用于瞬時轉染完整植物的農桿菌的制作方法

用于瞬時轉染完整植物的農桿菌的制作方法
【專利摘要】一種瞬時轉染植物或植物上的葉的方法，包括使所述植物或所述葉與包含農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的細胞的懸液接觸，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir質粒或所述vir質粒的衍生物。
DSM 25686
2012.02.23
【專利說明】用于瞬時轉染完整植物的農桿菌 發明領域
[0001] 本發明涉及瞬時轉染植物或植物上的葉的方法。本發明還涉及在植物中或在植物 上的葉中瞬時表達目的DNA序列的方法。另外，本發明涉及農桿菌（Agrobacterium)菌株。
[0002] 發明背景
[0003] 用于農業的當前基因工程方法均基于1983年首次闡明（Fraley等人1983 ; Barton等人1983)并自1996年商業化的作物物種的穩定基因修飾。盡管基于植物穩定遺 傳轉化的農業方法如今是現實并且是成功新實踐的基礎，但它具有多種限制，主要限制是 開發轉基因作物所需的時間很長和成本高昂。參與植物生物技術的公司之間的一般共識是 取決于作物物種，研發過程需要8 - 16年，并且平均開發總成本估計在一億和一億五千萬 美元之間。因為這些限制，自從發現植物遺傳轉化方法以來超過25年后，僅少量性狀和少 數GM作物物種迄今已商業化。
[0004] 已知也可以使植物細胞和全株植物短暫再編程（即，沒有新遺傳物質穩定整合在 植物染色體上），并且瞬時方法例如病毒感染快捷。此類瞬時方法原則上可以允許非常快速 地調節植物代謝，有利于用戶感興趣的某些產物。此類方法要求已經被工程化以有效和安 全地轉染植物的DNA或RNA載體（病毒或細菌）。早期嘗試使用基于植物病毒的載體已經部 分獲得成功，在于它們允許轉染植物以制造高價值的重組蛋白質，例如某些生物藥（Gleba 等人2007, 2008 ;Lico等人2008)。文獻中已經描述利用病毒操縱其他性狀例如輸入性狀 (例如除草劑抗性，Shiboleth等人2001 ;Zhang和Ghabiral 2006)，但病毒轉染在感染的 宿主中引入如此多不想要的變化，從而不再繼續尋求這類瞬時方法用于輸入性狀。瞬時方 法還可以圍繞農桿菌（Agrobacterium)物種將其Ti質粒的部分轉移給真核細胞（特別是 植物細胞）的能力進行構建。使用基于農桿菌的轉染是用于遺傳操縱例如遺傳轉化方案和 實驗室瞬時轉染試驗的基礎。基于農桿菌的轉染的工業應用也局限于重組蛋白質制造，原 因是最佳應用條件（例如用細菌懸液對植物的真空滲入）不能在田間大規模使用，而用細 菌溶液噴灑地上部分或澆灌植物導致轉染據推測非常小部分的植物細胞，并且先前研究根 本未解決這個具體問題。
[0005] 根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)和發根農桿菌（A. rhizogenes)在世 界上廣泛用于研究實驗室中，用于植物的瞬時轉染和穩定遺傳轉化。這些應用基于農桿菌 將遺傳信息轉移給真核細胞的能力。目前培養的許多轉基因植物例如大豆、卡諾拉油菜和 棉，通過農桿菌介導的遺傳轉化產生。在瞬時轉化和穩定轉化之間的本質差異是：在穩定轉 化的方法中,農桿菌遞送的DNA最終整合到植物染色體中，并且隨后由植物子代繼承。此類 整合事件甚至在專門設計以提供植物細胞和細菌之間大量接觸的實驗室實驗中是稀有的； 因此為了選擇穩定轉化體，不得不利用專用選擇性篩選方法并且使用為最佳轉化和再生成 完整植物而選擇的特定植物外植體（富含分生組織）。因此，在這個科學領域積累的知識對 于對瞬時方法有興趣的那些人而言價值有限，在瞬時方法中應影響植物體的許多細胞，但 不選擇被轉染的細胞。
[0006] 另一方面，瞬時轉染僅考慮農桿菌驅動的向植物細胞核遞送DNA的早期步驟以及 下述事實：此類遞送的DNA分子可以在胞核中轉錄，甚至在DNA不整合到植物染色體的情況 下，這種表達導致植物細胞的瞬時代謝性再編程。已經將這種再編程開發成用于快速評價 不同遺傳實驗的實驗工具。盡管存在關于農桿菌介導向植物細胞轉移DNA的大量知識，但 是這種信息總是限于實驗室規模的實驗，并且因而迄今為止，極少嘗試開發涉及農桿菌作 為DNA載體的工業規模應用。
[0007] 實驗室應用的局限之一是：基于農桿菌的DNA遞送要求難以或不可能在大田或大 規模應用的某些處理。在常見的瞬時實驗中，將培養的植物細胞或植物部分（外植體）用 過量細菌處理，以提供最大程度的遞送。在常見的研究實驗中，人們還對如果按工業規模進 行則經濟上不可行的表達水平感興趣。一般而言，這個領域內進行的研究已使研究者引出 這樣的結論：嚴重影響瞬時表達的參數是允許農桿菌與植物體內的植物細胞實現最佳相互 作用的那些參數。此類研究大多數利用真空滲入、注射入植物葉內或表面活性劑處理，弄創 植物表面（例如用刀片）、或其組合。事實上，正在開發不涉及（基于病毒）進一步擴增原 始DNA的用于商業生產重組蛋白質的基于農桿菌的轉染方法的唯一團隊是Medicago的團 隊（D' Aoust等人2008, 2009 ;Vezina等人，2009)。他們的方法完全依賴于真空滲入作為 遞送方法。然而，因為基于大大過量的細菌與植物細胞比，用于植物瞬時轉染的當前實驗室 方案不具有真正的轉化價值，即，它們不能直接按工業水平重復。除了少數情況之外（例如 Vaquero等人，1999, D' Aoust等人，2008, 2009)，他們仍未定量地解決瞬時轉染方法的效率 問題。（此類研究的例子是大量的，我們僅引用少數代表性例子：Li等人，1992 ;Liu等人， 1992 ;Clough 和 Bent，1998 ;De Buck 等人，1998, 2000 ;Chung 等人，2000 ;Yang 等人，2000 ; Zambre 等人，2003 ;Wroblewski 等人，2005 ;Lee 和 Yang，2006 ;Zhao 等人，2006 ;Shang 等 人，2007 Jones 等人，2009 ;Li 等人，2009 ;De Felippes 和 Weigel，2010)。
[0008] 目前尚在開發中的工業方法之一是magnifection，一種基于農桿菌真空滲入植物 葉的方法。magnifection法（由Icon Genetics GmbH注冊為magn丨CON_*_商標且由幾 項專利/專利申請覆蓋）是一種用于植物中異源蛋白質表達的簡單和可無限放大規模的 方案，該方案避免植物的穩定遺傳轉化，而依賴于由農桿菌以DNA前體形式遞送到植物體 的多個區域（全身性遞送）的病毒載體瞬時擴增。這種方法實質上是用攜帶編碼病毒RNA 復制子的T-DNA的農桿菌的稀釋懸液滲入完整成熟植物。在這個方法中，細菌承擔初始感 染和全身移動的（以前是病毒）功能，而病毒載體提供細胞至細胞的（短距離）傳播、擴增 和高水平蛋白質表達。放大（工業）形式圍繞完全裝配的病毒載體（而不是要求在植物中 裝配的前載體）建立并且要求通過真空滲入將農桿菌高通量遞送至完整植物的裝置。該方 法可以放大，但它要求植物的地上部分在真空下浸入細菌懸液內（該過程涉及顛倒盆中或 盤中培育的植物），這是一個在以下方面造成限制的流程：可以按這種方式處理的生物量 的體積、該方法的通量、在處理前可以培養植物的方式，并且它還帶來一些成本，這些成本 將該方法的用途限于高成本產品，例如僅僅用于重組生物藥。