miRNA分析方法

miRNA分析方法
【專利摘要】本發明提供了用于miRNA表達分析的無PCR、多路連接檢驗，該檢驗在單一反應中產生高度定量、10-100路的miRNA譜。本發明的方法使用2步連接檢驗來產生miRNA特異性連接產物的陣列，該陣列能夠通過大小鑒別方法例如凝膠電泳或單分子分離來解碼和定量。一種實施方式是低成本檢驗，其能夠使用在幾乎所有的分子生物學實驗室中可用的標準工具來進行。該檢驗僅要求凝膠設備和閱讀器(reader)用于檢測。其它實施方式包括磁珠和其它大小排除設備大小排阻設備的使用，其給出日益更高的靈敏度、較低的樣品消耗、以及減少的處理步驟。
【專利說明】miRNA分析方法
[0001] 相關申請的引用
[0002] 本申請要求2012年2月14日提交的美國臨時專利申請號61/598, 513的權益，其 為了所有目的通過引用方式特此并入，如同在本文完全闡述。
[0003] 政府權益的聲明
[0004] 本發明是在經費號1R01CA155305、1R43GM103360和1U54CA151838下，以美國政府 的支持做出的。美國政府在本申請具有一定的權利。
[0005]發明背景
[0006] 微RNA(miRNA)是短的、非編碼RNA，在細胞過程例如分化和疾病狀態例如癌癥中， 具有貫穿基因表達的廣泛作用。揭露這些分子在發育和腫瘤發生中的作用是對穩健的、新 的生物標志物和潛在疾病治愈的發現的關鍵步驟。
[0007] 分析miRNA表達的現有方法由基于單目標PCR的方法和高度多路的陣列的方法組 成。PCR非常靈敏，但是只能分析單一目標。因此，miRNA板的檢測要求大量的平行反應， 大大地增加了成本、樣品消耗、和復雜性。現有的基于陣列的方法在單一反應中能夠分析數 百miRNA，但是具有每個樣品的高成本、低樣品通量、和有限的靈敏度。這些有前景的miRNA 板的成功的臨床驗證和轉化將要求，以成本有效、高通量和穩健方式準確定量10-100種 miRNA。沒有現有技術能夠彌合高度多路但是昂貴的基于陣列的方法與靈敏但是單路的 qPCR方法之間的這種分歧。目前，沒有方法能夠實現在罕見的臨床樣品中低成本miRNA表 達譜（profiling)所需的高靈敏度、多路檢測。
[0008] 因此，對于用于miRNA表達分析的低成本、無PCR、多路的陣列存在需求，其在單一 反應中以少于目前現有方法的時間進行高度定量、10-100路的miRNA表達譜。
[0009] 發明概沭
[0010] 為了解決這一需求，發明人已經開發了一種靶向短RNA序列例如miRNA用于RNA 表達譜（RNAprofiling)的低廉和易得的多路連接檢驗。
[0011] 根據一種或更多種實施方式，本發明提供了用于miRNA分析的新的組合物和方 法。這些創造性的組合物和方法共同命名為"Ligo-miRTM"檢驗。
[0012] 在稱為"Ligo-miREZ檢驗"的一個實施方式中，該實施方式平衡了罕見臨床樣品 中的miRNA的無PCR和無RT的分析的連接機制的高度多路能力和高特異性。本發明的方法 使用2步連接方法來創建快速（約4小時）、靈敏（<1(T18摩爾）、和高度特異性（>1000:1) 的miRNA表達譜工具。與占主導地位的微陣列技術比較，檢驗成本將少20倍，檢驗時間將 短5倍，以及靈敏度將高100倍。
[0013] 本發明的組合物和方法使用新的2步連接方法來產生大小編碼的miRNA連接產 物，該產物能夠通過凝膠分離（Ligo-miREZ)、單分子分析（稱為"Ligo-miRHD"）、毛細管 電泳、色譜法或任何其它核酸分篩方法來單獨鑒定和定量。50個循環的線性擴增（非-PCR) 能夠被合并到第二連接步驟中來提高靈敏度，同時保留極好的線性。
[0014] 在一種或更多種實施方式中，本發明提供了用于檢測受試者的血液、血清、唾液、 尿液、糞便、或其它體液中miRNA生物標志物的方法，其包含無創診斷或預后技術，其足夠 靈敏來在哺乳動物受試者的生物樣品中檢測或預測疾病狀態的結果或響應，例如致瘤的、 癌性的、惡變前的或化生改變。
[0015] 在一種或更多種實施方式中，本發明提供了用于檢測受試者組織中miRNA生物標 志物的方法，其包含診斷或預后技術，其足夠靈敏來在哺乳動物受試者的生物樣品中檢測 或預測疾病狀態的結果或響應，例如致瘤的、癌性的、惡變前的或化生改變。
[0016] 根據一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的目標 RNA的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品；b)向a)的樣品加 入足夠量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶；c)通過孵育以及允許銜接子探針連接到 樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的3'-0H端，進行第一連接步驟；d)向b)的樣品加 入足夠量的共同探針和鑒別探針，以及足夠量的第二連接酶；e)通過孵育c)的樣品足夠量 的時間來引起d)的探針與b)的連接的感興趣的目標RNA和銜接子探針的雜交，并允許鑒 別探針和共同探針之間的連接，進行第二連接步驟；以及f)通過一種或更多種大小鑒別方 法分析產物。
[0017] 根據另一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的目標 RNA的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品；b)向a)的樣品加 入足夠量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶以及允許銜接子探針連接到樣品中一種或 更多種感興趣的目標RNA的3'-0H端；c)向b)的樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針， 以及足夠量的第二連接酶；d)熱循環c)的樣品足夠量的時間來引起c)的探針與b)的連 接的感興趣的目標RNA和銜接子探針雜交以及允許鑒別探針和共同探針之間的連接；e)通 過凝膠電泳分離d)的產物；f)通過凝膠成像檢測e)的產物。
[0018]根據再一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的miRNA的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的miRNA的樣品；b)向a)的樣品加 入足夠量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶以及允許銜接子探針連接到樣品中一種或 更多種感興趣的miRNA的3'-0H端；c)向b)的樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針，以 及足夠量的第二連接酶；d)熱循環c)的樣品足夠量的時間來引起c)的探針與b)的連接 的感興趣的miRNA和銜接子探針雜交以及允許鑒別探針和共同探針之間的連接；e)通過大 小鑒別分析產物。
