體對人間皮瘤細胞NC1-H2452的增殖抑制作用
[0086]將NC1-H2452細胞I X IO4/孔接種96孔細胞培養板，100 μ L/孔，培養12h后用1%小牛血清培養基(含作用抗體)替換原培養基。將培養的細胞分為三組，分別對應加入的作用抗體為:不同濃度的單鏈抗體ZHB-2cF9，陽性對照scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG(鼠)。作用抗體終濃度分組為0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每組5個實驗復孔。培養箱繼續培養48h，觀察細胞生長狀況后每孔加入10 μ L的CCK-8 (購自同仁化學研究所)，37°C繼續培養30min，在酶標儀450nm波長處測定光吸收值(OD值)，OD值的大小與活細胞數量成正比，據此計算單鏈抗體ZHB-2cF9對細胞增殖的抑制率。如圖8所示，ZHB-2cF9及陽性對照scFv-YSllO對NC1-H2452均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，ZHB-2cF9與陽性對照的活性相當，陰性對照IgG對NC1-H2452沒有明顯抑制作用，表明ZHB_2cF9可以對高表達⑶26的間皮瘤細胞增殖有抑制作用，可用作⑶26高表達腫瘤的潛在治療藥物，且相比于陽性對照scFv-YSllO，ZHB-pA12為全人源化抗體，消除了外源蛋白對人體免疫系統的影響。
[0087]實施例8抗⑶26單鏈抗體對人結腸癌細胞HCTl 16的增殖抑制作用
[0088]除人間皮瘤細胞NC1-H2452外，高表達CD26的結腸癌細胞系HCT116 (Abe etal.(2011)BMC Cancer, 2011，11:51)也被用于考察單鏈抗體對細胞的增殖抑制效果。
[0089]將HCTl 16細胞8 X IO4/孔接種96孔細胞培養板，100 μ L/孔，培養12h后用1%小牛血清培養基(含作用抗體)替換原培養基。將培養的細胞分為三組，分別對應加入的作用抗體為:不同濃度的單鏈抗體ZHB-2cF9，陽性對照scFv-YSllO及陰性對照抗體IgG (鼠)。作用抗體終濃度分組為0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每組5個實驗復孔。培養箱繼續培養48h，觀察細胞生長狀況后每孔加入10 μ L的CCK-8 (購自同仁化學研究所)，37°C繼續培養30min，在酶標儀450nm波長處測定光吸收值(OD值)，OD值的大小與活細胞數量成正比，據此計算單鏈抗體ZHB-2cF9對細胞增殖的抑制率。如圖9所示，ZHB_2cF9及陽性對照scFv-YSllO對HCT116均有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性，ZHB-2cF9與陽性對照的活性相當，陰性對照IgG對HCT116沒有明顯抑制作用，表明ZHB-2cF9可以對高表達⑶26的結腸癌細胞增殖有抑制作用，再次證明ZHB-2cF9可用作⑶26高表達腫瘤的潛在治療藥物，且相比于陽性對照scFv-YSllO，ZHB-pA12為全人源化抗體，消除了外源蛋白對人體免疫系統的影響。
【權利要求】
1.一種抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段特異性結合人CD26，所述抗體或其片段的氨基酸序列包括選自含有SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8—組序列的6個互補決定區的任何區域的單克隆抗體或其片段或其片段的偶聯物，或通過對其氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段的重鏈可變區的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的互補決定區，和/或所述抗體或其片段的輕鏈可變區的氨基酸序列含有如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的互補決定區。
3.如權利要求1所述的抗CD26抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗體或其片段的輕鏈可變區的氨基酸序列如 SEQ ID NO:5 所示。
4.一種抗⑶26的單鏈抗體,其特征在于,所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
5.一種編碼如權利要求4所述的單鏈抗體的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
6.一種含有如權利要求5所述的核苷酸序列的表達載體。
7.一種含有如權利要求6所述表達載體的重組宿主菌。
8.—種生產如權利要求4所述單鏈抗體的方法，包括: 1)在合適的條件下培養如權利要求7所述的重組宿主菌并表達抗體； 2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
9.如權利要求1至3中任一項所述的抗體或其片段在制備抑制CD26高表達的腫瘤細胞增殖或侵襲轉移的藥物中的新用途。
10.如權利要求4所述的單鏈抗體在制備抑制CD26高表達的腫瘤細胞增殖及侵襲轉移的藥物中的新用途。
【文檔編號】C12N1/21GK103709251SQ201310704444
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】馬永, 周雅瓊, 高云霞, 黃粱敏, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司