magnifection法是有效的， 因為它允許轉染所處理植物中的幾乎全部葉細胞、或約50%的總地上植物生物量（剩余部 分是莖和葉柄）。該方法已經以許多方式優化，參見例如Marillonnet等人，2005。然而， 當前方法完全圍繞細菌遞送方法構建，例如注射到植物葉中或真空滲入（例如Simmons等 人，2009)、弄傷葉（Andrews 和 Curtis, 2005)，或將農桿菌傾入土壤中（'agrodrenching'， Ryu等人，2004 ;Yang等人，2008)，但是這些方法不能用于大量處理田間植物（在Gleba等 人，2004、2007、2008 中綜述；Gleba 和 Giritch，2010、2011 ;Lico 等人，2008 ;我們研究組 的原著包括 Giritch 等人 2006 ;Marillonnet 等人，2004, 2005 ;Santi 等人，2006 ;和來自 其他研究團隊的思路上相似的論文-Voinnet等人，2003 ;Sudarshana等人，2006 ;Gao等 人，2006 ;Mett 等人，2007 ;Lindbo, 2007a, b ;Plesha 等人，2007, 2009 ;Huang 等人，2006 ; Regnard 等人 2009 ;Green 等人，2009 ;Shoji 等人，2009)。
[0009] 在無真空滲入下對完整植物（在植物中）使用農桿菌處理的嘗試已經產生極低數 目的初始轉染的細胞，從而大大限制該方法的實際應用。另外，由于在瞬時轉染系統中未選 擇轉染的植物細胞，如果避免真空滲入，則對于大規模應用而言，整個瞬時轉染方法的效率 太低。另外，幾個植物物種如大豆或油籽油菜難以由農桿菌轉染，除非使用特定植物組織， 因而在植物中瞬時轉染尚未明顯程度地實現。
[0010] 發明簡沭
[0011] 從現有技術出發，本發明的一個目的是提供在植物中瞬時轉染的有效方法。本發 明的另一個目的是提供在植物中瞬時表達目的DNA序列的有效方法。另外，本發明的一 個目的是提供一種在不需要應用壓力差以將農桿菌引入植物的細胞間隙內情況下允許大 (工業）規模（即，平行針對許多植物）使用農桿菌瞬時轉染植物的有效方法。再一目的是 提供適用于這個目的的農桿菌細胞和菌株。
[0012] 這些問題由一種瞬時轉染植物或植物上的葉的方法解決，所述方法包括使所述植 物或所述葉與包含以登錄號DSM25686保藏的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的 細胞的懸液接觸，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌 株CryX的vir質粒或所述vir質粒的衍生物。
[0013] 還提供一種在植物中瞬時表達目的DNA序列的方法，所述方法包括使所述植物或 所述植物上的所述葉與包含以登錄號DSM25686保藏的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍 生菌株的細胞的懸液接觸，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌 株含有菌株CryX的vir質粒或所述vir質粒的衍生物。
[0014] 本發明也提供具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生 菌株，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 質粒或所述vir質粒的衍生物；或菌株CryX或所述衍生菌株的農桿菌細胞。
[0015] 本發明也提供具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX細胞或其衍生物，所 述細胞含有雙元載體，所述雙元載體含有在T-DNA中待轉染至植物細胞的目的DNA序列，其 中所述雙元載體可以編碼來自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定義的密切相關的VirG蛋 白。
[0016] 本發明還提供一種試劑盒，其包含：
[0017] -如上文定義的所述菌株或所述衍生菌株的農桿菌細胞和
[0018] -含有在T-DNA中待轉染至植物細胞中的目的DNA序列的雙元載體。
[0019] 該雙元載體可以編碼來自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定義的密切相關的VirG 蛋白。
[0020] 本發明也提供菌株CryX的vir質粒和具有菌株CryX的染色體的農桿菌細胞。
[0021] 本發明還提供具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生 菌株（如本文定義）的含水細胞懸液，所述懸液具有最多I. IxlO6CfuAil懸液、優選地最多 4. 4xl05cfu/ml懸液和更優選地最多I. lxl05cfu/ml懸液的細胞濃度。
[0022] 本發明的發明人已經發現一種強烈增加農桿菌瞬時轉染植物的效率的方式。發 明人已經鑒定了用廣泛類型的植物在植物中瞬時轉染時實現特別高的效率的農桿菌菌株 (農桿菌菌株CryX)。尤其地，與作為植物轉化或轉染的標準使用的其他農桿菌菌株如菌株 LBA4404或EHA105相比，菌株CryX實現高得多的植物中瞬時轉染效率（參見Slater等人 的第 64 頁，引自：Plant Biotechnology，第 2 版，Oxford University Press，2008)。發明 人還已經發現菌株CryX比相關的農桿菌菌株如Chry5/KYRT1實現更高的瞬時轉染效率。另 夕卜，發明人已經發現，在chrysopine型或琥拍堿（succinamopine)型根癌農桿菌菌株中表 達VirG基因、尤其來自農桿菌菌株LBA4404的VirG基因或與來自LBA4404的VirG基因密 切相關的VirG基因時，可以獲得特別高的轉染效率。
[0023] 附圖簡沭
[0024] 圖IA和圖IB顯示在實施例中使用的載體的帶有目的DNA序列的T-DNA區域。 Pact2 :擬南芥（Arabidopsis)肌動蛋白2基因啟動子；〇 :來自TVCV(蕪菁脈明病毒（turnip vein clearing virus))的5'末端；RdRp:來自cr-TMV(感染十字花科植物的煙草花葉 病毒）的RNA依賴性RNA聚合酶可讀框（ORF) ;MP :來自cr-TMV的移動蛋白ORF ;N :來自 cr-TMV的3'-非翻譯區；Tnos或nos :胭脂堿合酶終止子；間斷RdRp和MP ORFs中灰色區段 的白色區段表示插入這些ORF中以增加植物細胞胞質中RNA復制子形成可能性的內含子， 這在WO 2005049839中詳述；⑶S :⑶S蛋白的編碼序列；GFP :綠色熒光蛋白編碼序列；fs : 消除細胞至細胞移動能力的移碼；P35S :35S啟動子；P19 :番茄叢矮病毒的基因沉默阻抑蛋 白（參見 Plant J. 33, 949-56) ;Tocs :ocs 終止子；LB :T-DNA 左邊界；RB :T-DNA 右邊界。