[0019] 根據一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的miRNA 的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的miRNA的樣品；b)向a)的樣品加入足夠 量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶以及允許銜接子探針連接到樣品中一種或更多種 感興趣的miRNA的3'-0H端；c)向b)的樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針，以及足夠 量的第二連接酶；d)熱循環c)的樣品足夠量的時間來引起c)的探針與b)的連接的感興 趣的miRNA和銜接子探針的雜交以及允許鑒別探針和共同探針之間的連接；e)使用單分 子游離液流體動力學分離（single molecule free solution hydrodynamic separation， SML-FSHS)分離d)的產物；f)通過在所得的色譜中峰的分析檢測e)的產物。
[0020] 根據另一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的miRNA的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的miRNA的樣品；b)向a)的樣品加 入足夠量的與多個磁性顆粒結合的銜接子探針和足夠量的第一連接酶以及允許與磁性顆 粒結合的銜接子探針連接到樣品中一種或更多種感興趣的miRNA的3' -0H端；c)磁性地分 離具有連接到結合的銜接子探針的感興趣的miRNA的顆粒；d)洗滌c)的顆粒并在緩沖液 中重懸顆粒；e)向d))的顆粒的樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針，以及足夠量的第 二連接酶，和水；f)熱循環e)的樣品足夠量的時間來引起e)的探針與b)的連接的感興趣 的miRNA和銜接子探針雜交以及允許鑒別探針和共同探針之間的連接；g)通過凝膠電泳分 離f)的產物；h)通過凝膠成像檢測g)的產物。
[0021] 根據另一種實施方式，本發明提供了銜接子探針對短RNA序列的高效和低偏差 (bias)連接的方法，包括：a)獲得包含一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品；b)向樣品 加入飽和量的銜接子探針；c)向樣品加入飽和量的連接酶；d)向樣品加入飽和量的PEG; 以及e)通過孵育進行連接步驟以及允許銜接子探針連接到樣品中一種或更多種感興趣的 目標RNA的3'-0H端。
[0022] 根據一種實施方式，本發明提供了診斷受試者中疾病的存在的方法，包含：從受試 者獲得生物樣品以及使用本發明的方法測量一種或更多種感興趣的miRNA的表達水平，其 與疾病或狀態的存在關聯。
[0023] 根據一種實施方式，本發明提供了產生受試者中至少一種或更多種腫瘤的miRNA 譜的方法，包含：從受試者獲得生物樣品以及使用本發明的方法測量一種或更多種感興趣 的miRNA的表達水平，其與特定癌癥譜關聯。
[0024]附圖簡沭
[0025] 圖1顯示了本發明的整體Ligo-miRTM分析方法的圖解。
[0026] 圖2顯示了使用本發明的無PCR、6路Ligo-miRTM檢驗，使用單一反應進行 let_7a、miR-16、miR-21、miR_26a、miR_29b、和miR_34a的多路檢測的凝膠。僅當正確的 miRNA目標存在時，相應長度編碼的連接產物才被形成，使得能夠通過大小進行鑒定。在探 針組之間沒有觀察到串擾。
[0027] 圖3顯示了滴定的miRNA的6路分析的典型的凝膠圖像，其中所有6種miRNA目 標是同時連續稀釋的。
[0028] 圖4描繪了使用Ligo-miREZ獲得的miR-21的滴定曲線。實現了高靈敏度 (〈2. 5xl(T18摩爾）、極好的線性、和高重復性。顯示的是來自3個獨立的試驗的平均值和標 準偏差。分子流體Ligo-miRHD將使得能夠甚至更高的么摩爾（yoctomole)水平靈敏度 (1〇-23 摩爾）。
[0029] 圖5描繪了用于Ligo-miRHD分析的SML-FSHS微流體裝置的圖解，其是由硅向玻 璃的陽極鍵合制造的。分離在緩沖液填充的蜿蜒的分離通道中進行，其后，基于圓柱形照明 共焦光譜（cylindricalilluminationconfocalspectroscopy，CICS)的單分子檢測被用 于分析分離的峰。為了 100%質量檢測效率，CICS激光片覆蓋整個通道的橫截面（插圖）。 通道的尺寸通過平衡硅蝕刻深度與二氧化硅的厚度控制（右）。
[0030] 圖6描繪了使用Ligo-miR HD進行的20路miRNA分析的典型的色譜圖。SML-FSHS 被用于通過大小鑒定Ligo-miR TM產物，以及通過單分子計數對其定量。每一個Ligo-miR TM產物基于其可變長度編碼序列被鑒定為大小特異性峰。數量通過Alexa-647標記的單分 子計數確定。
[0031] 圖7顯示了本發明的Ligo-miR珠實施方式的圖解。本實施方式使用磁珠和2步連 接將miRNA捕獲和多路檢測整合到單一流線方法（singlestreamlinedprocess)中。第 一連接從血清捕獲miRNA，以及形成在珠表面上集中的miRNA模板。磁性分離去除所有的背 景雜質。第二連接包括50倍線性擴增，以及產生單鏈miRNA特異性連接產物，其通過單分 子分析被鑒定和定量。
[0032] 圖8顯示了僅使用高效和低偏差的第一步驟連接，來自銜接子探針與miRNA連接 的凝膠圖像以及捕獲效率分析。（a)Cy3標記的miRNA使用優化的方案被捕獲。所有的miRNA 被高效地一致捕獲。（c) (a)的定量的miRNA捕獲效率。
[0033] 發明詳沭
[0034] 本文使用的"核酸"包括"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸分子"，以及一般指DNA 或RNA的聚合體，其可以是單鏈的或雙鏈的、合成的或從自然資源獲得的（例如分離和/或 純化），其能夠含有天然、非天然或變化的核苷酸，以及其能夠含有天然、非天然或變化的核 苷酸間鍵合，例如氨基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，代替在未修飾的寡核苷酸的核苷酸之間 發現的磷酸二酯鍵。一般優選的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位、和/或取代。然而， 在一些情況中，如本文討論的，核酸包含一個或更多個插入、缺失、倒位、和/或取代可以是 合適的。
[0035] 在一種實施方式中，本發明的核酸是重組的。如本文使用的，術語"重組"是指（i) 通過加入天然或合成核酸區段到在活細胞中能夠復制的核酸分子而在活細胞外構建的分 子，或（ii)從在上述（i)中描述的那些分子的復制得到的分子。為了本文的目的，復制可 以是體外復制或體內復制。
[0036] 如本文使用的，術語"感興趣的目標RNA"可以是任何短的核糖核酸序列。這樣的 目標RNA序列的長度是從約8到約100個核苷酸。在一些實施方式中，目標RNA可以長于 100個核苷酸。目標RNA的例子包括在診斷和治療疾病和其他用途中有用的miRNA、siRNA 和其它RNA序列。根據一種實施方式，感興趣的目標RNA是miRNA。
