抗人cd69抗體及其用于醫療目的的用途

抗人cd69抗體及其用于醫療目的的用途
【專利摘要】本發明提供抗體，其能夠特異性結合人CD69，具有預防過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠CD69的交叉反應性。本發明還提供具有對人CD69的高結合親和力并具有預防過敏性炎癥的活性的抗體。本發明的抗體的每一種均可以是人抗體。
【專利說明】抗人CD69抗體及其用于醫療目的的用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗人CD69抗體及其藥物用途。

【背景技術】
[0002] CD69是屬于C型凝集素家族的II型跨膜蛋白。由于CD69的表達在T細胞和B 細胞的刺激后幾個小時之內增加，所W它被廣泛用作早期活化標記分子W作為淋己細胞活 化的指標（非專利文獻1)。此外，在胸腺中分化過程中在選擇下的T細胞中也觀察到表達 (非專利文獻2和3)。盡管假定CD69具有作為加強來自抗原受體的信號轉導的共同受體 的功能，但細節是未知的。其配體至今尚未鑒定。它在血小板中組成型表達，并且在活化的 嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等中也觀察到表達。因此，假定其在血小板中的功能表達和局 部炎癥反應中發揮作用。此外，已經闡明，嗜中性粒細胞上的CD69在關節炎的發作中發揮 重要作用（非專利文獻4)。此外，已經報道，CD69控制過敏性氣道炎癥，并且針對小鼠CD69 的抗體抑制過敏性氣道炎癥（非專利文獻5)。還已經報道，香煙煙霧誘導的COro和博來 霉素誘導的肺纖維化（lungfibrogenesis)在CD69缺陷的小鼠中得到衰減（非專利文獻6 和7)。因此，預期應用針對CD69的抗體W預防或治療此類過敏性疾病和炎性疾病。然而， 由于CD69的配體是未知的，所W沒有可用的用于有效評價針對人CD69的抗體的體外藥理 學作用的方法。此外，由于現有針對人CD69的抗體不與非人CD69交叉反應，所W對于現有 抗體的體內藥理學作用的評價實質上是不可能的，并且甚至該些抗體是否得到有用的藥理 學作用也是不清楚的。如上所述，由于不存在用于評價抗人CD69抗體的藥理學作用的令人 滿意的方法，所W適用于預防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗體的開發延遲 落后很多。
[0003] 瞻菌體展示方法是已經通過在功能膚或蛋白和編碼其的DNA之間W瞻菌體顆粒 的形式形成一一對應而實現體外高速選擇的展示技術之一。該種瞻菌體展示方法已經被應 用于抗體選擇，并且通過該方法獲得的抗體已經被開發作為藥物（非專利文獻8)。此外，已 經建立了通過組合人人工抗體文庫和瞻菌體展示方法而獲得特異性抗體的方法，而此類方 法已經由多個公司實施，如Mo巧hoSys的化CAL(人組合抗體文庫（HumanCombinatorial AntibodyLibrary))所證明。
[0004][文獻列表]
[非專利文獻] 非專利文獻 1:Testi,R.等人Immunol.Today15: 479-483, 1994。 非專利文獻 2:Yamashita,I.等人Int.Immunol. 5: 1139-1150，1993。 非專利文獻 3:P'Jakayama,T.等人J.Immunol. 168: 87-94, 2002。 非專利文獻 4:Murata,K.等人Int.Immunol. 15: 987-992，2003。 非專利文獻 5:Miki-Hosokawa,T.等人J.Immunol. 183: 8203-8215，2009。 非專利文獻 6:Tsuyusaki,J.等人J.Recept.Si即alTransduct.Res. 31: 似4-439，2011。 非專利文獻 7:Yamauchi,K.等人Respir.Res. 12: 131, 2011。 非專利文獻 8:Rothe,C.等人J.Mol.Biol. 376: 1182-1200，2008。
[000引 發明概述 本發明待解決的問題 本發明的一個目標是提供適用于預防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗 體。
[0006] 解決問題的方法 為了解決上述問題，本發明人首先產生結合人CD69和小鼠CD69兩者的抗CD69抗體。 此外，他們深入研究了體內評價抗人CD69抗體的藥理學作用的方法。作為結果，他們已經 成功地通過在用特定抗原免疫的CD69缺陷小鼠的化2細胞中強制表達人CD69并將化2細 胞返回至小鼠的體內而在小鼠中再現過敏反應，該是由表達人CD69的Th2細胞介導的。他 們已經通過化CAL產生了多種抗人CD69抗體，并通過使用上述小鼠評價對過敏反應的效 果。作為結果，他們已經發現了具有優異的過敏抑制效果和炎癥抑制效果的抗人CD69抗 體。此外，他們已經通過修飾獲得的抗體的輕鏈CDR3而改進了人CD69的親和力，并成功地 加強了過敏抑制效果和炎癥抑制效果，同時維持了與小鼠CD69的交叉反應性。基于上述發 現，他們已經完成了本發明。
[0007] 因此，本發明涉及W下內容。
[0008] [1]特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠 CD69的交叉反應性。
[000引 凹山的抗體，其在包含SEQIDNO:33顯示的氨基酸序列的表位處結合人CD69。
[0010] [3] [1]的抗體，其包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 (1) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 或 (2) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7 - 9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列 中取代、缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10 - 12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個氨基酸。
[0011] [句閒的抗體，其中 (1'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重 鏈可變區包含SEQIDNO: 24顯示的氨基酸序列。
[0012] [引特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并在包含SEQID NO: 59或78顯示的氨基酸序列的表位處結合人CD69。
[0013] [6]特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且包含輕鏈可 變區和重鏈可變區，其中 (3) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (4) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (5) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDN0:6中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDN0:1至3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4至6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個氨基酸；或 (6) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDNO: 13至15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16至18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個氨基酸。
[0014] [7] [6]的抗體，其中 (3'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 21中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區 包含SEQIDNO: 22顯示的氨基酸序列；或 (4'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 25中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區 包含SEQIDNO: 26顯示的氨基酸序列。
[0015][引[1] - [7]中任一項的抗體，其關于與人CD69的結合親和力具有不大于5xl〇-s M的Kd值。