[0025] 圖2顯示不同根癌農桿菌菌株的瞬時轉染效率的比較。照片顯示UV光下感染后 4日（4dpi)的GFP熒光，所述GFP熒光歸因于如實施例2中所述用稀釋的農桿菌培養物注 射器滲入本塞姆氏煙草（Nicotiana benthamiana)葉后基于TMV的GFP表達。數字10' 10_3和10_4表示對600nm處OD = 1. 3的過夜農桿菌培養物的濃縮倍數，其分別對應于IO2倍、IO3倍和IO4倍稀釋。用于滲入的緩沖液的組成是5mM MES、pH 5. 5和IOmM MgSO4。使 用同一植物的三片獨立葉一式三份進行每次滲入。
[0026] (A)能夠進行細胞至細胞移動的基于TMV的載體：TMV (MP) -GFP (pNMD560)。
[0027] (B)缺乏細胞至細胞移動能力的基于TMV的載體：TMV (fsMP) -GFP (pNMD570)。
[0028] 1-根癌農桿菌菌株AGLl ;
[0029] 2-根癌農桿菌菌株EHA105 ;
[0030] 3-根癌農桿菌菌株GV3101 ;
[0031] 4-根癌農桿菌菌株ICF320 ;
[0032] 5-根癌農桿菌菌株CryX ;
[0033] 6-根癌農桿菌菌株LBA4404 ;
[0034] 7-根癌農桿菌菌株LBA9402。
[0035] 圖3展示virG基因過量表達對AGL1、EHA105、ICF320和GV3101菌株瞬時轉染效 率的影響。來自GV3101和LBA4404菌株的攜帶N54D突變的VirG序列以及來自LBA4404菌 株的天然序列用于比較。照片顯示UV光下感染后4日（圖3A)和感染后6日（圖3B)的 GFP熒光，所述GFP熒光歸因于如實施例3中所述用稀釋的農桿菌培養物注射器滲入來自 3個獨立植株的年齡相同的本塞姆氏煙草葉后基于TMV的GFP表達。數字10_2、10_3和10_ 4顯示降低600nm處OD = 1. 3的過夜農桿菌培養物的細胞濃度的倍數。因此，倍數10_2、10_3和1〇_4分別對應于IO2UO3和IO4倍稀釋。用于滲入的緩沖液的組成：5mM MES、pH 5. 3和 IOmM MgCl2。在全部情況下使用能夠進行細胞至細胞移動的基于TMV的載體。
[0036] I - GV3101 中的 pNMD560(無 virG);
[0037] 2-GV3101 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0038] 3-GV3101 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0039] 4-GV3101 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0040] 5-ICF320 中的 pNMD560 (無 virG);
[0041] 6-ICF320 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0042] 7-ICF320 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0043] 8-ICF320 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0044] 9-EHA105 中的 pNMD560 (無 virG);
[0045] 10-EHA105 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0046] 11-EHA105 中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404);
[0047] 12-EHA105 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0048] 13-AGL1 中的 pNMD560 (無 virG);
[0049] 14-AGL1 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0050] 15-AGL1 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0051] 16-AGL1 中的 pNMD062 (virG/LBA4404)。
[0052] 圖4A和圖4B顯示virG基因過量表達對GV3101和CryX菌株瞬時轉染效率的影 響。來自GV3101和LBA4404菌株的攜帶N54D突變的virG序列以及來自LBA4404菌株的 天然序列用于比較。照片顯示UV光下感染后3、4、5日的GFP熒光，所述GFP熒光歸因于如 實施例3中所述用稀釋的農桿菌培養物注射器滲入來自3個獨立植株的年齡相同的本塞姆 氏煙草葉后基于TMV的GFP表達。數字KT4和KT5表示對600nm處OD = 1. 3的過夜農桿 菌培養物的濃縮倍數。用于滲入的緩沖液的組成：5mM MES、pH 5. 3和IOmM MgCl2。使用能 夠進行細胞至細胞移動的基于TMV的載體。
[0053] 1-GV3101 菌株中的 pNMD560(無 virG);
[0054] 2-GV3101 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0055] 3-GV3101 菌株中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0056] 4 - CryX 菌株中的 pNMD560 (無 virG);
[0057] 5-CryX 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0058] 6-CryX 菌株中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404)。
[0059] 圖5顯示使用注射器滲入本塞姆氏煙草葉時在過夜農桿菌培養物的從KT3至KT 7一系列稀釋范圍內CryX菌株和GV3101菌株瞬時轉染效率的比較。數字10_3、10_4、10_ 5、10_6和KT7表示對600nm處OD = 1. 3的過夜農桿菌培養物的濃縮倍數。這些濃縮倍數分別對 應于103、104、105、106和10 7倍稀釋。用于滲入的緩沖液的組成：在水中511111^、？115.3和 IOmM MgCl2。在感染后4日拍攝照片。
[0060] 1-GV3101 菌株中的 pNMD560(無 virG);
[0061] 2-GV3101 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0062] 3-GV3101 菌株中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0063] 4_(：巧父菌株中的？匪0560(無￥化6);
[0064] 5-CryX 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0065] 6-CryX 菌株中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404)。
[0066] 圖6顯示使用農桿菌細胞懸液噴灑法測試不同農桿菌菌株瞬時轉染大豆的結果。 將 PNMD2190 構建體（質粒骨架中的 35S:GUS ;35S:pl9 和 virGN54D/LBA4404)用于 AGL1、 EHA105, CryX和LBA4404菌株；將pNMD2180構建體（質粒骨架中的35S:⑶S ;35S:pl9和 virGN54D/GV3101)用于GV3101和ICF320菌株。在感染后11日針對⑶S活性進行葉的染 色。