[0037] 本發明的實施方式中用作引物的核酸可以基于化學合成和/或酶連接反應使用 本領域中已知的程序被構建。參見，例如，Sambrook等（編著），MolecularCloning,A LaboratoryManual,第 3 版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001)和 Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates andJohnWiley&Sons，NY(1994)。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或不同修飾的 核苷酸化學合成，不同修飾的核苷酸被設計來增加分子的生物穩定性或來增加雜交形成的 雙鏈體的物理穩定性（例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸）。可用于產生核酸 的修飾的核苷酸的例子包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧 啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基）尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫 尿苷、5-羧甲基氨甲基尿啼陡、二氫尿啼陡、0 -D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-異戊烯 腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2, 2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、 3_甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、 5_甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基que〇Sine、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、 5-甲氧基尿啼陡、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺噪呤、尿啼陡-5-氧乙酸（v)、wybutoxosine、 假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、 5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3- (3-氨基-3-N-2-羧丙基）尿嘧啶、和2, 6-二 氨基嘌呤。可選擇地，本發明的核酸的一種或更多種可以從公司例如IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)和Genscript(Piscataway，NJ)購買。
[0038] 本文用到的術語"分離與純化"是指基本上沒有與其它蛋白或多肽的締合的蛋白， 例如，作為通過使用抗體或其它方法已經從細胞和其它污染物中分離出來的天然存在的蛋 白或作為重組宿主細胞培養的純化產物。
[0039] 本文用到的術語"生物活性"是指具有天然存在的分子的結構、調節、或生化功能 的酶或蛋白。
[0040] 如本文使用的，術語"受試者"是指任何哺乳動物，包括，但不限于，嚙齒目 (Rodentia)的哺乳動物，例如小鼠和倉鼠，和兔形目（Logomorpha)的哺乳動物，例如兔。優 選地，哺乳動物來自食肉目（Carnivora),包括貓科動物（貓）和犬科動物（狗）。更優選 地，哺乳動物來自偶蹄目（Artiodactyla),包括牛科（奶牛）和豬科（豬）或奇蹄目），包 括馬科動物（馬）。最優選地，哺乳動物來自靈長目、Ceboids、或Simoids(猴）或類人猿 目（人類和猿猴）。特別優選的哺乳動物是人類。
[0041] 根據一種實施方式，本發明提供了用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的目標 RNA的方法，包含：a)獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品；b)向a)的樣品加入 足夠量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶；c)通過孵育以及允許銜接子探針連接到樣 品中一種或更多種感興趣的目標RNA的3'-0H端，進行第一連接步驟；d)向b)的樣品加入 足夠量的共同探針和鑒別探針，以及足夠量的第二連接酶；e)通過孵育c)的樣品足夠量的 時間來引起c)的探針和b)的連接的感興趣的目標RNA和銜接子探針的雜交，以及允許鑒 別探針和共同探針之間的連接，進行第二連接步驟；f)通過大小鑒別方法分析d)的產物。 [0042] 根據本發明方法使用的大小鑒別方法可以是本領域已知的任何技術，諸如，例如， 凝膠電泳、毛細管電泳、高壓液相色譜法、質譜法、熒光光譜法、以及其他方法。
[0043] 本領域普通技術人員將理解，本文公開的創造性方法不僅能夠檢測感興趣的目標 RNA，還能夠定量樣品中目標RNA的數量。感興趣的目標RNA的定量允許闡明樣品中目標RNA的表達水平。
[0044] 在上面方法的一些實施方式中，銜接子探針在3'端結合到磁珠。
[0045] 在上面方法的一些替代的實施方式中，在c)第一連接步驟之后進行磁性分離、洗 滌、和重懸。本領域普通技術人員將理解，磁珠和在分離中使用它們的方法是本領域中常用 的。
[0046] 根據一種或更多種實施方式，本發明的方法可包括在c)第一連接步驟和e)第二 連接步驟之后進行的熱變性步驟。熱變性，如本文使用的，可包括直接加熱和孵育樣品設定 的時間段，或者能夠通過使用在核酸領域常用的熱循環裝置完成。在一些實施方式中，孵育 步驟包含熱循環，其是在45°C到約95°C變性約0. 25到約5分鐘，之后在4°C到約80°C連接 約0. 25到約100分鐘的1-100個循環。在一種優選的實施方式中，孵育步驟包含熱循環， 其是在95 °C變性約30秒，之后在45 °C連接約30秒的1-100個循環。
[0047] 根據一種或更多種實施方式，本發明的方法還能包括反應產物的PCR擴增，其在 e)第二連接步驟之后但在f)大小鑒別之前進行。
[0048] 在包括PCR擴增的可選擇的實施方式中，一個PCR引物是對VLCS序列反義的，以 及第二引物是對銜接子探針序列反義的。
[0049] 根據一種或更多種實施方式，本發明的方法能夠被用來鑒定感興趣的目標RNA，包 括包含8到150個核苷酸之間的長度的miRNA、siRNA，或其它RNA序列。
[0050] 本領域普通技術人員將理解，本發明的方法包含兩個一般性步驟。第一步驟為第 一連接步驟，其中感興趣的目標RNA與銜接子探針一起孵育，以及允許銜接子探針連接到 樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的3' -0H端。第二一般性步驟為第二連接步驟，其 中加入樣品、足夠量的共同探針和鑒別探針、和足夠量的第二連接酶，以及孵育樣品足夠量 的時間來引起探針與連接的感興趣的目標RNA和銜接子探針之間的雜交，以及允許鑒別探 針和共同探針之間的連接。根據一些實施方式，這些方法的兩個步驟可以被分離和在基本 上不同的時間進行。例如，第一步驟可以被應用到樣品，以及儲存用于以后使用第二步驟的 分析。
[0051] 在可選擇的實施方式中，只有第一步驟被應用到樣品，然后可以應用可選擇的分 析方法，例如PCR、qPCR、微陣列、測序、或本領域已知的其他方法。由于它們的短的長度，幾 乎所有的微RNA分析技術的第一步是通過poly(A)-加尾或，更常見地，連接來延伸微RNA 目標。通過銜接子探針連接的微RNA捕獲是在大多數基于PCR、微陣列，多路、和測序的檢驗 中的普遍的第一步驟。然而，這一連接能對微RNA表達譜分析的結果引入實質的偏差。本 發明實施方式使得能夠使用許多技術的任一種下游評估高保真的表達譜，由于高效和低偏 差銜接子連接，這大大免除了連接偏差的模糊效果。主要檢驗參數例如PEG%、銜接子探針 濃度、連接酶類型、連接酶數量、孵育時間、孵育溫度、和銜接子探針設計，被用于減少連接 偏好。