[001引 [9]山-閒中任一項的抗體，其是人抗體。
[0017] [10]藥物組合物，其包含山-[9]中任一項的抗體。
[0018] [11]用于過敏性疾病或炎性疾病的預防劑或治療劑，其包含[1] - [9]中任一項 的抗體。
[0019] [12]多核巧酸，其編碼[1] - [9]中任一項的抗體。
[0020] [13]載體，其包含[12]的多核巧酸。
[00川 [M]轉化體，其包含[切的載體。
[0022] [1引非人哺乳動物，其包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動物的轉移 的化2細胞，其中所述化2細胞表達人CD69。
[0023] [16] [15]的非人哺乳動物，其中所述非人哺乳動物是小鼠。
[0024] [17] [1] - [9]中任一項的抗體，其用于預防或治療過敏性疾病或炎性疾病。
[0025] [1引用于哺乳動物中預防或治療過敏性疾病或炎性疾病的方法，其包括將有效 量的[1] - [9]中任一項的抗體施用于所述哺乳動物。
[0026] [19] [1] - [9]中任一項的抗體用于生產預防或治療過敏性疾病或炎性疾病的 藥劑的用途。
[0027] 發明效果 根據本發明，提供了適用于預防或治療過敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗體。此 夕F，根據本發明，可提供允許體內評價抗人CD69抗體的藥理學作用的動物模型。
[002引附圖簡述 圖1顯示通過細胞染色評價與人CD69和小鼠CD69的結合。
[0029] 圖2顯示通過流式細胞術分析人CD69表達。
[0030] 圖3顯示各種抗人CD69抗體對肺泡白細胞浸潤的效果。
[0031] 圖4通過流式細胞術證實各種抗人CD69抗體與小鼠CD69和人CD69的交叉反應 性。
[0032] 圖5顯示各種抗人CD69抗體針對肺泡白細胞浸潤的效果。
[0033] 圖6顯示小鼠CD69 (上部序列）和人CD69 (下部序列）的氨基酸序列的比對。
[0034] 實施方案的描述 本發明提供具有對人CD69特異性結合活性和抑制過敏性炎癥的活性的抗體。
[003引 CD69是已知的II型膜蛋白，并且其氨基酸序列和其CDNA序列也是已知的。人 CD69的代表性氨基酸序列顯示于SEQIDNO: 30,人CD69的代表性cDNA序列顯示于SEQID NO: 29,小鼠CD69的代表性氨基酸序列顯示于SEQIDNO: 32,且小鼠CD69的代表性CDNA序 列顯示于SEQIDNO:31。
[0036] 本發明的抗體具有對人CD69的胞外結構域的特異性結合活性。人CD69的胞外結 構域對應于SEQIDN0:30顯示的氨基酸序列中62-199的區域，且小鼠CD69的胞外結構域 對應于SEQIDNO:32顯示的氨基酸序列中62-199的區域。
[0037]"人CD69"意指CD69的氨基酸序列或核酸序列具有與人中天然表達的CD69的氨 基酸序列或核巧酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列或核酸序列。"實質上相同"意指目 標氨基酸序列或核酸序列與人中天然表達的具體CD69的氨基酸序列或核酸序列具有70% 或更高（優選80 %或更高，更優選90 %或更高，進一步優選95 %或更高，最優選99 %或更 高）同一性，并且具有具體人CD69的功能。除了人W外的生物物種，除了CD69W外的蛋白， 其基因和片段也W相同方式進行解釋。
[003引抗體與抗原X的"特異性結合"意指在抗原-抗體反應中抗體與抗原X的結合親 和力的Kd值不大于Ixicr7M。
[0039]在本說明書中，關于本發明的抗體與人CD69的結合親和力的Kd值根據 Immunoassays(OXK)畑UNIVERSITYPRESS, 2000)中描述的原理使用斯卡恰特作圖法 (scatchardplotmethod)進行計算。將抗體與各種濃度的抗原（人CD69的胞外結構域） 在室溫下賠育2小時，直到平衡，并且通過化ISA方法測量賠育溶液中存在的游離抗體的 量。基于每個平衡樣品中游離抗體量的變化測定結合常數和解離常數（Kd值）。平衡反應 過程中的抗體濃度為0. 015yg/ml，并且用于測量游離抗體的量的化ISA板用W1yg/ml 的抗原固定。
[0040] 在一個優選的實施方案中，本發明的抗體與人CD69的結合親和力的Kd值不大于 5X10-8M。
[0041] 本發明的抗體具有抑制過敏性炎癥的活性。過敏性炎癥是指特征在于目標組織中 單核細胞的選擇性積累的炎癥，其與過敏反應關聯發生。單核細胞涵蓋Th2細胞、嗜酸性粒 細胞、嗜堿性粒細胞和服大細胞。抗體是否具有抑制過敏性炎癥的活性可W通過評價其是 否抑制通過將下述本發明的非人哺乳動物暴露于抗原誘導的過敏性反應（例如，白細胞浸 潤）來證實。
[0042] 在本說明書中，"抗體"被用作涵蓋全長抗體和其任何抗原結合片段（即"抗原結 合部分"）或其單鏈的抗體。"抗體"是指含有通過二硫鍵連接的至少兩條重鏈（H)和兩條 輕鏈（L)的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區（本文中簡稱為Vh)和重 鏈恒定區構成。重鏈恒定區由ChUCh2和Ch3的3個結構域構成。每條輕鏈由輕鏈可變區 (本文中簡稱為和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由單一結構域片構成。Vh和Vl區被 進一步細分為被稱為互補決定區（CDR)的具有更高可變性的區域，其含有分散在其中的被 稱為框架區（FR)的更高保守區域。每個Vh和Vl由3個CDR和4個FR構成，它們W下列 順序排列，即，從氨基末端至駿基末端的FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重鏈和 輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可W介導免疫球蛋白與宿 主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）和常規補體系統的第一組分 (Clq))的結合。
[0043] 在本說明書中，抗體的"抗原結合部分"被用來指抗體的保留特異性結合抗原（例 女口，人CD69)的能力的一個或多個片段。已經闡明，抗體的抗原結合功能由全長抗體的片段 行使。術語抗體的"抗原結合部分"中包括的結合片段的實例包括（i)F油片段，由心Vh、 片和Chi結構域構成的單價片段，（ii)F(ab'）2片段，含有由較鏈區中的二硫鍵連接的兩個 F油片段的二價片段，（iii)F油'片段，具有較鏈區部分的固有F油（參見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,Pauled.，3.sup.rded. 1993)，（iv)由Vh和Cm結構域構成的Fd片段， (V)由抗體的單一臂中的和Vh結構域構成的Fv片段，（Vi)由Vh結構域構成的dAb片段 (Ward等人，（1989)化Uire341:544-546)，（vU)分離的互補決定區（CDR)，W及（ViU) 作為含有單一可變結構域和兩個恒定區的重鏈可變區的納米抗體。盡管作為Fv片段的兩 個結構域的Vl和Vh由不同基因編碼，但它們可W通過重組技術通過合成接頭連接W產生 來自它們的單一蛋白鏈，其中，在該鏈中，和Vh區彼此配對W形成單價分子（稱為單鏈 Fv(ScFv);參見，例如，Bird等人（1988)Science242:423-426;和Huston等人，（1988) Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也涵蓋在抗體的"抗原結合 部分"中。此類抗體片段由本領域普通技術人員通過已知的常規技術獲得，并且W與未修飾 抗體相同的方式篩選可用性。
[0044] 本發明的抗體優選是單克隆抗體。"單克隆抗體"是指單一分子組成（single moleculecomposition)的抗體分子的制備物。單克隆抗體組成顯示對被稱為表位的抗原 特定部分的單一結合特異性和親和力。
[0045] 本發明的抗體優選是人抗體。"人抗體"是指在框架區和CDR區兩者中具有源自人 種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，當抗體含有恒定區時，恒定區也源自人種系免 疫球蛋白序列。在本說明書中，"人抗體"也甚至涵蓋包括不是由人種系免疫球蛋白序列編 碼的氨基酸殘基的實施方案（例如，通過在體外隨機或位點定向誘變或在體內體細胞突變 引入的突變）。然而，在本說明書中，"人抗體"的術語并不意在包括其中源自除了人W外的 動物物種諸如小鼠的種系的CDR序列融合在人框架序列上的抗體。