[0067] (A)對于噴灑，將OD6tltl = L 3的液體農桿菌培養物用含有5mM MES，pH 5. 3 ;IOmM MgCl2和〇? 05 % (v/v) Tween? 20的緩沖液以I: io的比例稀釋。
[0068] ⑶對于噴灑，將OD6tltl = 1. 3的液體農桿菌培養物以1:10、1:100和1:1000的比 例用按〇? 3% (w/v)濃度補充以Size 800的碳化硅粒子的（含有5mM MES，pH 5. 3 ;10mM MgCl2 和 0? 05% (v/v) Tween?: 20 的）緩沖液稀釋。
[0069] 圖7顯示使用農桿菌細胞懸液噴灑法測試CryX菌株和EHA105菌株瞬時轉染陸地 棉（Gossipium hirsutum L.)的結果。對于噴灑，將0D_= 1.3的液體農桿菌培養物用含 有 5mM MES，pH 5. 3 ;10mM MgCl2 和 0? 25% (v/v)Silwet L-77 的緩沖液以 1:10 比例稀釋。 為了測試，使用構建體pNMD1971 (35S:⑶S ;35S:pl9)，pNMD2180(質粒骨架中的35S:⑶S ; 355卬19和￥1冗陽40/673101)和口匪02190(質粒骨架中的355:(^5;355:口19和 ￥1冗陽40/ LBA4404)。在感染后6日進行⑶S活性測試。
[0070] 圖8顯示使用能夠進行細胞至細胞移動的基于TMV的載體（TMV-GFP，pNMD560載 體），對從不同實驗室收到的兩個根癌農桿菌Chry5/KYRT1菌株獲得物的比較。照片顯示 UV光下感染后4日（4dpi)的GFP熒光，所述GFP熒光歸因于如實施例8中所述用600nm處 OD = 1. 3的經稀釋過夜農桿菌培養物注射器滲入本塞姆氏煙草葉后基于TMV的GFP表達。 從肯塔基大學G. Collins博士實驗室（列克星敦，美國）獲得的菌株在每片葉的右側上滲 入。來自細胞生物學和遺傳工程研究所（ICBGE，基輔，烏克蘭）的菌株在每片葉的左側上滲 入。用于滲入的緩沖液的組成是5mM MES、pH 5. 5和IOmM MgSO4。使用同一植物的三片獨 立葉一式三份進行每次滲入。
[0071] I-ICBGE 獲得物（accession)，濃縮倍數 KT1 (10 倍稀釋）；
[0072] 2-ICBGE獲得物，濃縮倍數10_2 ;
[0073] 3-ICBGE獲得物，濃縮倍數10_3 ;
[0074] 4-肯塔基大學獲得物，濃縮倍數KT1 ;
[0075] 5-肯塔基大學獲得物，濃縮倍數KT2 ;
[0076] 6-肯塔基大學獲得物，濃縮倍數10'
[0077] 本發明的詳細描沭
[0078] 在本發明中，將特定類別的根癌農桿菌菌株用于瞬時轉染植物，如植物上的葉。這 種類別的農桿菌包含根癌農桿菌菌株CryX及其如下文定義的衍生菌株。根據布達佩斯條 約，將菌株CryX在2012年2月23保藏于DSMZ-德意志微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),位于德國茵霍芬街 7B(Inhoffenstra3e 7B)，38124布勞恩斯切魏格。已經賦予它登錄號DSM25686。菌株CryX具有染色體整合的 利福平抗性。
[0079] 菌株CryX與已經在1991年由Busch和Puepke鑒定的源自菊花（Chrysanthemum morifolium)的農桿菌菌株Chry5相關。在他們的論文中，已經顯示按常規的生物型 試驗，該菌株是生物型I并且它在至少10個植物物種上產生腫瘤。已經將它表征為不 尋常的，原因在于它能夠在大豆（Glycine max)上高效地形成大腫瘤并且出于這個原 因，它隨后由眾多研究小組在許多論文中進一步表征。Chry5不能利用章魚堿或甘露 堿作為碳源；相反，它能夠異化每種胭脂堿和琥珀堿的單種異構體，同時它對土壤桿菌 素84不敏感（Busch和Puepke, 1991)。此外，Chry5菌株誘導的腫瘤產生一個阿馬多 里型冠癭堿（Amadori-type opine)家族，其包括脫氧果糖基谷氨酰胺（Dfg)及其內酯 chrysopine (Chy) (Palanichelvam等人，2000)。已經顯示Chry5的分離株含有至少兩種質 粒，一種與pTiB6具有同源性。Torisky等人（1997)已經通過同源重組從Chry5的285-kb Ti質粒移除包含約4kb致癌性T-DNA的大約16. 5kb區段，部分地使該菌株卸甲。已經顯示 這個缺失突變體（命名為KYRT1)是有效的載體生物，并且從那時起，這種部分卸甲的Chry5 衍生物已經由一些研究者使用。另外最近，Palanichelvamet等人（2000)已經開發出充分 卸甲的衍生物。
[0080] 在導致本發明的研究中，發明人已經首次測試了來自不同實驗室的兩個登錄號的 Chry5/KYRT1。從G. Collins博士實驗室（Torisky等人，1997)獲得的菌株在我們的瞬時研 究中不顯示勝過標準比較菌株EHA105和GV3101的任何優越性并從進一步研究排除。在另 一方面，已經發現來自細胞生物學和遺傳工程研究所（烏克蘭的基輔）的登錄號在其瞬時 轉染和表達效率方面異常有效并且已經在本發明中使用。將后一個登錄號根據布達佩斯條 約在官方保藏機構DSMZ-德意志微生物保藏中心，位于德國布勞恩斯切魏格，以名稱CryX 保藏，以反映如下事實：不存在關于它的清晰出處信息。
[0081] 首發論文和后續論文已經以更多細節表征了 Chry5菌株。這些研究的目的是標準 表征該菌株的分子生物學和遺傳學，以及其誘導腫瘤以造成不同植物物種遺傳轉化的對比 性能力，以及其在農桿菌處理的外植體中造成瞬時表達的能力。下文簡要總結這些研究的 結果。
[0082] 用來表征根癌農桿菌Chrv5的比較方法
[0083] 1 ?關于致瘤性的數據
[0084] 在Bush和Pu印ke (1991)的首發論文中，已經確立Chry5菌株能夠在代表7個植 物科的10個植物物種上造成腫瘤。試驗涉及相對于常見實驗室菌株B6,半定量評價具有 這個菌株引起的腫瘤的植物的數目。各菌株之間在9個物種中的6個物種（甜菜、伽藍菜 (kalanchoe)、金蓋花（marigold)、向日葵、煙草和番爺）中不存在致瘤性的顯著差異。與B6 相比，在羽衣甘藍上，Chry5大約兩倍更高效，并且在大豆上大約3倍更高效，而在豌豆上， 它或多或少地效率較低。Torisky等人（1997)提供關于腫瘤在煙草和番茄的莖上形成的額 外數據；在這項研究中，Chry5菌株和其部分卸甲的衍生物KYRTl已經與轉化研究中經常使 用的兩個其他農桿菌菌株比較，包括A281 (在C58染色體背景中含有B〇542Ti質粒的琥珀 堿型菌株）及其卸甲的衍生物EHA105菌株。已經在那項研究中顯示，所用的原始Chry5菌 株和另一個琥珀堿菌株A281均是高度致腫瘤的，但部分失能的衍生物KYRTl和EHA105無 活性。
[0085] 2.關于使用部分失能和完全失能的菌株時轉化效率的數據
[0086] Torisky等人（1997)展示了 KYRTl成功地轉移P -葡糖醛酸糖苷酶（⑶S)基因 至煙草葉外植體中，產生可以再生成有活力植物的表達GUS的愈傷組織。在這些實驗中， KYRTl菌株的轉化效率與對EHA105所顯示的轉化效率大致相同。Grant等人（2003)發現 用于評價具有三個不同植物基因型的子葉外植體，就產生豌豆轉基因植物而言，KYRT1菌株 平均三倍更有效于AGLl。