[0052] 在一種可選擇的實施方式中，100-1000單位的連接酶、l_12pmol腺嘌呤化的銜 接子探針、10_40%的？￡68000或？￡64000、以及141?隱連接反應緩沖液（他￥￡叩1 &11(1 Biolabs)被加入到1-10,OOOng的總RNA來形成5-100iiL的反應混合物。該反應在4-95°C 孵育0. 25-24小時。潛在的連接酶包含T4RNA連接酶1、T4RNA連接酶2截短型、T4RNA連 接酶2K227Q、T4RNA連接酶2截短型KQ和Mth.RNA連接酶。
[0053] 在一種可選擇的實施方式中，200-400單位的T4RNA連接酶2截短型K227Q、 4-8pmol腺嘌呤化的銜接子探針、20-30%的PEG8000或PEG4000,以及T4RNA連接反應緩沖 液（NewEnglandBiolabs)被加入到100-1000ng的總RNA來形成10-30iiL的反應混合物。 反應在4-37 °C孵育1-8個小時。
[0054] 在一種可選擇的實施方式中，300單位的T4RNA連接酶2截短型K227Q、6pmol腺嘌 呤化的銜接子探針、25%的PEG8000、以及T4RNA連接反應緩沖液（NewEnglandBiolabs) 被加入到500ng的總RNA來形成20iiL的反應混合物。反應在25°C孵育4個小時。
[0055] 在一種可選擇的實施方式中，銜接子探針包括DNA堿基。在另一種實施方式中，銜 接子探針包括DNA和RNA堿基的混合物。在再一種實施方式中，銜接子探針在連接位點處 或接近連接位點處包括RNA堿基。如圖8所示，本方法能夠實現跨20路miRNA板的高效 (85%的平均捕獲效率）和低偏差（11%CV)。之前沒有實現過這樣的高效和低偏差。通過 使用基本上高于通常推薦的PEG8000水平（25% vs. 15% )、飽和銜接子探針水平（> 6pmol 對于500ng的總RNA)、以及飽和酶量（彡300單位對于500ng的總RNA)，連接效率被大大 增強，以及偏差被顯著抑制。銜接子探針序列的例子在表1中給出。
[0056] 在可選擇的實施方式中，只有第二步驟被應用到樣品，以及可選擇的分析方法預 先被應用到微RNA，例如逆轉錄或poly(A)加尾。
[0057] 根據本發明的一種或更多種實施方式，可以理解使用本文提供的方法可進行癌癥 診斷的類型不必要限制。為了本文的目的，該癌癥可以是任何癌癥。如本文使用的，術語 "癌癥"是指由不正常的和不受控制的細胞分裂導致的任何惡性生長或腫瘤，其可以通過淋 巴系統或血流擴散至身體的其他部位。
[0058] 癌癥可以是轉移性癌癥或非轉移性（例如，局部的）的癌癥。如本文使用的，術語 "轉移性癌癥"指其中癌癥的細胞已經轉移的癌癥，例如，癌癥特征在于癌細胞的轉移。轉移 可以是局部轉移或遠端轉移，如本文描述的。
[0059] 其中使用本發明的方法對miRNA和其它RNA的分析可以被應用的其他疾病或狀況 包括心血管疾病、肝臟疾病、神經性紊亂、精神紊亂、糖尿病、膿毒癥、關節炎、病毒性感染、 阿爾茨海默病、和免疫系統紊亂。
[0060] 如本文使用的，術語"治療"、和"預防"還有由此產生的詞，不必意味著100%或完 全治療或預防。而是，存在本領域普通技術人員認識到其具有潛在的益處或治療效果的不 同程度的治療或預防。在這一方面，本發明方法能夠提供在哺乳動物中的任何水平任何數 量的診斷、分期、篩選、或其他患者管理，包括治療或預防癌癥。此外，本發明的方法提供的 治療或預防可以包括被治療或被預防的疾病，例如，癌癥，的一種或更多種狀況或癥狀的治 療或預防。另外，為了本文的目的，"預防"可包含延遲疾病或其癥狀或狀況的發作。
[0061] 本文用到的"互補（Complement) "或"互補性（complementary) "指核酸可以 是指在核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或 Hoogsteen喊基配對。
[0062] 本文在兩種或更多種核酸或多肽序列的上下文用到的"相同的"或"同一性"可以 是指序列有特定百分比的殘基跨特定的區域是相同的。百分比可以如下被計算：通過最佳 地比對兩種序列，比較跨特定區域的兩種序列，確定兩種序列中出現相同殘基的位置的數 量來得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以特定區域中的位置的總數目，以及將結 果乘以100來得到序列同一性的百分比。在兩條序列是不同長度的或比對產生一種或更多 種交錯末端，以及比較的特定區域僅包括單一序列的情形中，單一序列的殘基被包括在分 母中，而不是計算的分子中。當比較DNA和RNA時，胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)可以被認為 相同。同一性能夠手動地進行，或通過使用計算機序列算法例如BLAST或BLAST2. 0進行。
[0063] 本文使用的"探針"可指能夠通過一種或更多種類型的化學鍵，通常是通過互補堿 基配對，通常通過氫鍵形成，結合到互補序列的目標核酸的寡核苷酸。取決于雜交條件的嚴 格性，探針可結合缺少與探針序列的完全互補性的目標序列。可存在任何數量的堿基對錯 配，其將干擾本文描述的目標序列和單鏈核酸之間的雜交。然而，如果，突變數大到即使是 最嚴格的雜交條件下也沒有雜交能夠發生，該序列不是互補的目標序列。探針可以是單鏈 或部分單鏈和部分雙鏈。探針的鏈性由目標序列的結構、組成和性質所決定。探針可以被 直接標記或間接標記，例如以生物素標記，后續鏈霉親和素復合體可與其結合。
[0064] 本文使用的"基本上互補"可指第一序列與第二序列的互補序列跨8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100 或更多個核苷酸的區域至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 97%、98%或99%相同，或這兩個序列在嚴格雜交條件下雜交。
[0065] 本文使用的"基本上相同"可指第一序列與第二序列跨8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或 更多個核苷酸或氨基酸的區域至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、 98%或99%相同，或對于核酸，如果第一序列與第二序列的互補序列基本上互補。
[0066] 本文使用的"目標"可指寡核苷酸或其部分或片段，其可在嚴格的雜交條件下被一 種或更多種探針結合。本文使用的"目標"也可指特定miRNA或其部分或片段，其可在嚴格 的雜交條件下被一種或更多種探針結合。
[0067] 本發明的核酸還可包含miRNA或其變體的序列。miRNA序列可包含13-33、18-24 或 21-23 個核苷酸。miRNA 可包含共至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90 以及高達100個核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的前13-33個核苷酸。miRNA的 序列也可以是pre-miRNA的最后13-33個核苷酸。