[0046] 在本說明書中，人抗體涵蓋"重構的人抗體"。重構的人抗體是指其中在第二人受 體抗體中使用第一人供體抗體中含有的至少一個CDR而不是第二人受體抗體的CDR的修 飾的抗體。優選地，取代所有6個CDR。更優選地，使用第一人供體抗體的整個抗原結合區 (例如，Fv、Fab或F(ab'）2)代替第二人受體抗體中的對應區域。更優選地，將第一人供體 抗體的F油區可操作地連接至第二人受體抗體的適當的恒定區，W形成全長抗體。
[0047] 重構的人抗體可W通過公開于，例如，EP125023、W096/02576、非專利文獻8等中 的常規基因重組技術來產生。具體地，例如，經設計W連接供體人抗體中期望的CDR和受 體人抗體中期望的框架區（FR)的DNA序列通過PCR方法使用作為引物的經產生W具有與 CDR和FR兩者的末端區域重疊的區域的幾個寡核巧酸來合成（參見W098/13388中描述的 方法）。將獲得的DNA連接至編碼人抗體恒定區或人抗體恒定區突變體的DNA，將其并入 表達載體中，并將載體引入宿主W允許產生，由此可W獲得重構的人抗體（參見EP125023、 W096/02576)。
[0048] 此外，在本說明書中，人抗體涵蓋"人工人抗體"。人工人抗體可W通過公開于，例 女口，非專利文獻8等中的常規基因重組技術來產生。
[0049] 本發明的抗體還包括其中融合上述抗體和其他膚或蛋白的融合蛋白。融合蛋白的 產生方法包括：連接編碼本發明的抗體的多核巧酸和編碼其他膚或多膚的多核巧酸W匹配 框架，將其引入表達載體，并允許其在宿主中表達，并可W使用本領域普通技術人員已知的 技術。作為待與本發明的抗體融合的其他膚，可W使用已知的膚，諸如FLAGOlopp,T.P. 等人，BioTechnology(1988) 6，1204-1210)、由 6 個His(組氨酸）殘基組成的 6XHis、 10XHis、人c-myc片段、VSV-GP片段、pl8HIV片段、T7-標簽、HSV-標簽、E-標簽、SV40T抗 原片段、Ick標簽、a-微管蛋白片段、B-標簽、蛋白C片段等。待與本發明的抗體融合的 其他多膚的實例包括GST(谷脫甘膚-S-轉移酶）、HA(流感血凝素）、免疫球蛋白恒定區、 目-半乳糖巧酶、MBP(麥芽糖結合蛋白）等。將商購的編碼此類膚或多膚的多核巧酸與編 碼本發明的抗體的多核巧酸融合，并且表達由此制備的融合多核巧酸，從而可W制備融合 多膚。
[0050] 本發明的抗體可W是與各種分子結合的綴合抗體，所述分子例如，聚合物物質，諸 如聚己二醇（PEG),透明質酸等，放射性物質，英光物質，發光物質，酶，毒素等。此類綴合 抗體可W通過化學修飾獲得的抗體而獲得。本領域中已經建立了抗體的修飾方法（例如， US5057313.US5156840)〇
[0051] 本發明的抗體優選是分離的或純化的。"分離的或純化的"意指去除除了目標組 分W外的組分的操作已被應用于天然存在的狀態。本發明的分離或純化的抗體的純度（本 發明的抗體的重量與總蛋白的重量的比率）通常為50%或更高，優選70%或更高，更優選 90%或更高，最優選95%或更高（例如，基本上100% )。
[0052] 在一個實施方案中，本發明的抗體具有與小鼠CD69 (優選小鼠CD69的胞外結構 域）的交叉反應性。"交叉反應性"意指特異性結合人CD69的抗體也通過抗原-抗體反應 結合小鼠CD69(優選小鼠CD69的胞外結構域）。具有與小鼠CD69的交叉反應性的本發明 的抗體的優異之處在于它可W甚至在不表達人CD69的小鼠中評價效力。
[0053] 在一個優選的實施方案中，具有與小鼠CD69的交叉反應性的本發明的抗體在含 有SEQIDN0:33顯示的氨基酸序列（YNCPG)的表位處結合人CD69。含有SEQIDN0:33 中顯示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續部分 序列組成的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長 度。作為含有SEQIDNO: 33顯示的氨基酸序列的表位，具體地，可W提到由SEQIDNO: 35 顯示的氨基酸序列組成的表位，和由SEQIDN0:36顯示的氨基酸序列組成的表位。
[0054] 作為具有與小鼠CD69的交叉反應性的本發明的抗體，可W提到W下（1)和（2)中 描述的抗體： (1) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3; 和 (2) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 CDR3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7 - 9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列 中取代、缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:10 - 12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個氨基酸。
[005引上述（1)或似中描述的抗體可W在W下表位處結合人CD69;包含SEQIDNO: 33 中顯示的氨基酸序列的表位（優選地，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續部分序 列組成的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長 度；更優選地，由SEQIDNO:35或SEQIDNO:36顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0056] 在一個實施方案中，本發明的抗體在由SEQIDN0:59顯示的氨基酸序列組成的表 位處結合人CD69。
[0057] 在一個實施方案中，本發明的抗體在含有SEQIDN0:78顯示的氨基酸序列 (YAGRE巧的表位處結合人CD69。含有SEQIDN0:78中顯示的氨基酸序列的表位包括， 例如，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續部分序列組成的表位，其含有SEQID NO:78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長度。作為含有SEQIDNO:78顯 示的氨基酸序列的表位，具體地，可W提到由SEQIDN0:57顯示的氨基酸序列組成的表位， 由SEQIDNO:58顯示的氨基酸序列組成的表位，和由SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組 成的表位。
[005引作為其他本發明的抗體，可W提到W下（3)-化）中描述的抗體： (3) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (4) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3 ; (5) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:1至3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4至6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個氨基酸；和 (6) 包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體， 其中所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的CDR3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDNO: 13至15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16至18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個氨基酸。
[005引上述（3)或（5)中描述的抗體在由SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組成的表位 處結合人CD69。
[0060]上述（4)或（6)中描述的抗體可W在W下表位處結合人CD69 :由SEQIDN0:78中 顯示的氨基酸序列組成的表位（優選地，由SEQIDN0:30中顯示的氨基酸序列的連續部分 序列組成的表位，其含有SEQIDNO: 78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長 度；更優選地，由SEQIDNO: 57、SEQIDNO: 58或SEQIDNO: 59顯示的氨基酸序列組成的 表位）。