[0087] 在Palanichelvam等人（2000)的工作中，已經顯示KYRTl衍生物僅部分地卸甲并 且含有全部致瘤性T右區域和T左區域的片段。然而，就穩定轉化大豆而言，具有完全卸甲 的Ti質粒pKPSF2的Chry5衍生物（Palanichelvam等人，2000)較不高效，因為KYRTl菌株 保留了對植物外植體的某種激素效應，增強大豆中的體細胞胚發生（Ko等人，2004)。
[0088] 3.表征瞬時活性的數據
[0089] Torisky等人（1997)再次通過利用大豆子葉節外植體中⑶S表達的定量分析，首 次研究了 Chry5衍生物KYRTl引起的￠-葡糖醛酸糖苷酶轉基因的瞬時表達。這些數據表 明與EHA105或GV3850相比時，KYRTl衍生物在造成瞬時表達方面大約2. 5倍更高效。對 于在頑抗性豆科植物兵豆（Lens culinaris M.)的子葉柄上產生瞬時￠-葡糖醛酸糖苷 酶（⑶S)基因（gus)表達而言，KYRTl比EHA105和C58C1平均2. 8倍更高效（Akcay等人， 2009)。在用KYRTl和兩個其他常見的載體C58C1和EHA105處理后，Akbulut等人（2008) 已經測量源自受傷籽苗的外植體中的GUS活性。對GUS表達點的定量評價已經顯示在16 小時吸液后，KYRTl和C58C1之間不存在統計顯著差異，并且40小時后，KYRTl大約50%更 好，但是僅在兩個測量點之一中如此。
[0090] 完整解釋上文提及數據是困難的，因為不同作者使用不同的植物物種、不同的植 物外植體、不同的農桿菌菌株用于比較，并且基于三種不同的活性方法：致腫瘤性活性、遺 傳轉化效率和瞬時表達效率，得出他們的結論。植物細胞和農桿菌相互作用的過程非常復 雜，并且它涉及T-DNA-蛋白質復合物的轉移、蛋白質如VirE2(通過獨立分泌系統）的轉 移、在植物細胞中瞬時表達T-DNA基因、所表達基因的激素效應、一些T-DNA分子整合入植 物染色體DNA等。這些中間過程的任一個可能影響最終結果；因此，關于致瘤性和關于轉化 效率的數據未給出有關T-DNA轉移及瞬時表達效率的信息。在另一方面，展示的關于瞬時 活性的數據有限并且觀察到的輕微差異不是結論性的或實際上不相關。
[0091] 本文所述的方法及菌株和在上文描述的現有技術中使用的方法的主要差異是用 于瞬時表達研究的植物材料的不同生物學。盡管全部先前作者均使用體外培養或切下的富 含分生組織的植物外植體（最終目的是轉化植物細胞并從所述轉基因細胞再生出完整植 物的能力）如切下的胚、嫩籽苗的部分等，本發明涉及瞬時轉染與農桿菌差異性相互作用 的完整、發育的植物。在完整植物上，農桿菌通過氣孔（其在其他器官中和分生組織中不存 在）并且不通過植物外植體上的傷口進入葉。如之前提到，當處理植物外植體時，全部作者 無一例外地使用高細菌密度。
[0092] 本發明的菌株CryX含有至少部分卸甲的vir質粒。"卸甲的"意指vir質粒和其 宿主農桿菌不具有致瘤性，即，它不向植物細胞插入癌基因或用來生產冠癭堿類的基因，因 為它不含有這類基因或它不能轉移這類基因。vir質粒包含T-DNA轉移至植物細胞中所需 的vir基因（毒力基因）。Vir基因和它們在T-DNA轉移中的功能是本領域已知的并且例 如在 Slater 等人的書 Plant Biotechnology,第 2 版；Oxford University Press, 2008 中 總結；還見 Hellens 等人，Trends in Plant Science 5(2000)446-451。
[0093] 本發明的菌株CryX是雙元菌株，S卩，T-DNA轉移至植物細胞中所需的vir基因和 T-DNA位于分立的質粒上（參見例如關于雙元農桿菌菌株和載體系統的Slater等人書籍和 Hellens等人文章）。在雙元農桿菌菌株的情況下，含有vir基因的質粒在本文中稱作"vir 質粒"或"vir輔助質粒"。含有待轉染的T-DNA的質粒稱作"載體"或"雙元載體"。術語 "菌株"或"農桿菌菌株"涉及除雙元載體之外的農桿菌組分。因此，本文中，不含有雙元載 體并且在引入雙元載體后的雙元農桿菌菌株由相同的菌株名稱提及。保藏的菌株CryX含 有vir質粒，但是不含有雙元載體。
[0094] 本發明還涉及菌株CryX的衍生菌株。在一個實施方案（i)中，菌株CryX的衍生 菌株具有菌株CryX的染色體背景。它可以具有與CryX相同的染色體。在另一個實施方案 (ii)中，菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir質粒。在又一個實施方案（iii)中， 菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir質粒的衍生物，并且可以具有菌株CryX的染色 體。在實施方案（ii)中，菌株是雙元菌株并且在引入含有目的T-DNA的雙元載體后用于本 發明的方法中。在實施方案（i)和（iii)中，菌株可以是雙元菌株。如果它們是雙元菌株， 則這些雙元菌株在引入含有目的T-DNA的雙元載體后用于本發明的方法中。備選地，在實 施方案（i)和（iii)中，可以將在本發明的方法中待轉移至植物細胞的T-DNA插入vir質 粒中，從而vir基因和T-DNA存在于一個相同的質粒分子上。然而，通常更便利并且因此優 選使用雙元菌株。
[0095] 術語"染色體背景"是農桿菌轉化或轉染領域的標準術語（參見Hellens等人， Trends in Plant Science 5(2000)446-451)。它涉及所述農桿菌菌株除Ti質粒、vir輔 助質粒和雙元載體之外的遺傳物質。在一個實施方案中，菌株CryX的衍生菌株具有與菌株 CryX相同的染色體。與CryX的vir質粒相比，具有菌株CryX的染色體背景的衍生菌株可 以與CryX不同，例如，在vir質粒中不同。因此，菌株CryX的衍生菌株可以含有vir質粒， 所述vir質粒是菌株CryX的vir質粒的衍生物。
[0096] 可以通過比較來自菌株CryX的含有T-DNA的雙元載體的T-DNA轉移效率（或轉染 效率）與含有CryX的vir質粒和相同雙元載體的待測試菌株，實驗地測試具有與菌株CryX 不相同的染色體的給定農桿菌菌株是否具有菌株CryX的染色體背景。如果待測試菌株實 現菌株CryX的至少70 %、優選地至少80 %的T-DNA轉移效率，則認為它具有CryX的染色 體背景。轉染效率可以如實施例2中所述那樣確定。備選地，轉染效率可以如實施例2中 所述那樣，但使用編碼不能夠細胞至細胞移動的TMV-病毒復制子的雙元載體如pNMD570確 定。T-DNA轉移效率也可以通過如WO 2005049839中所述的原生質體計數法確定。在一個 實施方案中，具有菌株CryX的染色體背景的農桿菌菌株的染色體具有在堿基序列方面與 菌株CryX相同的染色體。