[0068] 本文使用的術語"第一連接酶和/或第二連接酶"指根據本發明的方法能夠使用 的許多不同類型的連接酶。這樣的連接酶的例子包括大腸桿菌（E.Coli)DNA連接酶、Taq DNA連接酶、9°NDNA連接酶、T4DNA連接酶、T4RNA連接酶1、T4RNA連接酶2、Ampligase、 天然的DNA/RNA連接酶的遺傳修飾的變體，以及本領域已知的其他。
[0069] 根據一種或更多種實施方式，試劑例如連接酶和探針的濃度可以是"飽和量"。如 本文用到的，飽和量的試劑（酶、探針、反應時間等）是以下點：增加超過該點使得反應效率 不再增加。該點通過如下被發現：摻加每種miRNA到總RNA的背景中，并緩慢增加參數（酶、 探針、反應時間），直到不再觀察到miRNA捕獲效率增加。關鍵性的是這在摻加到總RNA背 景時而不是純緩沖液進行，因為通過使用總RNA背景獲得的最佳的條件與通過使用緩沖液 背景獲得的那些非常不同。
[0070] 根據一種或更多種實施方式，在本發明的方法中能夠使用添加劑。例如，添加劑諸 如PEG或DMS0被加入來增加連接效率和減少連接偏差。
[0071] 根據一種或更多種實施方式，內部對照被加入來報償連接效率的變化。
[0072] 還提供了鑒定與疾病或病理狀況關聯的核酸的方法。方法包含測量不同于對照的 水平的樣品中的核酸水平。根據一種實施方式，核酸是miRNA，以及檢測可通過將樣品與本 文描述的探針或生物芯片接觸，并檢測雜交產物的數量進行。
[0073] 樣品中的核酸水平還可與對照細胞（例如，正常細胞）比較來確定核酸是否差異 表達（例如，過表達或低表達）。鑒定在病理細胞中與對照相比差異表達的miRNA的能力， 能夠提供高分辨率、高靈敏度的數據集，其可用于診斷學、預后學、治療學、藥物開發、藥物 遺傳學、生物傳感器開發的領域、和其他相關領域。
[0074] 疾病相關的核酸或miRNA的表達水平以許多方式提供信息。例如，疾病相關的核 酸與對照相比的差異表達可以被用于診斷患有疾病的患者。疾病相關的核酸的表達水平還 可被用于監測患者的治療和疾病狀態。此外，疾病相關的miRNA的表達水平可允許為了改 變特定的表達譜或抑制與疾病關聯的表達譜篩選候選藥物。
[0075] 目標核酸或其部分或片段可以被檢測，以及測量目標核酸的水平，所述測量通過 將包含目標核酸的樣品與包含與目標核酸充分互補的連接探針的生物芯片接觸，以及檢測 超出對照水平的對探針的雜交。
[0076] 根據本發明的另一種實施方式，可以理解術語"生物樣品"或"生物流體"包括，但 不限于，任意數量的來自活體的或曾經活體的患者或哺乳動物的物質。這樣的物質包括，但 不限于，血液、血清、血漿、尿液、細胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴、淋巴結、滑液組織、軟骨細 胞、滑液巨噬細胞、內皮細胞和皮膚。在一個優選的實施方案中，所述流體是血液或血清。
[0077] 還提供了一種診斷的方法。該方法包含檢測兩種或更多種疾病相關的miRNA在生 物樣品中的差異表達水平。該樣品可以來源于受試者。受試者疾病狀態的診斷可允許預后 和治療策略的選擇。此外，細胞的發育階段可以通過確定瞬時表達的疾病相關的miRNA來 分級。
[0078] 根據一種實施方式，本發明提供了用于診斷受試者疾病或狀況的方法，包含a)從 受試者獲得生物樣品；b)使用上述的方法，分析a)的樣品的一種或更多種感興趣的目標 RNA;c)比較樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的表達水平和對照樣品中一種或更多 種感興趣的目標RNA的表達水平；d)當與對照樣品比較時，如果在受試者樣品中檢測到與 疾病或狀況的存在關聯的一種或更多種感興趣的目標RNA的表達水平，則診斷受試者具有 疾病或狀況。
[0079] 在用于受試者疾病或狀況的診斷的方法的一些實施方式中，目標RNA是包含8到 150個核苷酸長度的miRNA、siRNA或其他RNA序列。
[0080] 樣品中miRNA的身份和相對量能夠被用于提供特定樣品的miRNA表達譜。樣品的 miRNA表達譜包括有關樣品中包含的miRNA的身份、樣品中包含的miRNA的定量水平、和/ 或miRNA的定量水平相對于其它樣品的變化的信息。例如，樣品的miRNA譜包括與特定的 細胞類型、過程、感興趣的狀況、或其它細胞的狀態關聯的miRNA的身份、定量水平、和/或 定量水平的變化的信息。這樣的信息可以被用于診斷目的、藥物開發、藥物篩選和/或藥效 試驗。
[0081] 在另一種實例中，對于診斷，如果已知特定miRNA或miRNA的組的存在或不存在與 感興趣的特定狀況的存在或不存在相關聯，則狀況的診斷能夠通過獲得取自被診斷的患者 的樣品的miRNA譜來進行。 實施例
[0082] 基本的Ligo-miRTM檢驗原理.根據一種或更多種實施方式，本文提供的本發明 的Ligo-miRTM方法包含用于多路miRNA檢測的無PCR、2步連接檢驗，其基于探針長度，編 碼和檢測感興趣的miRNA。在第一連接步驟中，通用的銜接子探針使用第一連接酶被連接 到樣品中的每個miRNA的3' -0H來形成連接的寡核苷酸模板。在第二連接步驟中，感興趣 的miRNA特異性鑒別探針和通用共同探針之后被加入到溶液中，以及允許與miRNA銜接子 模板雜交，以及使用第二連接酶連接，來形成最終Ligo-miRTM反應產物。
[0083] 根據一種實施方式，共同探針和銜接子探針彼此互補，以及是跨所有的miRNA共 享的。每一個鑒別探針與每一個感興趣的miRNA在5'端特異性的互補，以及其在3'端還 包含可變長度的編碼序列部分（VLCS)。每一個鑒別探針包含相應的5-150ntVLCS，其用于 通過其獨特的長度使用例如電泳的大小鑒別方法鑒定特異性miRNA探針。如此，在一組將 被用于多路miRNA檢測的探針中，將有用于被檢測的每一個感興趣的miRNA的1個鑒別探 針、單一銜接子探針和單一共同探針。只有感興趣的特異性miRNA存在時，在第二步驟中特 異性鑒別探針和共同探針將被連接在一起。這一 2步連接方法確保只有成熟miRNA被高效 的檢測。在第一連接步驟中，銜接子探針必須被緊密毗鄰成熟miRNA序列連接，以使第二連 接步驟恰好發生。
[0084] Ligo-miRTM反應產物的檢測.根據另一種實施方式，反應產物的分析通過連接 到共同探針的5'端的熒光標記的檢測進行。每一個特異性miRNA導致相應的反應產物，其 之后通過長度被鑒定。根據一種可選擇的實施方式，鑒別探針另外地在3'端被熒光標記。 產物的分析通過3'鑒別探針信號和5'共同探針信號的一致分析進行，其只有當連接已發 生時才發生。
[0085] 根據再一實施方式，鑒別探針和共同探針被熒光染料標記，以便當形成連接產物 時，熒光共振能量轉移（FRET)發生。
[0086] 還根據另一實施方式，鑒別探針被內部標記，而不是末端標記。鑒別探針也能夠用 相同或不同的標記來標記。
[0087] 本領域技術人員可以理解在某種實施方式中，探針通過任何已知手段被可檢測地 標記，手段包括，例如，放射性標記、熒光標記、比色標記等。
[0088] 根據本發明的方法，雜交產物長度的檢測能夠通過凝膠電泳、毛細管電泳、游離液 流體動力學分離、色譜方法等進行。
[0089] 本發明的Ligo-miR TM分析方法的可選的變化形式.根據一種實施方式，單一銜 接子探針、單一共同探針、和一組鑒別探針被設計來進行多路檢測，其中相對鏈上第二連接 位點的位置，是與第一連接位點精確相對的。根據另一種實施方式，第二連接位點向3'或 5'方向移動，以便其從第一連接位點偏移來增加特異性。