[0061] (I)中描述的抗體關于與人CD69的結合親和力的Kd值優選不大于3xl〇-sM。當輕 鏈可變區中的CDR3具有SEQIDNO: 19顯示的氨基酸序列時，所述抗體關于與人CD69的結 合親和力的Kd值為優選不大于Ixicr8M，更優選不大于5xl(T9M，進一步優選不大于2xl(T9 M。當輕鏈可變區中的CDR3具有SEQIDN0:20顯示的氨基酸序列時，所述抗體關于與人 CD69的結合親和力的Kd值為優選不大于IxlO-SM，更優選不大于5xl〇-9M，進一步優選不大 于 3x10 9M。
[0062] (2)中描述的抗體關于與人CD69的結合親和力的Kd值優選不大于3xl〇-sM。
[0063] 當（2)中描述的抗體是包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體，其中 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO:7中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQIDNO:8 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 19中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且所 述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 11中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3, 除了在選自SEQIDN0:7、8和19中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10至12的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至 3個氨基酸， 所述抗體關于與人CD69的結合親和力的Kd值為優選不大于Ixicr8M，更優選不大于 5xl〇-9M,進一步優選不大于2xl〇-9M。
[0064] 當（2)中描述的抗體是包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體，其中 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO:7中顯示的氨基酸序列的CDRl，包含SEQIDNO:8 中顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 20中顯示的氨基酸序列的CDR3,并且所 述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 11中 顯示的氨基酸序列的CDR2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的CDR3， 除了在選自SEQIDN0:7、8和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、 缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自氨基酸序列SEQIDN0:10 - 12的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入和/ 或添加1至3個氨基酸，關于所述抗體與人CD69的結合親和力的Kd值為優選不大于1x10^8 M，更優選不大于5xl〇-9M，進一步優選不大于3xl〇-9M。
[0065] (3)或巧）中描述的抗體關于與人CD69的結合親和力的Kd值優選不大于5xl〇-s M。
[0066] (4)或化）中描述的抗體關于與人CD69的結合親和力的Kd值優選不大于8xl〇-9 M。
[0067]在（2)、妨和做的實施方案中，待取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸數目沒 有特別限制，只要所述抗體特異性結合人CD69,并且具有抑制過敏性炎癥的活性。它優選為 每一個CDR序列2個氨基酸W內，更優選一個氨基酸。其中取代、缺失、插入和/或添加氨 基酸的CDR序列的數目沒有特別限制，只要所述抗體特異性結合人CD69,并且具有抑制過 敏性炎癥的活性。它優選為每一個輕鏈可變區2W內，更優選為一，并且優選為每一個重鏈 可變區2W內，更優選為1。可W在輕鏈可變區和重鏈可變區兩者或它們的任一者中進行氨 基酸的取代、缺失、插入和/或添加。
[006引在（2)、妨和做的實施方案中，優選僅在輕鏈可變區中CDR3的氨基酸序列中取 代、缺失、插入和/或添加1 - 3 (優選1或2,更優選1)個氨基酸。
[0069] 在（2)的實施方案中，當在輕鏈可變區中CDR3的氨基酸序列中取代、缺失、插入和 /或添加1 - 3個氨基酸時，優選維持CDR3的氨基酸序列的第2個的絲氨酸和第3個的酪 氨酸。CDR3的氨基酸序列的第一個氨基酸是在谷氨醜胺和甘氨酸之間可相互取代的。CDR3 的氨基酸序列的第4個氨基酸是在天冬氨酸和蘇氨酸之間可相互取代的。CDR3的氨基酸序 列的第5個氨基酸是在絲氨酸和蘇氨酸之間可相互取代的。
[0070] 用于用其他期望的氨基酸取代一個或多個氨基酸殘基的方法的實例包括 定點誘變法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y, 和Nakagawa,M. (1995)An〇1igodeoxyribonucIeotide-directeddualambermethodfor site-directedmutagenesis.Gene152, 271-275;Zoller,MJ, 和Smith,M. (1983)Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors.MethodsEnzymoI. 100, 468-500;Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B,Pflugfelder,M,和Fritz,HJ(1984)ThegappedduplexDNAapproach tooligonucleotide-directedmutationconstruction.NucleicAcidsRes. 12, 9441-9456;KramerW,和FritzHJ(1987)Oligonucleotide-directedconstruction ofmutationsviagappedduplexDNAMethods.EnzymoI. 154, 350-367,KunkeI, TA(1985)Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypic selection.Proc化1:1AcadSciUSA. 82, 488-492)O使用該些方法，抗體中期望的氨 基酸可W被其他目標氨基酸取代。此外，使用文庫技術諸如框架改組（MolImmunol. 2007 Apr; 44(11):3049-60)和CDR修復化S2006 /0122377)等，框架或CDR中的氨基酸也可W 被其他適當的氨基酸取代。
[0071]在本發明的抗體中，作為待連接至CDR的抗體的框架區（FR)，選擇使得CDR形成良 好抗原結合位點的框架。盡管待用于本發明的抗體的FR沒有特別限制并且可W使用任何 FR,但優選使用人抗體的FR。作為人抗體的FR,可W使用具有天然序列的FR,或者可W根據 需要取代、缺失、插入和/或添加等具有天然序列的框架區中的一個或多個氨基酸，從而使 得CDR將形成適當的抗原結合位點。例如，可W通過測量和評價具有含取代的氨基酸的FR 的抗體與抗原的結合活性來選擇具有期望特性的突變體FR序列（Sato,K.等人，Cancer Res. (1993)53, 851-856)。
[007引在（1)和似的抗體中，人抗體的V13的FR化油at數據庫）優選用于輕鏈，并且 人抗體的V冊的FR化油at數據庫）優選用于重鏈。
[007引在做和妨的抗體中，人抗體的Vkl的FR化油at數據庫）優選用于輕鏈，并且 人抗體的VHlB的FR化油at數據庫）優選用于重鏈。
[0074] 在（4)和化）的抗體中，人抗體的Vk3的FR化abat數據庫）優選用于輕鏈，并且 人抗體的V冊的FR化油at數據庫）優選用于重鏈。
[0075] 用于本發明的抗體的恒定區沒有特別限制，并且可W使用任何恒定區。用于本發 明的抗體的恒定區的優選實例包括人抗體的恒定區（源自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM 等的恒定區）。例如，Cyl、Cy2、Cy3、Cy4、Cy、C5、Cal、Ca2、Ce可用于H鏈中，并 且Ck、C入可用于L鏈中。
[007引在（I)和似的抗體中，人抗體的CA的恒定區優選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區優選用于重鏈。
[0077]在做和妨的抗體中，人抗體的Ck的恒定區優選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區優選用于重鏈。