[0097] 當在具有與菌株CryX相同的染色體的農桿菌細胞中存在時，菌株CryX的vir質 粒的衍生物從這些細胞中存在的含有T-DNA的雙元載體實現相似的T-DNA向植物細胞轉中 的轉移效率。出于這個目的，衍生性vir質粒具有與菌株CryX的vir質粒充分相似的vir 區。衍生性vir質粒可以編碼菌株CryX的virG蛋白或密切相關的virG蛋白。優選地， 衍生性vir質粒含有菌株CryX的VirG基因。在一個實施方案中，衍生性vir質粒含有編 碼CryX的以下毒力蛋白中至少兩種毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirBl-BirBlU VirCU VirDl、VirD2、VirD4、VirEl、VirE2、VirF 和 VirJ。在又一個實施方案中，衍生性 vir 質粒 至少含有編碼CryX的以下毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirD2和VirE2。在又一個實施方 案中，衍生性vir質粒含有完整的vir區，即，菌株CryX的vir質粒的全部vir基因。衍生 性vir質粒可以在質粒骨架方面不同CryX的vir質粒。例如，衍生性vir質粒可以具有不 同或額外的選擇性標記基因或可以從vir區外部進一步缺失其他核酸部分。在一個實施方 案中，衍生性vir質粒是pKYRTl (US5, 929, 306)，尤其如果該衍生菌株具有與CryX相同的染 色體。
[0098] 可以通過以下方式實驗地測試給定的vir質粒是否為本發明意義下的衍生性vir 質粒：在其他方面相同的條件下比較農桿菌菌株CryX和除了待測試的vir質粒之外具有菌 株CryX的染色體的農桿菌之間來自含有T-DNA的雙元載體的T-DNA轉移效率。在一個實 施方案中，含有本發明衍生性質粒的農桿菌實現菌株CryX的至少70%、優選地至少80%、 更優選地至少90% T-DNA轉移效率。轉染效率可以如實施例2中所述和如上文提到那樣確 定。
[0099] 相對于CryX的virG蛋白而言"密切相關的virG蛋白"意指與CryX的virG蛋白 差異最多3個非保守性氨基酸置換或最多6個、優選地最多3個保守性氨基酸置換的virG 蛋白。非保守性氨基酸置換可以在與SEQ ID NO: 1的第6、7或106位置相對應的位置處， 所述SEQ ID NO: 1是來自農桿菌菌株LBA4404的VirG蛋白，全部其他氨基酸殘基如SEQ ID NO: 1那樣。此外，密切相關的virG蛋白可以在與SEQ ID NO: 1的第54位置相對應的位置 處具有天冬酰胺至天冬氨酸置換。保守性氨基酸置換可以在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的 第6、7和/或106位置處。
[0100] 本文中，保守性置換是置換以下四組中每個組內部的氨基酸殘基：
[0101] -Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr
[0102] -Val、lie ;Leu、Met
[0103] -Lys Arg、His
[0104] -Phe、Tyr、Trp
[0105] 將全部其他氨基酸殘基置換視為非保守的。
[0106] 本文中，"目的T-DNA"是在T-DNA左邊界序列和右邊界序列之間含有目的DNA序 列的DNA。目的T-DNA可以存在或可以已經通過亞克隆并入vir質粒如菌株CryX的vir質 粒中。在本發明的方法中，優選使用雙元載體系統。因此，目的T-DNA優選地存在或將被并 入雙元載體中。
[0107] 待用于本發明中的雙元載體是包含待轉染至植物細胞中的目的DNA序列的DNA分 子。目的DNA序列一般編碼在轉染植物的細胞中待表達的蛋白質或RNA。一般通過將含有 目的DNA序列的核酸構建體插入或克隆至前體雙元載體的T-DNA內部的克隆位點中產生雙 元載體，如農桿菌介導的植物轉染中通常所做那樣。在所述插入后，使核酸構建體旁側分布 有T-DNA左邊界序列和右邊界序列以允許用所述T-DNA轉染所述植物。在雙元載體的T-DNA 中，目的DNA序列如此存在，從而在植物細胞中可表達。為此目的，目的DNA序列例如在所 述核酸構建體中一般處于植物細胞中有活性的啟動子控制下。目的DNA序列的例子是編碼 DNA病毒復制子或RNA病毒復制子或待表達基因的DNA序列。該基因可以編碼在植物細胞中 待表達的目的RNA或目的蛋白質。病毒復制子一般也編碼在植物中待表達的目的RNA或蛋 白質。除了目的DNA序列外，DNA構建體還可以包含其他序列，例如用于表達目的DNA序列 的調節序列。在本發明中可用的雙元載體是技術人員已知的，例如從引言中引用的參考文 獻、或從植物生物技術方面的教科書例如Slater, Scott和Fowler, Plant Biotechnology, 第2版，Oxford University Press, 2008中獲知。雙元載體一般具有允許在細菌如大腸桿 菌中選擇的抗生素抗性基因。
[0108] 為了增加轉染效率，雙元載體可以在T-DNA外部包含在所述農桿菌菌株中可表 達的VirG基因。備選地，可以將額外質粒插入所述農桿菌菌株中，因而所述額外的質粒 含有在所述農桿菌菌株中可表達的virG基因（Pazour等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 6941-6945)。VirG基因優選地編碼來自根癌農桿菌菌株LBA4404的VirG蛋白或 密切相關的VirG蛋白。另外，VirG蛋白可以在與SEQ ID NO: 1(即，來自根癌農桿菌菌株 LBA4404的VirG蛋白）的第54相對應的位置處具有N54D突變。來自另一個農桿菌菌株的 VirG 蛋白中的 N54D 突變由 Jung 等人，Current Microbiology 49(2004)334-340 描述。
[0109] 密切相關的VirG蛋白可以是
[0110] (i)包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列或SEQ ID NO: 1氨基酸序列的N54D突變體的氨 基酸序列的至少235個、優選地至少239個連續氨基酸的蛋白質；或
[0111] (ii)包含下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1或其N54D 突變體的氨基酸序列的不多于3個非保守性氨基酸置換和不多于10個保守性氨基酸置換； 或
[0112] (iii)包含下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列具有SEQ ID N0:1或其 N54D突變體的氨基酸序列的不多于20個、優選地不多于10個保守性氨基酸置換。
[0113] 在項（ii)和（iii)中，所述蛋白質優選地在與SEQ ID NO: 1的第54位置相對應 的位置處具有天冬酰胺或天冬氨酸殘基。
[0114] 在上文提到的實施方案中保守性氨基酸置換的可能位置是SEQ ID NO: 1的第6、7、 18、35、38、42、44、66、69、73、81、86、89、97、106、107、122、124、133、135、143、147、150、165、 188、208、212、213、232、235和238位置，而在其他位置的氨基酸殘基是如5￡0 1〇勵：1中的 那些殘基。非保守性置換的可能位置是SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第6、7和106位置。