[0090] 又根據另一種實施方式，第二連接位點被移動，以及多個共同探針、多個銜接子探 針、和一組鑒別探針被設計來使得能夠通過顏色和長度實現多路。
[0091] 根據一種或更多種實施方式，第一連接在ATP的不存在下進行。
[0092] 根據一種或更多種實施方式，第二連接在ATP的不存在下進行。
[0093] 根據再一種實施方式，聚合酶鏈式反應（PCR)引物位點被設計到探針序列中來使 得能夠摻入下游的PCR擴增步驟。所有鑒別探針的3'端被設計成含有共同PCR引物位點。 對此位點反義的正向引物被合成。對銜接子探針序列反義的反向引物也被合成。以這種方 式，所有的miRNA特異性連接產物能夠使用單一PCR引物組被PCR擴增。PCR擴增在第二連 接步驟之后通過加入上述的PCR引物、聚合酶和PCR試劑到連接產物并熱循環進行。列舉 在表1中的對miR-26a、miR-34a、和miR-29b的鑒別探針包括這樣的共同PCR引物位點。
[0094] 還根據另一種實施方式，poly(A)加尾被用于在第一步驟中代替連接，以及 poly(T)共同探針被用于第二步驟。將足夠量的poly(A)聚合酶、poly(A)聚合酶反應緩沖 液、和ATP加入到含有感興趣的RNA的樣品中，以及在37°C孵育10分鐘。這將poly(A)尾加 入到樣品中每一個RNA分子的末端。之后在65°C熱滅活聚合酶20分鐘。之后使用poly(T) 共同探針，以及相應地進行該檢驗。在還另一種實施方式中，5單位的poly(A)聚合酶、1倍 poly(A)聚合酶反應緩沖液、以及ImMATP被加入到500ng總RNA中，以及在37°C孵育10 分鐘。
[0095] 銜接子探針設計.被用于本發明的方法的銜接子探針是商業合成的、HPLC或PAGE 純化的DNA寡核苷酸。根據一種實施方式，典型的銜接子探針為帶有5'-App(腺苷酸化） 和3'-ddC(雙脫氧胞苷）的約19nt的長度。
[0096] 根據另一種實施方式，銜接子探針的3'端被-ddC封閉來阻止不需要的連接產物。 本領域已知的其它封閉部分也可以被使用，例如，NH2部分。
[0097] 根據一種或更多種可選擇的實施方式，3'端也可以被本領域已知的可檢測部分標 記，例如，指示物，諸如Cy3、Cy5、Alexa488、Alexa647、FITC等能夠被使用。
[0098] 根據一種或更多種實施方式，銜接子探針包含可檢測內部標記。
[0099] 根據一種或更多種實施方式，銜接子探針的5'端被預腺苷酸化，以便連接能夠在 ATP的不存在下進行，減少不需要的連接產物。預腺苷酸化可以使用已知的方法酶促或化學 地進行。
[0100] 根據另一種實施方式，5'殘基是RNA而不是DNA以減少連接偏差和增加連接效率。
[0101] 還根據另一種實施方式，可選擇的核酸殘基，例如鎖核酸（LNA)或肽核酸（PNA)， 可以在不同位置上被取代來增加結合特異性。本領域普通技術人員可以理解，LNA可以顯 著增強核酸探針的結合特性。LNA堿基可以被取代進入鑒別探針以及銜接子和/或共同探 針的識別序列。LNA堿基的取代增加了單獨探針的整體熔化溫度。這樣的策略能夠被用于： 1)為區分密切相關的miRNA增加探針特異性，2)匹配探針熔化溫度來最小化反應效率中的 變異性，以及3)通過增加探針結合強度增加整體反應效率。肽核酸能夠被相似地使用。
[0102] 本發明的銜接子探針序列能夠單獨或與感興趣的miRNA聯合被設計成消除或促 進二級結構的形成。這樣的二級結構能夠用于適當地減少或增加連接效率。典型的銜接子 探針序列在表1中提供。
[0103] 根據一種或更多種實施方式，銜接子探針在3'端包含生物素或鏈霉親和素。
[0104] 根據一種或更多種實施方式，銜接子探針在3'端結合到磁珠。
[0105] 根據一種或更多種實施方式，其中銜接子探針包括RNA核苷酸。
[0106] 共同探針設計.根據本發明的一種或更多種實施方式，共同探針是商業合成的、 HPLC或PAGE純化的DNA寡核苷酸。根據一種實施方式，通常地，在每一個探針組中利用單 一共同探針。典型的共同探針長度約19nt，序列與銜接子探針互補，以及在5'端具有可檢 測部分，例如5' -Cy5,以及還包含3' -0H端。在可選擇的實施方式中，本發明的共同探針的 5'端能夠用其他可檢測部分標記，例如Cy3、Alexa488、Alexa647、FITC、熒光素等。
[0107] 根據一種或更多種實施方式，共同探針包含10-30個DNA核苷酸長度，以及與銜接 子探針序列互補，以及還包含3' -0H。
[0108] 根據一種或更多種實施方式，共同探針包含可檢測內部標記。
[0109] 根據另一種實施方式，可選擇的核酸殘基例如鎖核酸或肽核酸，能夠在不同位置 被取代來增加結合特異性。
[0110] 本領域普通技術人員可以理解，共同探針序列能夠單獨或與miRNA目標聯合被設 計成消除或促進二級結構的形成。這樣的二級結構能夠用于適當地減少或增加連接效率。 典型的共同探針序列在表1中提供。
[0111] 鑒別探針設計.被用于本發明的方法的鑒別探針是商業合成的、HPLC或PAGE純 化的DNA寡核苷酸。被檢測的每一個miRNA要求至少一種鑒別探針。根據一種實施方式， 約5-100種鑒別探針被用于每一個探針組。每一個鑒別探針在其5'端包含識別序列，其與 被檢測的感興趣的目標miRNA互補，以及在3'端還包含可變長度編碼序列（VLCS)，其能夠 用于通過其獨特的長度鑒定雜交探針。在一種實施方式中，識別序列與微RNA目標的長度 完全相同，并且與微RNA序列完全互補。
[0112] 在其它實施方式中，識別序列可從完全互補變化，例如，在另一實施方式中，識別 序列的長度短于微RNA目標，而保留完全的互補性。在另一實施方式中，識別序列的長度長 于微RNA目標，而保留完全的互補性并且延長到銜接子序列。
[0113] 根據一種實施方式，鑒別探針包含5'識別序列，該序列具有具有與感興趣的特異 性miRNA的反義互補性的DNA寡核苷酸序列，并且具有3'可變長度編碼序列（VLCS)，其具 有至少5到約200個核苷酸的長度。
[0114] 在一種或更多種實施方式中，鑒別探針上的VLCS可以在長度5-150nt變化，然而， 根據其它實施方式，該長度可以做成更長或更短來使得能夠不同的鑒定。較長的鑒別探針 序列可使用已知克隆技術產生，來創造100-100,OOObp之間的探針。VLCS標簽之間的最小 長度差異由多路的期望水平和用于鑒定它們的下游大小鑒別技術的大小分辨率（sizing resolution)和大小動態范圍確定。在使用帶有單核苷酸分辨率的檢測平臺，例如聚丙烯酰 胺凝膠電泳、毛細管電泳、或單分子游離液流體動力學分離的實施方式中，VLCS標簽通常由 3-10個核苷酸分離。在使用瓊脂糖凝膠電泳的實施方式中，VLCS標簽通常由10-100個核 苷酸分離。
[0115] 根據一種實施方式，鑒別探針的3'端被-ddC封閉來阻止不需要的連接產物。在 可選擇的實施方式中，其它封閉部分也可被使用，例如，諸如nh2。根據再一種實施方式，鑒 別探針的3'端能夠用可檢測部分標記，例如，諸如Cy3、Cy5、Alexa488、Alexa647、FITC等。
[0116] 根據一種實施方式，鑒別探針的5'端被預腺苷酸化，以便能夠在ATP的不存在下 進行，減少不需要的連接產物。預腺苷酸化可以使用本領域任何已知的方法，包括酶促或化 學地進行。
[0117] 根據另一種實施方式，鑒別探針包含可選擇的核酸殘基，例如鎖核酸或肽核酸，能 夠在不同位置被取代來增加結合特異性。
[0118] 本領域普通技術人員可以理解，每一個鑒別探針包含2區域，識別序列和VLCS標 簽。根據一種實施方式，識別序列通常與感興趣的目標miRNA序列完全互補。根據其它實 施方式，識別序列可以從具有與感興趣的目標miRNA序列的完全互補序列變化。