[007引在（4)和做的抗體中，人抗體的Ck的恒定區優選用于輕鏈，并且人抗體的Cy4 的恒定區優選用于重鏈。
[0079] 優選地，本發明的抗體包括W下： (1'）包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體，其中所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區包含SEQIDNO: 24中顯示的氨基 酸序列； (3'）包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體，其中所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 21 中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區包含SEQIDNO: 22中顯示的氨基酸序列；和 (4'）包含輕鏈可變區和重鏈可變區的抗體，其中所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 25 中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區包含SEQIDNO: 26中顯示的氨基酸序列。
[0080] 分別地，上述（1'）的抗體對應于上述（1)的抗體的優選實施方案，上述保）的抗 體對應于上述（3)的抗體的優選實施方案，并且上述（4'）的抗體對應于上述（4)的抗體的 優選實施方案。
[00引]上述（r)中描述的抗體可W在W下表位處結合人CD69 ;包含SEQIDNO:33顯示 的氨基酸序列的表位（優選地，由SEQIDNO:30中顯示的氨基酸序列的連續部分序列組成 的表位，其含有SEQIDN0:33中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長度；更優 選地，由SEQIDNO: 35或SEQIDNO: 36顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0082] 上述保）中描述的抗體可W在由SEQIDN0:59顯示的氨基酸序列組成的表位處 結合人CD69。
[0083] 上述（4'）中描述的抗體可W在W下表位處結合人CD69 ;包含SEQIDNO: 78顯示 的氨基酸序列的表位（優選地，由SEQIDNO:30中顯示的氨基酸序列的連續部分序列組成 的表位，其含有SEQIDN0:78中顯示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸長度；更優 選地，由SEQIDNO:57、SEQIDNO:58或SEQIDNO:59顯示的氨基酸序列組成的表位）。
[0084] 本發明提供了含有編碼上述本發明的抗體的核巧酸序列的多核巧酸。所述多核巧 酸可W是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合體。所述多核巧酸可W是雙鏈或單鏈的。當所述多 核巧酸是雙鏈的時，它可W是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA=RNA雜合體。
[0085] 本發明的多核巧酸涵蓋含有編碼本發明的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區兩者 的核巧酸序列的多核巧酸，和含有編碼本發明的抗體的重鏈可變區的核巧酸序列的多核巧 酸和含有編碼本發明的抗體的輕鏈可變區的核巧酸序列的多核巧酸的組合。
[0086] 本發明的多核巧酸可W基于本發明的抗體的氨基酸序列的信息、已知序列信息和 本說明書中序列表中描述的序列信息并且通過利用已知的基因重組技術容易地制備。例 女口，合適的引物基于序列信息設計，編碼構成本發明的抗體的元件的DNA通過PCR反應擴 增，DNA片段通過適當的酶諸如連接酶等連接，由此可W產生本發明的多核巧酸。或者，編 碼每個元件的多核巧酸可W基于本發明的抗體的氨基酸序列的信息通過多核巧酸合成儀 進行合成。
[0087] 獲得的編碼本發明的抗體的多核巧酸可W，根據目的，直接使用，或者當期望時用 限制性酶消化或添加接頭后使用。所述多核巧酸可W具有ATG作為5'末端側上的翻譯起 始密碼子，并且可W具有TAA、TGA或TAG作為3'末端側上的翻譯終止密碼子。該些翻譯起 始密碼子和翻譯終止密碼子可W使用合適的合成的DNA適配體進行添加。
[0088]本發明的多核巧酸優選是分離的或純化的。本發明的分離或純化的多核巧酸具有 通常50 %或更高，優選70 %或更高，更優選90 %或更高，最優選95 %或更高（例如，基本上 100%)的純度（本發明的多核巧酸的重量與總多核巧酸重量的比率）。
[0089] 本發明提供了包含上述本發明的多核巧酸的載體。本發明的載體涵蓋包含含有編 碼本發明的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區兩者的核巧酸序列的多核巧酸的載體，和包含 含有編碼本發明的抗體的重鏈可變區的核巧酸序列的多核巧酸的載體和包含含有編碼本 發明的抗體的輕鏈可變區的核巧酸序列的多核巧酸的載體的組合。所述載體優選是分離的 或純化的。所述載體的實例包括表達載體、克隆載體等，其可W根據對象來選擇。優選地， 所述載體是表達載體。表達載體可W表達本發明的抗體。表達載體可W通過將本發明的多 核巧酸可操作地連接至合適的表達載體中啟動子的下游來產生。載體的種類包括，例如，質 粒載體、病毒載體等，其可W根據待使用的宿主適當地選擇。
[0090] 作為宿主，使用屬埃希氏菌屬（Escherichia)(大腸桿菌巧scherichia coli) 等）、屬芽抱桿菌屬炬acillus)(枯草芽抱桿菌炬acillus subtilis)等）、酵母（釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等）、昆蟲細胞（源自甘藍夜蛾（Mamestra brassicae)的幼 蟲的建立的細胞系（草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)細胞；Sfcell)等）、昆蟲（家 蠶炬ombyx mori)的幼蟲等）、哺乳動物細胞（大鼠神經細胞，猴細胞（C0S-7等）、中國倉 鼠細胞（CH0細胞等）等）等。
[0091] 哺乳動物的實例包括，但不限于，實驗動物，諸如曬齒類動物，諸如小鼠、大鼠、倉 鼠和豚鼠等，兔等，家畜動物諸如豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等，伴侶動物，諸如狗、貓等，靈長 類動物諸如人、猴、食蟹猴（Macacafasci州laris)、恒河猴（Macacamulatta)、滅猴、猩猩、 黑猩猩等，等。
[0092] 質粒載體的實例包括源自大腸桿菌的質粒載體（例如，PBR322、PBR325、PUC12、 pUC13)，源自枯草芽抱桿菌的質粒載體（例如，pUB110、pTP5、pC194)，源自酵母的質粒載體 (例如，P甜19、p甜15)等，其可W根據待使用的宿主種類和使用對象適當地選擇。
[0093] 病毒載體的種類可W根據待使用的宿主種類和使用對象適當地選擇。例如，當昆 蟲細胞被用作宿主時，可W使用桿狀病毒載體等。當哺乳動物細胞被用作宿主時，可W使用 逆轉錄病毒載體，諸如莫洛尼鼠白血病病毒載體、慢病毒載體、辛德畢斯病毒載體等、腺病 毒載體、瘡疹病毒載體、腺伴隨病毒載體、細小病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺病毒載體等。
[0094]啟動子可W根據待使用的宿主種類進行選擇，并且可W選擇能夠在宿主中起始轉 錄的啟動子。例如，當宿主是屬埃希氏菌屬時，trp啟動子、Iac啟動子、T7啟動子等是優選 的。當宿主是屬芽抱桿菌屬時，SPOl啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等是優選的。當宿 主是酵母時，P冊5啟動子、PGK啟動子等是優選的。當宿主是昆蟲細胞時，多角體蛋白啟動 子、PlO啟動子等是優選的。當宿主是哺乳動物細胞時，亞基因組（26巧啟動子、CMV啟動 子、SRa啟動子等是優選的。
[0095] 本發明的載體可W含有用于抗體分泌的信號序列。作為當抗體產生于大腸桿菌的 周質中時抗體分泌的信號序列，可W使用pelB信號序列為（Lei,S.P.等人J.Bacteriol. (1987) 169，4379)。
[0096]當期望時，本發明的載體可W各自W可操作方式含有增強子、剪接信號、多聚腺巧 酸附加信號、選擇標記、SV40復制原點（W下有時簡稱為SV40ori)等。選擇標記的實例包 括二氨葉酸還原酶（W下有時簡稱為化化）基因[甲氨蝶嶺（MT幻抗性]、氨予青霉素抗性 基因（有時簡稱為Am。、新霉素抗性基因（有時簡稱為Ne〇t，G418抗性）等。