[0115] 在需要蛋白質或RNA強烈表達或其中不關注病毒核酸在所述植物的細胞中高量 累積和可能不利影響植物健康的實施方案中，核酸構建體或目的DNA序列可以編碼能在植 物細胞中復制的復制型病毒載體。為了復制，病毒載體含有可以由植物細胞中存在的核酸 聚合酶（例如從復制子表達的病毒聚合酶）識別的復制起點。在RNA病毒載體的情況下， 病毒復制子可以在DNA構建體已經引入植物細胞核后，在植物啟動子的控制下通過轉錄從 該DNA構建體形成。在DNA病毒復制子的情況下，病毒復制子可以通過DNA構建體分布于 編碼病毒復制子的序列側翼的兩個重組位點之間的重組而形成，例如，如W000/17365和WO 99/22003中所述。如果病毒復制子由DNA構建體編碼，則優選RNA病毒復制子。在過去至少 15年已經在文獻中廣泛地描述DNA和RNA病毒復制子的用途。一些例子是Icon Genetics 的以下專利公開：WO 2008028661、TO 2007137788、TO 2006003018、TO 2005071090、TO 2005049839、W0 02097080、W0 02088369 和 WO 02068664。DNA 病毒載體的例子是基于雙生 病毒的那些。對于本發明，優選基于植物RNA病毒、尤其基于正義單鏈RNA病毒的病毒載體 或復制子。這類病毒載體的例子是在實施例中使用的煙草花葉病毒（TMV)和馬鈴薯X病毒 (PVX)。基于馬鈴薯X病毒的病毒載體和表達系統在EP2061890中描述。許多其他植物病 毒復制子在上文提及的專利公開中描述。
[0116] 當實施本發明的方法時,可以通過常規方法如電穿孔,將在T-DNA中含有目的DNA 序列的雙元載體引入含有vir質粒或其衍生物的農桿菌菌株中。將含有雙元載體的菌株的 培養物隨后在合適的培養基中培育，一般在用于選擇含有雙元載體的農桿菌細胞的選擇劑 存在下培育，并且，任選地，傳代培養以產生所需量的包含農桿菌細胞的水懸液。獲得的懸 液可以用水、合適的緩沖液或培養基稀釋至所需的濃度并且用于轉染植物或植物上的葉。 備選地,如果T-DNA是vir質粒的部分，則將含有T-DNA的vir質粒通過常規方法如電穿孔 法引入農桿菌中并如對雙元系統所述那樣進一步處理。
[0117] 在本發明的方法中，使用在植物中轉染。在植物中（in planta)意指對苗期后的 整株活植株、優選地對充分發育的植株實施所述方法，而非切下或體外培養的植物組織或 器官。優選地，所述方法平行適用于許多植株，如生長在田間的植株。
[0118] 所述植株可以在施加或不施加真空的情況下通過滲入與農桿菌細胞懸液接觸。 在一個實施方案中，尤其當平行應用于多個植株時，植株可以通過噴灑與懸液接觸。在本 發明方法中使用的含水懸液可以具有至多I. lxl09cfu/ml農桿菌細胞的濃度，其大致對應 于LB培養基中600nm處光密度1的農桿菌培養物。然而，由于本發明中實現的高轉染效 率，可以使用低得多的濃度，這允許處理許多植物例如整幅農田，且無需巨大的發酵罐用于 農桿菌生產。因此，濃度優選地是至多2. 2xl07cfu/ml、更優選地至多I. lxl07cfu/ml、更優 選地至多4. 4xl06cfu/ml。在一個實施方案中，濃度是每毫升懸液至多I. Ixl06cfu。在又 一個實施方案中，濃度是至多4. 4xl05cfu/ml懸液，并且在又一個實施方案中，濃度是至多 I. lxl05cfu/ml 懸液
[0119] 為了避免根據cfu/ml確定細胞濃度，經常通過使用分光光度計測量600nm處的表 觀光密度評估農桿菌懸液的濃度。此處，I. lxl07cfu/ml的濃度對應于600nm處0. 01的計 算光密度，其中計算的光密度定義為：用水或緩沖液稀釋600nm處具有光密度I. 0的懸液 100倍。類似地，4.4叉106。;1!\1/1111、1.1叉106。;1!\1/1111、4.4叉10 5。;1!\1/1111和1.1叉105。;1!\1/1111懸液的濃 度分別對應于600nm處0. 004、0. 001、0. 0004和0. 0001的計算光密度，其中計算的光密度 定義為：用水或緩沖液分別稀釋600nm處具有光密度I. 0的懸液250倍、1000倍、2500倍或 10000 倍。
[0120] 因此，在一個特別優選的實施方案中，本發明提供一種在植物中瞬時表達目的DNA 序列的方法和用于此方法的農桿菌細胞懸液，所述方法包括使所述植物或所述植物上的所 述葉與包含農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的細胞的懸液接觸，其中所述衍生菌 株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir質粒或所述vir質 粒的衍生物，其中所述懸液具有在前述兩個段落的任一段落中提到的任一個最大農桿菌細 胞濃度。在這個實施方案中，農桿菌菌株優選地是含有雙元載體的雙元菌株，所述雙元載體 包含在所述菌株CryX或所述衍生菌株中可表達的VirG基因。所述VirG基因可以編碼來 自根癌農桿菌菌株LBA4404的具有SEQ ID NO: 1的VirG蛋白，或是來自根癌農桿菌菌株 LBA4404的virG基因編碼的VirG蛋白的N54D突變體。
[0121] 可以將磨料納入懸液中以增加轉染效率。磨料是在農桿菌細胞的水懸液中基本上 不可溶的顆粒狀材料。認為磨料，尤其如果與濕潤劑一起使用時，可以削弱植物組織（例如 葉）的表面，從而促進農桿菌細胞滲入植物組織的細胞間隙中。關于可用于本發明中的可 能磨料、其粒度、濃度和可能的商業產品，參考以WO 2012/019669公開的國際專利申請并 且在此引用此公開關于磨料的公開內容。
[0122] 本發明的水懸液以含有農用噴霧輔助劑。噴霧輔助劑可以是表面活性劑或潤濕 齊u。表面活性劑和潤濕劑在本發明中具有多重優點。它減少水懸液中水的表面張力且致使 植物葉的蠟質表面對于農桿菌更具可透性。它還可以改善懸液的穩定性和減少懸液中磨料 的沉降。不具體地限制可用于本發明方法中的表面活性劑，并且它們在WO 2012/019669的 國際專利申請中公開。優選的表面活性劑是HLB值為12或更大、優選地至少13的非離子型 表面活性劑。作為非離子型表面活性劑，在本發明中最優選有機硅氧烷表面活性劑，例如聚 環氧燒改性的七甲基三娃氧燒。商業產品是來自GE Advanced Materials的Silwet L77? 噴霧輔助劑。
[0123] 表面活性劑如在WO 2012/019669中公開的那些可以單獨或與兩種或更多種表面 活性劑組合使用。尤其，優選的有機硅氧烷表面活性劑可以與其他表面活性劑組合。表面 活性劑在本發明水懸液中的總濃度可以通過實施比較性噴霧實驗容易地測試，類似于如實 施例中所做那樣。然而，通常，表面活性劑的總濃度可以是所述懸液的〇. 005-2體積％、優 選地0. 01-0. 5體積％、更優選地0. 025-0. 2體積％。因為表面活性劑的密度一般接近于 I. Og/ml，所以表面活性劑的總濃度可以定義為0. 05-20g/升所述懸液，優選地0. 1-5. 0g、 更優選地0. 25-2. Og/升所述懸液（包含磨料）。如果使用上文的有機硅氧烷表面活性劑例 如聚環氧烷改性的七甲基三硅氧烷，則用于噴霧的農桿菌懸液中的有機硅氧烷表面活性劑 的濃度可以是〇. 01-0. 5體積％、優選地0. 05-0. 2體積％。備選地，用于噴霧的農桿菌懸液 中的有機硅氧烷表面活性劑的濃度可以定義為0. 1-5. 0g、優選地0. 5-2. Og/升所述懸液。