[0119] 根據一些實施方式，識別探針包含可檢測內部標記。
[0120] 根據一種實施方式，VLCS標簽通常包括在宿主基因組內沒有發現的序列，來防止 不需要的與背景RNA/DNA分子的雜交。在一種或更多種可選擇的實施方式中，鑒別探針序 列能夠單獨或與miRNA目標聯合被設計成消除或促進二級結構的形成。這樣的二級結構能 夠用于適當地減少或增加連接效率。一些鑒別探針序列的例子在表1中給出。
[0121] 如本文描述的方法使用的，感興趣的目標RNA使用大小鑒別方法被分析和鑒定。 大小鑒別方法的例子包括，但不限于，凝膠電泳、毛細管電泳和SML-FSHS。
[0122] Ligo-miREZ方法.圖1顯示了本發明的總體Ligo-miRTM分析方法的圖解。根 據一種實施方式，在第一連接步驟中，方法以獲得約〇. 1-5UL的總RNA樣品開始，并且加 入足夠量的腺苷酸化的銜接子探針（50-1000nM)、連接酶（50-500單位）、連接酶緩沖液 (0.l-5yL)和水。本領域普通技術人員可以理解，可被用于本發明的方法的連接酶包括，例 如，T4RNA連接酶1、T4RNA連接酶2截短型、T4RNA連接酶2截短型KQ、T4RNA連接酶2截 短型K227Q、耐熱5'AppDNA/RNA連接酶等。在某一實施方式中，添加劑例如PEG(聚乙二 醇）（0-40% )和DMSO(二甲基亞砜）（0-30% )，能夠被添加來增加連接效率。最終反應體 積為約10UL。然后混合物在25°C孵育0. 25到48小時，并且之后65°C熱變性步驟約1-60 分鐘，優選約1、2、5、10、15、20、30、直至60分鐘。在一些實施方式中，孵育步驟還能夠在較 低溫度例如4°C，或較高溫度例如65°C進行，來減少連接偏差和增加連接效率。
[0123] 根據一種實施方式，在第二連接步驟中，約5yL的前述反應混合物被獲得，并且 足夠量的共同探針（l〇-l〇〇〇nM)、鑒別探針（10-1000nM)、連接酶（50-500單位）、連接酶 緩沖液（〇. 1-5UL)和水被加入。本領域普通技術人員可以理解，對于第二步驟，可被使用 的酶包括，例如T4DNA連接酶、9。NDNA連接酶、Ampligase、T4RNA連接酶2、大腸桿菌 DNA連接酶、Taq連接酶等。在一些實施方式中，添加劑，例如PEG(聚乙二醇）（0-40% )和 DMS0(二甲基亞砜）（0-30% )，也能夠被加入來增加連接效率。最終反應體積為約10yL。 之后對反應進行熱循環，95°C(0.5-5分鐘保持）和45°C(1-100分鐘保持）1-100個循環， 取決于要求多少擴增。
[0124] 熱循環之后，根據一種實施方式，之后對樣品進行PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳） 來分離雜交產物。通常，5 y L樣品被與凝膠上樣緩沖液混合，并且在300V在變性的15% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝膠上分析50分鐘，使能夠分離微RNA反應產物。在可選擇的實施方 式中，瓊脂糖凝膠電泳也可以被用于分離雜交產物。分離的凝膠產物在TyphoonVariable Mode Imager(GE)上被成像。圖2提供了典型的凝膠圖像。圖3顯示了滴定miRNA目標的 6路分析的典型凝膠圖像。在可選擇的實施方式中，基于CCD或基于膠片的成像儀也能夠被 用于獲得凝膠圖像。圖像分析被用于基于凝膠帶的位置和整合的帶強度鑒定微RNA表達水 平。圖4顯示了從使用圖3的miR-21的圖像分析獲得的典型的滴定曲線。
[0125] 根據另一種實施方式，熱循環的樣品能夠使用毛細管電泳代替平板凝膠電泳被分 析。得到的電泳圖之后能夠基于峰位置和整合的峰強度被分析來獲得微RNA的表達水平。
[0126] 表1 :銜接子探針、共同探針、和鑒別探針的序列
[0127]
【權利要求】
1. 一種用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的方法，包含： a) 獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品； b) 向a)的所述樣品加入足夠量的銜接子探針和足夠量的第一連接酶； c) 通過孵育以及允許所述銜接子探針連接到所述樣品中所述一種或更多種感興趣的 目標RNA的3' -0H端，進行第一連接步驟； d) 向b)的所述樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針、以及足夠量的第二連接酶； e) 通過孵育c)的所述樣品足夠量的時間來引起d)的探針與b)的連接的感興趣的目 標RNA和銜接子探針的雜交，并允許所述鑒別探針和共同探針之間的連接，進行第二連接 步驟；以及 f) 通過一種或更多種大小鑒別方法分析所述產物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述銜接子探針包含長度為5-50個DNA核苷酸， 并且在5'端被磷酸化。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述銜接子探針在5'端被預腺苷酸化。
4. 根據權利要求2或3中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針在3'端用ddC或 NH2封閉。
5. 根據權利要求2-4中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針在3'端包含可檢測 記。
6. 根據權利要求2-5中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針包含可檢測內部標 記。
7. 根據權利要求2-6中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針在3'端包含生物素 或鏈霉親和素。
8. 根據權利要求2-7中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針在3'端結合到磁 珠。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中在c)第一連接步驟之后進行磁性分離、洗滌、以及 重懸。
10. 根據權利要求2-9中的任一項所述的方法，其中所述銜接子探針包括RNA核苷酸。
11. 根據權利要求1-10中的任一項所述的方法，其中所述共同探針包含長度為5-50個 DNA核苷酸，并與所述銜接子探針序列互補，以及還包含3' -ΟΗ。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述共同探針在5'端包含可檢測標記。
13. 根據權利要求11或12中的任一項所述的方法，其中所述共同探針包含可檢測內部 記。
14. 根據權利要求1-13中的任一項所述的方法，其中所述鑒別探針包含5'識別序列， 所述5'識別序列具有具有與感興趣的特定miRNA的反義互補性的DNA寡核苷酸序列，并且 具有具有長度為至少5到約200個核苷酸的3'可變長度編碼序列（VLCS)。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述VLCS標簽長度是對一種或更多種感興趣的 miRNA特異性的。
16. 根據權利要求14或15中的任一項所述的方法，其中所述鑒別探針在3'端用ddC 或NH2封閉。