[0097] 通過經由本身已知的基因轉移方法（例如，脂質體轉染法、磯酸巧法、顯微注射 法、原生質體（proplast)融合法、電穿孔法、DEAE葡聚糖法、通過基因槍（GeneGun)的基 因轉移法等）將上述本發明的載體引入上述宿主，可W產生具有引入其中的載體的轉化體 (本發明的轉化體）。當表達載體被用作待引入的載體時，轉化體可W表達本發明的抗體。 本發明的轉化體可用于產生本發明的抗體等。
[009引本發明的抗體可W通過經由本身已知的方法根據宿主的種類培養本發明的轉化 體，并從培養物中分離本發明的抗體來制備。當宿主是屬埃希氏菌屬時，將轉化體在通常約 15-43C在適當的培養基諸如LB培養基、M9培養基等中培養約3-24小時。當宿主是屬芽 抱桿菌屬時，將轉化體在通常約30-4(TC在適當的培養基中培養約6-24小時。當宿主是酵 母時，將轉化體在通常約2(TC-35C在適當的培養基諸如Bur化older氏培養基等中培養約 24-72小時。當宿主是昆蟲細胞或昆蟲時，將轉化體在通常約27C在適當的培養基諸如用 約10%牛血清添加的Grace氏昆蟲培養基等中培養約3 - 5天。當宿主是動物細胞時，將轉 化體在通常約3(TC-4(rC在適當的培養基諸如用約10%牛血清添加的MEM培養基等中培養 約15 - 60小時。在任何培養中，必要時可W進行通氣和攬拌。
[0099] 至于通過基因工程的抗體生產方法，例如，可W提及Co,M.S.等人，J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976;Better,M.和Horwitz,A.比，MethodsEnzymol. (1989) 178, 476-496;Pluckthun,A.和Skerra,A.,MethodsEnzymol. (1989) 178, 497-515;Lamoyi,E.,MethodsEnzymol. (1986) 121, 652-663;Rousseaux,J.等 人，MethodsEnzymol. (1986) 121, 663-669;Bird,R.E.和Wa化er,B.W.,Trends Biotechnol. (1991) 9，132-137等。
[0100] 從培養物分離和純化本發明的抗體不W任何方式限制，并且可W采用通常用于抗 體純化的分離和純化方法。例如，抗體可W通過適當地選擇和組合層析柱、濾器、超濾、鹽 析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸觸、免疫沉淀、SDS-聚丙帰醜胺凝膠電泳、等電聚焦、透析、重結 晶等分離和純化。
[0101] 層析的實例包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層 析等(StrategiesforProteinPuri円cationandCharacterization:ALaboratory CourseManual.EdDanielR.Marshak等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1996)。該些層析可W通過使用液相層析，例如，液相層析諸如HPLC、FPLC等進行。待用于親 和層析的柱的實例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作為使用蛋白A的柱，可W提到Hyper D、P0R0S、Se地aroseFF(由GEAmershamBiosciences制造）等。本發明還涵蓋通過該些 純化方法高度純化的抗體。
[0102] 此外，本發明提供了含有上述本發明的抗體作為有效成分的藥物組合物。本發明 的藥物組合物也可用于預防或治療涉及人CD69的過敏性疾病和炎性疾病。目P，本發明還提 供了用于過敏性疾病或炎性疾病的預防劑或治療劑，其含有上述抗體作為有效成分。過敏 性疾病的實例包括，但不限于，過敏性哮喘、過敏性鼻炎、花粉癥、特應性皮炎、専麻疹、食物 過敏、過敏性結膜炎等。炎性疾病的實例包括，但不限于，慢性阻塞性肺疾病（COPD)、肺氣 腫、支氣管炎、間質性肺炎、肺纖維化、肺水腫、成人呼吸窘迫綜合征、類風濕性關節炎、賊毒 性休克、潰瘍性結腸炎、克羅恩病、再灌注損傷、慢性腎小球腎炎、內毒素休克、骨關節炎、多 發性硬化癥等。上述過敏性疾病或炎性疾病優選是呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中的過 敏性疾病或炎性疾病。呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中過敏性疾病的實例包括，但不限 于，過敏性哮喘等。呼吸器官（肺、支氣管、氣道等）中炎性疾病的實例包括，但不限于，慢 性阻塞性肺疾病（COPD)、肺氣腫、支氣管炎、間質性肺炎、肺纖維化、肺水腫、成人呼吸窘迫 綜合征等。
[0103]當本發明的抗體被"包含作為有效成分"時，意指本發明的抗體被包含作為至少一 種有效成分，并且不限制其含量。本發明的藥物組合物可W含有其他一種或多種有效成分 連同本發明的抗體。
[0104]本發明的抗體可W根據常規方法（例如，Remington'SPharmaceuticalScience, 最新版，MarkPublishingCompany,Easton,U.S.A)進行配制。此外，女n果需要，它 可W含有藥學上可接受的載體和/或添加劑。例如，它可W含有表面活性劑（陽G、Tween 等）、賦形劑、抗氧化劑（抗壞血酸等）、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩沖劑（磯酸鹽、 巧樣酸鹽、其他有機酸等）、馨合劑（邸TA等）、息浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、 助流劑、矯味劑等。不限于該些，本發明的藥物組合物可W適當地含有其他常規載體。具 體實例包括輕質無水娃酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、淀粉、駿甲基纖維素巧、駿甲基纖 維素軸、輕丙基纖維素、輕丙基甲基纖維素、聚己帰己縮酵二己基氨基己酸醋（polyvinyl acetaldieth}daminoacetate)、聚己帰化咯焼麗、明膠、中鏈脂肪酸H甘油醋、聚氧己帰氨 化當麻油60、藏糖、駿甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。它也可W含有其他低分子量多膚、 血清白蛋白、明膠和蛋白，諸如免疫球蛋白等，W及氨基酸。當配制用于注射的水溶液時，將 本發明的抗體溶解于，例如，含有鹽水、葡萄糖或其他助劑的等滲溶液中。助劑的實例包括 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、和氯化軸，并且可W與合適的增溶劑，例如醇（己醇等）、 多元醇（丙二醇、PEG等）、非離子表面活性劑（聚山梨醇醋80、肥0-50)等組合使用。
[0105] 在必要時，也可W將多膚包括在微膠囊（由輕甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙帰酸 甲醋]等制成的微膠囊）中，或配制作為膠體藥物遞送系統（脂質體、白蛋白微球、微乳 齊U、納米顆粒和納米膠囊等）（參見Remington'SpharmaceuticalScience第16版&, OsloEd. (1980)等）。此外，配制藥物作為緩釋的藥物的方法也是已知的，并且適用于多 膚（Langer等人，J.Biomed.Mater.Res. (1981) 15: 167-277;Langer,Qiem.Tech. (1982) 12: 98-105;美國專利號 3,773,919;EP-A-58, 481;Sidman等人，Biopolymers (1983) 22: 547-56;EP號133,988)。此外，也可W通過將透明質酸酶添加至本藥劑或與 本藥劑慘合W增加待皮下施用的液體量（例如，WO2004/078140等）。
[0106] 藥物組合物中本發明的抗體的含量為，例如，整個藥物組合物的約0.01 - 100 wt%，優選 0. 1 - 99. 9wt〇/〇。
[0107] 盡管本發明的藥物組合物可W口服和腸胃外施用，但其優選腸胃外施用。具體地， 通過注射或經皮施用將其施用于患者。作為注射的劑型的實例，可W通過靜脈內注射、肌內 注射、皮下注射等全身或局部施用。也可W通過局部注射、特別是肌內注射將其施用于治療 部位或其附近。經皮施用的劑型的實例包括軟膏、凝膠、乳膏、膏藥、貼劑等，其可W全身或 局部施用。此外，施用方法可W根據患者的年齡和癥狀適當地選擇。劑量可W選自，例如， 作為本發明的抗體的0.5mg-2.5mg/kg體重的范圍。然而，本發明的藥物組合物不受該 些劑量的限制。
[0108] 本發明提供了可用于分析人CD69在過敏性疾病、炎性疾病等中的功能的非人哺 乳動物。具體地，本發明提供了包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動物的轉移的 化2細胞的非人哺乳動物，其表達人CD69。
[0109] 非人哺乳動物的實例包括實驗動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔等，家畜動物諸 如豬、牛、山羊、馬、綿羊等，寵物諸如狗、貓等，靈長類動物諸如猴、猩猩、黑猩猩等。非人哺 乳動物優選為小鼠。
[0110] Th2細胞來源的CD69缺陷的非人哺乳動物的基因型對于本發明的非人哺乳動物 的動物物種可W是免疫學自身的（即同系的）或免疫學非自身的（即，同種異體或異種異 體的）。由于轉移的Th2細胞被長期植入體內，所W它優選免疫學自身的。
[0111] 是CD69缺陷的是指其中防止CD69基因本質具有的正常功能的足夠操作的狀態。 其實例包括CD69基因的表達完全不存在，表達水平降低（其中CD69基因本質具有的正常 功能不能充分表現），CD69基因產物的功能的完全喪失，和CD69基因產物的功能降低（其 中CD69基因本質具有的正常功能不能表現）。
[0112] CD69缺陷的非人哺乳動物優選是伴隨基因組DNA的修飾的動物，即，轉基因動物。 CD69缺陷的非人哺乳動物可W是CD69基因缺陷的雜合子，或CD69基因缺陷的純合子，優選 CD69基因缺陷的純合子。
[0113] CD69缺陷的非人哺乳動物可W通過W下獲得，例如，用誘導CD69基因的同源重組 的祀向載體轉染ES細胞W制備引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的ES細胞，從獲得的 ES細胞制備源自其的引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的子代動物，并且雜交子代動 物。對于CD69缺陷小鼠的產生，可W提及，例如，Murata,K.等人2003.Int.Immunol. 15: 987-992。
[0114] 抗原的類型沒有特別限制，只要其具有對CD69缺陷的非人哺乳動物的抗原性，并 且可W選擇期望的抗原。抗原的實例包括具有對CD69缺陷的非人哺乳動物的抗原性的蛋 白、膚、脂質、糖鏈等。
[0115] CD69缺陷的非人哺乳動物可W通過W足W用于免疫CD69缺陷的非人哺乳動物的 量注射抗原來用抗原進行免疫。例如，W 1- 3周內一次的頻率用抗原免疫CD69缺陷的非 人哺乳動物，總共2 -6次。對于免疫，可W將抗原連同佐劑施用于CD69缺陷的非人哺乳動 物。盡管佐劑沒有特別限制，只要它可W增強免疫原性，但可W提到，例如，氨氧化鉛、匙孔 誠血藍蛋白、葡聚糖、BCG、磯酸鉛、TLR配體（例如，脂多糖（LP巧，CpG)等。氨氧化鉛等優 選用于有效誘導Th2細胞。
[0116] 化2細胞是指通過抗原刺激從幼稚CD4T細胞分化且主要產生IL-4的CD4T細胞。
[0117] 化2細胞可W通過W下獲得，例如，從用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動 物脾臟或外周血中分離CD4T細胞，并且在抗原、抗原遞呈細胞、IL-2和IL-4存在的情況下 培養CD4T細胞。也可W使用固定的抗TCR抗體或抗CD3抗體來替代抗原。可W通過組合 使用固定的抗CD28抗體來更有效地誘導Th2細胞。
[0118] 獲得的細胞是否是Th2細胞可W通過用抗原刺激獲得的細胞，并通過流式細胞術 評價其相比于IFN-Y是否主要產生IL-4來證實。
[011引為了實現在CD69缺陷的非人哺乳動物的化2細胞中人CD69的表達，通常，用能夠 在非人哺乳動物的化2細胞中表達人CD69的表達載體轉染CD69缺陷的非人哺乳動物的 Th2細胞。作為載體，可W提到質粒載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。當使用逆轉錄病毒 載體時，可W將轉基因容易地整合至染色體中，并且可W穩定地持續人CD69的表達，甚至 當Th2細胞增殖時。因此，逆轉錄病毒載體優選用于本發明中。對于通過逆轉錄病毒基因 轉移至化2細胞中的細節，參見，例如，Kimura,M.等人2001.Immunity15: 275-287。
[0120] 化2細胞中人CD69的表達可W通過流式細胞術使用抗人CD69抗體來證實。
[0121] 可W將表達人CD69的用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動物的化2細胞通 過將Th2細胞靜脈內或腹膜內注射至受體非人哺乳動物而轉移至受體非人哺乳動物中。待 轉移的Th2細胞的數目沒有特別限制，只要在受體非人哺乳動物中可W觀察到轉移的化2 細胞對所述抗原的應答反應。當受體非人哺乳動物是小鼠時，例如，優選轉移1，〇〇〇,〇〇〇" 3, 000, 000 個Th2 細胞。
[0122] 轉移的化2細胞通過用特定抗原刺激而活化，W產生大量IL-4。因此，當本發明的 非人哺乳動物暴露于所述抗原時，由表達人CD69的Th2細胞介導的過敏性反應和與其相關 的炎癥反應發生。本發明還提供了此類非人哺乳動物過敏模型。使用本發明的非人哺乳動 物，可W很容易地在體內分析人CD69在過敏性反應和炎癥反應中的作用。此外，可W在非 人哺乳動物中進行抗人CD69抗體對過敏性疾病和炎性疾病的效力評價。
[0123] 本說明書中引用的所有參考文獻，包括出版物、專利文獻等，單獨地且明確地通過 引用并入本文，至其全部內容已明確地在本文公開的程度。 實施例
[0124] 本發明在下面通過參照實施例更詳細地進行解釋，所述實施例不應當被解釋為限 制性的。實施例中的各種基因操作遵循Molecularcloning第H版（ColdSpring化rbor L油.Press, 2001)中描述的方法。
[0125][實施例1] 杭原巧杭體的產牛 (1)人CD69重組蛋白的產生 由于人CD69經由半脫氨酸68形成同源二聚體，所W將編碼含有半脫氨酸68的 胞外區（氨基酸序列；62-199)的cDNA(NM_001781)插入用于大腸桿菌周質表達的載 體。將預先制備的大腸桿菌TGlF(-)菌株的感受態細胞狂-感受態大腸桿菌轉化緩沖組 (TransformationBufferSet):由ZYMORESEARCH制造）用該表達載體轉化，并且在 37°C 在含有氯霉素（終濃度34yg/mL)的LB瓊脂平板上培養過夜。將該大腸桿菌細胞接種在 2XYT培養基中，并在37 °C培養3-5小時（00600=0. 5-0. 8)。添加IPTG(終濃度0. 1ml),并 將混合物在25C培養過夜。通過離也收集培養的大腸桿菌細胞，并用裂解緩沖液（200ml 測酸鹽，160ml化Cl, 2ml抓TA, 1mg/ml溶菌酶，P服.0)裂解，并離也裂解物W得到可溶 性級分。從該可溶性級分，根據Strep-化Ctin柱（由IBA制造）的標準方法純化人CD69 同源二聚體蛋白。此外，通過SDS-PAGE證實純化的人CD69重組蛋白的純度不小于95 %，并 且通過使用BCA蛋白測定試劑盒（由PIERCE制造）測定蛋白濃度。
[0126] (2)人CD69重組蛋白的生物素化 根據EZ-LinkN服-PE〇4-Biotin(ThermoScientific)的標準方案將純化的人CD69重 組蛋白生物素化，并且通過使用BCA蛋白測定試劑盒（由PIERCE制造）測定濃度。
[0127] (3)通過瞻菌體展示方法選擇人CD69特異性抗體克隆 在4C將生物素化的人CD69重組蛋白固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠 值yn油eadsMyOneStreptavidinTl磁珠，由Invitrogen制造，100y1)上 1 小時，并且 用1mlPBST(含有0.05%Tween20的PB巧洗涂5次。使用用于人抗體瞻菌體文庫的 HuCALGOLD(由Mo^hoSys制造），根據WO2007/042309、WO2006/122797 等中描述的方 法進行抗體選擇。將人CD69-固定的珠添加至該瞻菌體文庫W結合抗原特異性抗體。將磁 珠回收并洗涂數次，并將瞻菌體從磁珠洗脫下來。用洗脫的瞻菌體感染大腸桿菌細胞，并在 37C培養過夜。從瞻菌體感染的大腸桿菌細胞搔救瞻菌體的操作遵循一般方法（Molecular cloning第H版ColdSpringHarborL油.Press, 2001)。將上述選擇輪次重復幾次，W 濃縮展示對于抗原特異性的抗體的瞻菌體。
[0128] (4)通過化ISA篩選抗原特異性抗體 將濃縮操作后獲得的Fab基因的合并物亞克隆到大腸桿菌表達載體中。根據WO2006/122797等中描述的方法，表達F油抗體，并通過化ISA方法篩選抗原特異性抗體。根 據Strep-化Ctin柱（由IBA制造）的標準方法從大腸桿菌裂解物的可溶性級分純化F油抗 體。此外，通過SDS-PAGE證實純化的抗體的純度，并且通過使用BCA蛋白測定試劑盒（由 PIERCE制造）測定濃度。