17. 根據權利要求14-16中的任一項所述的方法，其中所述鑒別探針在3'端包含可檢 測標記。
18. 根據權利要求14-17中的任一項所述的方法，其中所述鑒別探針包含可檢測內部 記。
19. 根據任一權利要求14-18所述的方法，其中所述鑒別探針在5'端被磷酸化。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中所述鑒別探針在5'端被預腺苷酸化。
21. 根據權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述可檢測標記選自以下組成的 組：突光探針、近紅外探針、FRET探針、發光探針和放射性核素。
22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述可檢測標記是Cy染料、Alexa Fluors、熒 光素染料、ATT0染料、IRDyes、WellRED染料、和若丹明染料。
23. 根據權利要求1-22中任一項所述的方法，其中所述探針包含修飾的核酸堿基，例 如 LNA 或 PNA。
24. 根據權利要求1所述的方法，其中f)中的大小鑒別使用電泳進行。
25. 根據權利要求1所述的方法，其中f)中的大小鑒別使用單分子游離液流體動力學 分離（SML-FSHS)進行。
26. 根據權利要求1所述的方法，其中f)中的大小鑒別使用色譜法進行。
27. 根據權利要求1所述的方法，其中c)中的第一連接在ATP的不存在下進行。
28. 根據權利要求1所述的方法，其中e)中的第二連接在ATP的不存在下進行。
29. 根據權利要求1所述的方法，其中所述孵育包含在45°C到約95°C變性約0. 25到約 5分鐘、之后是在4°C到約80°C連接約0. 25到約100分鐘的1-100個循環的熱循環。
30. 根據權利要求1-29中任一項所述的方法，其中加入添加劑諸如PEG或DMS0來增加 連接效率和減少連接偏差。
31. 根據權利要求1-30中任一項所述的方法，其中加入內部對照來報償連接效率的變 化。
32. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一連接酶是T4RNA連接酶1、T4RNA連接 酶2截短型、T4RNA連接酶2K227Q、T4RNA連接酶2截短型KQ和Mth. RNA連接酶。
33. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第二連接酶是大腸桿菌（E.Coli)DNA連接 酶、Taq DNA連接酶、9。N DNA連接酶、T4DNA連接酶、T4RNA連接酶2和Ampligase。
34. 根據權利要求1所述的方法，其中在c)所述第一連接步驟和e)所述第二連接步驟 之后進行熱變性步驟。
34. 根據權利要求1所述的方法，其中在e)所述第二連接步驟之后但f)大小鑒別之前 進行所述反應產物的PCR擴增。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中一個PCR引物是與所述VLCS序列反義的，以及 所述第二引物是與所述銜接子探針序列反義的。
36. 根據權利要求1-35中任一項所述的方法，其中所述感興趣的目標RNA是包含長度 為8-150個核苷酸之間的miRNA、siRNA或其它RNA序列。
37. -種用于在受試者中診斷或預后疾病或狀況的方法，包含： a) 從所述受試者獲得生物樣品； b) 使用權利要求1-36中任一項所述的方法，分析a)的所述樣品的一種或更多種感興 趣的目標RNA的表達水平； C)比較所述樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的表達水平和對照樣品中一種或 更多種感興趣的目標RNA的表達水平； d)當與所述對照樣品比較時，如果一種或更多種感興趣的目標RNA的表達水平與特定 的模式相關，則診斷所述受試者患有所述疾病或狀況，或預后所述疾病或狀況的結果或響 應。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述目標RNA是包含長度為8-150個核苷酸之 間的miRNA、siRNA或其它RNA序列。
39. -種用于銜接子探針和短RNA序列的高效和低偏差連接的方法，包含： a) 獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品； b) 向所述樣品加入飽和量的銜接子探針； c) 向所述樣品加入飽和量的連接酶； d) 向所述樣品加入飽和量的PEG;以及 e) 通過孵育以及允許所述銜接子探針連接到所述樣品中所述一種或更多種感興趣的 目標RNA的3' -OH端，進行第一連接步驟。
40. 根據權利要求39所述的方法，其中反應體積是5-100 μ L。
41. 根據權利要求40所述的方法，其中反應體積是20 μ L。
42. 根據權利要求39所述的方法，其中所述樣品包含1-10, OOOng總RNA。
43. 根據權利要求42所述的方法，其中所述樣品包含500ng總RNA。
44. 根據權利要求39所述的方法，其中所述連接酶的量在100-1000單位之間。
45. 根據權利要求44所述的方法，其中所述連接酶的量是300單位。
46. 根據權利要求39所述的方法，其中所述PEG在10-40%之間。
47. 根據權利要求46所述的方法，其中所述PEG是25%。
48. 根據權利要求39所述的方法，其中所述孵育溫度在4-95°C之間。
49. 根據權利要求48所述的方法，其中所述孵育溫度在25°C。
50. 根據權利要求39所述的方法，其中所述孵育時間在0. 25-24小時之間。
51. 根據權利要求50所述的方法，其中所述孵育時間是4小時。
52. 根據權利要求39所述的方法，其中所述連接酶包含T4RNA連接酶1、T4RNA連接酶 2截短型、T4RNA連接酶2K227Q、T4RNA連接酶2截短型KQ和Mth. RNA連接酶。
53. 根據權利要求52所述的方法，其中所述連接酶包含T4RNA連接酶2K227Q。
54. 根據權利要求39所述的方法，其中所述銜接子探針包含DNA堿基，并且長度為 5_50nt〇
55. 根據權利要求39所述的方法，其中所述銜接子探針包含RNA和DNA堿基的混合物， 并且長度為5-50nt。
56. 根據權利要求55所述的方法，其中所述銜接子探針包含與連接位點相鄰的RNA堿 基。
57. -種用于檢測樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的方法，包含： a) 獲得含有一種或更多種感興趣的目標RNA的樣品； b) 向a)的所述樣品加入足夠量的poly (A)聚合酶； c) 通過孵育以及加入P〇ly(A)尾到所述樣品中一種或更多種感興趣的目標RNA的末端 進行poly⑷延伸； d) 向b)的所述樣品加入足夠量的共同探針和鑒別探針、以及足夠量的第二連接酶； e) 通過孵育c)的所述樣品足夠量的時間來引起d)的探針與b)的連接的感興趣的目 標RNA和銜接子探針的雜交，以及允許所述鑒別探針和共同探針之間的連接，進行第二連 接步驟；以及 f) 通過一種或更多種大小鑒別方法分析所述產物。
【文檔編號】C12N15/11GK104271768SQ201380019658
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年2月13日 優先權日:2012年2月14日
【發明者】澤-輝·王, 凱文·J·劉, 宋云柯 申請人:約翰霍普金斯大學