[0129] (5)通過細胞染色評價篩選抗體克隆 通過人CD69和小鼠CD69過表達細胞的細胞染色進一步評價純化的化ISA陽性的F油 抗體克隆的抗原反應性。作為抗原，使用在使用化eeSt^eMAX試劑（由Invitrogen制 造）通過標準方法用人CD69或小鼠CD69表達載體轉染后48小時用4%PFA固定的CHO-S 細胞。用50yg/ml純化的F油抗體作為用于染色的一抗，將細胞在室溫下賠育1小時，并 且用PBS洗涂3次。用500倍稀釋的Alexa555標記的抗人IgG(由Invitrogen制造）作為 二抗，將細胞在室溫下賠育1小時，并且用PBS洗涂3次。在英光顯微鏡（1X71，由OLYMPUS 制造）下觀察該些細胞，并且評價染色存在與否。作為結果，證實160-C76克隆結合人CD69 化CD69)和小鼠CD69 (mCD69)兩者（圖1)，并且160-(:7和160-C103僅結合人CD69,并且 最終獲得總共3個克隆作為特異性結合細胞表面上的天然形式人CD69的抗人CD69抗體克 隆。
[0130] (6)抗人CD69抗體克隆的堿基序列的分析 培養獲得的H個大腸桿菌克隆（160-^、160-c76和160-C103)，并且將質粒回收(QIAprepSpin微量制備試劑盒：由QIAGEN制造），并用于堿基序列分析。表1顯示各個克 隆的CDR(互補決定區）的氨基酸序列。

【權利要求】
1. 特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且具有與小鼠CD69的 交叉反應性。
2. 根據權利要求1的抗體，其在包含SEQIDNO:33顯示的氨基酸序列的表位處結合人 CD69。
3. 根據權利要求1的抗體，其包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中 (1) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 ⑶R3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:10中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 或 (2) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 7中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO:8中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 9、19或20中顯示的氨基酸序列的 ⑶R3,并且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 10中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQ IDNO: 11中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 12中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDNO: 7-9、19和20中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取 代、缺失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 10-12中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個氨基酸。
4. 根據權利要求3的抗體，其中 (1'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 23、27或28中顯示的氨基酸序列，并且所述重 鏈可變區包含SEQIDNO: 24顯示的氨基酸序列。
5. 特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并在包含SEQIDNO: 59 或78顯示的氨基酸序列的表位處結合人CD69。
6. 特異性結合人CD69的抗體，其具有抑制過敏性炎癥的活性，并且包含輕鏈可變區和 重鏈可變區，其中 (3) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO:6中顯示的氨基酸序列的⑶R3 ; (4) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的⑶R3 ; (5) 所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 1中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 3中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并且 所述重鏈可變區含有包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQIDN0:5中 顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDN0:6中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDNO: 1-3中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、 插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDN0:4-6中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插入 和/或添加1至3個氨基酸；或 (6)所述輕鏈可變區含有包含SEQIDNO: 13中顯示的氨基酸序列的⑶R1，包含SEQID NO: 14中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 15中顯示的氨基酸序列的⑶R3,并 且所述重鏈可變區含有包含SEQIDNO: 16中顯示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQIDNO: 17 中顯示的氨基酸序列的⑶R2,和包含SEQIDNO: 18中顯示的氨基酸序列的⑶R3， 除了在選自SEQIDN0:13-15中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加1至3個氨基酸，和/或 在選自SEQIDNO: 16-18中顯示的氨基酸序列的至少一條氨基酸序列中取代、缺失、插 入和/或添加1至3個氨基酸。
7. 根據權利要求6的抗體，其中 (3'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 21中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區 包含SEQIDNO: 22顯示的氨基酸序列；或 (4'）所述輕鏈可變區包含SEQIDNO: 25中顯示的氨基酸序列，并且所述重鏈可變區 包含SEQIDNO: 26顯示的氨基酸序列。
8. 根據權利要求1-7中任一項的抗體，其關于與人CD69的結合親和力具有不大于 5xl0_8M的KD 值。
9. 根據權利要求1-8中任一項的抗體，其是人抗體。
10. 藥物組合物，其包含根據權利要求1-9中任一項的抗體。
11. 用于過敏性疾病或炎性疾病的預防劑或治療劑，其包含根據權利要求1-9中任一 項的抗體。
12. 多核苷酸，其編碼根據權利要求1-9中任一項的抗體。
13. 載體，其包含根據權利要求12的多核苷酸。
14. 轉化體，其包含根據權利要求13的載體。
15. 非人哺乳動物，其包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳動物的轉移的Th2 細胞，其中所述Th2細胞表達人⑶69。
16. 根據權利要求15的非人哺乳動物，其中所述非人哺乳動物是小鼠。
17. 根據權利要求1-9中任一項的抗體，其用于預防或治療過敏性疾病或炎性疾病。
18. 用于哺乳動物中預防或治療過敏性疾病或炎性疾病的方法，其包括將有效量的根 據權利要求1-9中任一項的抗體施用于所述哺乳動物。
19. 根據權利要求1-9中任一項的抗體用于生產預防或治療過敏性疾病或炎性疾病的 藥劑的用途。
【文檔編號】C12N1/21GK104379741SQ201380021553
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月23日 優先權日:2012年4月23日
【發明者】古城周久, 宮越陽, 加藤靜惠, 對比地久美子, 速水友紀, 中村美紀子, 中山俊憲, 巖村千秋 申請人:基因先端領域株式會社, 國立大學法人千葉大學