[0124] 為了改善水懸液的物理特性，可以添加高度分散的亞微米規格的硅酸（二氧 化硅）或多孔聚合物例如脲/甲醛縮合物（Pergopak?)。尤其，在磨料的中位值粒度 為0. 1-30 之間或處于上文給出的那個范圍的優選子范圍之一內的情況下，可以將 高度分散的亞微米規格的二氧化硅添加至懸液。此處，亞微米規格的二氧化硅是具有 0. 01-0. 5 ii m、優選地0. 02-0. 5 ii m、更優選地0. 02-0. I ii m的中位值粒度的二氧化硅。高度 分散的硅酸例如Hi-Sil?233 (PPG Industries)可以有助于水懸液的摩擦特性（見Jensen 等人，Bull. Org.mond. Sante, Bull. Wld Hlth 0rg.41(1969)937_940)。這些試劑可以按 1 - l〇g/升本發明懸液的量摻入。
[0125] 農桿菌懸液的其它可能添加劑是維持用于噴霧的懸液的pH處在所需pH( -般在 4. 5和6. 5之間、優選地在5. 0和5. 5之間）的緩沖物質。另外，可以添加無機可溶性鹽，例 如氯化鈉，以調節懸液的離子強度。營養肉湯例如LB培養基也可以包含于懸液中。
[0126] 可以如下產生用于與植物接觸的水懸液。在一種方法中，將含有在本發明的方法 中待使用的目的雙元載體的農桿菌菌株或細胞接種到培養基中并生長至高細胞濃度。更大 的培養物可以用小體積的高濃度培養物接種以獲得大量培養物。一般將農桿菌培育到與 600nm處至少1、一般約I. 5的OD值對應的細胞濃度。隨后將這種高度濃縮的農桿菌懸液 稀釋以實現所需的細胞濃度。為了稀釋高度濃縮的農桿菌懸液，使用水。水可以含有緩沖 齊IJ。水還可以含有本發明的表面活性劑。備選地，可以用水稀釋這種濃縮的農桿菌懸液，并 且在稀釋步驟之后或期間添加任何添加劑例如表面活性劑和任選的緩沖物質。可以在稀釋 之前、期間或之后添加磨料。然而，優選在添加磨料期間攪拌懸液以在農桿菌懸液中均勻地 分散磨料。稀釋濃縮的農桿菌懸液的步驟可以在用于噴灑稀釋懸液的噴霧器的噴霧罐中實 施。
[0127] 所述植物、尤其所述植物上的葉隨后與農桿菌細胞懸液接觸以實現植物細胞的瞬 時轉染。如上解釋，可以通過噴灑實施接觸。在本發明方法中待使用的噴霧器主要取決于 待噴灑的植物的數量或面積。對于待噴霧一個或少數植物，可以使用如家居和園藝中廣泛 使用的泵式噴霧器。這些噴霧器可以具有0.5-2升的噴霧罐體積。對于中等規模的施加， 可以使用手動操作的液壓噴霧器，例如手柄操作的背負式噴霧器或手動操做的壓力噴霧 器。然而，在本發明中實現的高轉染效率使本發明完全可能轉染許多植物，例如在農田上或 在溫室中生長的植物。為此目的，可以使用動力操作的液壓噴霧器，例如配備噴桿的拖拉機 載式液壓噴霧器。使用直升飛機或飛機的空中施加技術也可能用于大的田塊。全部這些類 型的噴霧器是本領域已知的，并且例如在G. A. Matthews的書籍"Pesticide Application Methods",第3版，Blackwell Science, 2000中描述。為了確保噴霧器的噴霧罐中的均質 懸液，可以在噴霧期間以規律間隔或連續振搖小尺寸或中等尺寸的噴霧器。大噴霧器例如 拖拉機載式噴霧器應在噴霧箱中配備攪拌器。
[0128] 考慮待噴灑的懸液中存在農桿菌細胞和磨料，在本發明中使用的噴霧器應當產 生至少具有細霧滴液滴大小的噴霧。另外，可以使用處在G.A.Matthews的"Pesticide Application Methods"，第 3 版，Blackwell Science，2000,第 74 頁中所用的噴霧分類內的 中等霧滴或粗霧滴。本發明中噴霧的主要目的是用懸液潤濕植物組織。因此，確切的液滴 大小并非關鍵。然而，轉染效率可以通過以增加的壓力向植物表面提供噴霧而進一步改善。
[0129] 在本發明的方法中，噴灑植物的至少部分。在一個重要的實施方案中，噴灑在田間 土壤中生長的植物，即不在可移動盆或容器中生長的植物。不能將此類植物顛倒并浸入用 于真空滲入的農桿菌懸液。噴灑植物的至少部分，例如葉。優選地，噴灑大多數的葉或整個 植物。
[0130] 本發明用于瞬時轉染植物或用于以目的DNA序列瞬時轉染，所述目的DNA序列隨 后可以瞬時表達。術語"瞬時"意指不使用選擇方法，所述選擇方法使用例如選擇劑和能夠 脫毒所述選擇劑的選擇標記基因，在未轉染的細胞或植物的背景下選擇出用目的DNA序列 轉染的細胞或植物。由此，一般不將轉染的目的DNA序列穩定引入植物染色體DNA內。取 而代之的是，瞬時方法在恰好轉染的植物中利用轉染效應。
[0131] 本發明一般用于轉染多細胞植物，尤其高等植物。單子葉植物和雙子葉植物均可 以被轉染，其中優選雙子葉植物。用于本發明中的植物包括任何植物物種，優選農業和園 藝上重要的作物物種。用于本發明中的常見作物植物包括苜蓿、大麥、豆、卡諾拉油菜、豇 豆、棉、谷物、三葉草、蓮、小扁豆、羽扇豆、粟、燕麥、豌豆、花生、稻、黑麥、草木樨、向日葵、 香碗豆、大豆、高粱、黑小麥、豆薯、藜豆、野豌豆（vetch)、小麥、紫藤和堅果植物。優選用 于實施本發明的植物物種包括但不限于禾本科（Gramineae)、菊科（Compositeae)、爺科 (Solanaceae)和舊薇科（Rosaceae)的代表。
[0132] 在本發明中使用的其它優選物種是來自下述屬的植物：擬南芥屬（Arabidopsis)、 剪股穎屬（Agrostis)、蔥屬（Allium)、金魚草屬（Antirrhinum)、序屬（Apium)、落花生屬 (Arachis)、天門冬屬（Asparagus)、顛煎屬（Atropa)、燕麥屬（Avena)、簕竹屬（Bambusa)、 蕓苔屬（Brassica)、雀麥屬（Bromus)、Browaalia、山荼屬（Camellia)、大麻屬（Cannabis)、 辣椒屬（Capsicum)、鷹嘴豆屬（Cicer)、藜屬（Chenopodium)、菊苣屬（Chichorium)、柑橘 屬（Citrus)、咖啡屬（Coffea)、薏該屬（Coix)、黃瓜屬（Cucumis)、南瓜屬（Curcubita)、狗 牙根屬（Cynodon)、鴨茅屬（Dactylis)、曼陀羅屬（Datura)、胡蘿卜屬（Daucus)、毛地黃屬 (Digitalis)、薯截屬（Dioscorea)、油掠屬（Elaeis)、穆屬（Eleusine)、羊茅屬（Festuca)、 草莓屬（Fragaria)、老鸛草屬（Geranium)、大豆屬（Glycine)、向日葵屬（Helianthus)、萱 草屬（Heterocallis)、橡膠樹屬（Hevea)、大麥屬（Hordeum)、天仙子屬（Hyoscyamus)、番 薯屬（Ipomoea)、萵苣屬（Lactuca)、兵豆屬（Lens)、百合屬（Lilium)、亞麻屬（Linum)、黑 麥草屬（Lolium)、百脈根屬（Lotus)、番煎屬（Lycopersicon)、Majorana、蘋果屬（Malus)、 芒果屬（Mangifera)、木薯屬（Manihot)、苜猜屬（Medicago)、龍面花屬（Nemesia)、煙 草屬（Nicotiana)、驢食草屬（Onobrychis)、稻屬（Oryza)、黍屬（Panicum)、天竺葵屬 (Pelargonium)、狼尾草屬（Pennisetum)、碧冬煎屬（Petunia)、豌豆屬（Pisum)、菜豆屬 (Phaseolus)、梯牧草屬（Phleum)、早熟禾屬（Poa)、李屬（Primus)、毛茛屬（Ranunculus)、 蘿卜屬（Raphanus)、荼薦子屬（Ribes)、蓖麻屬（Ricinus)、懸鉤子屬（Rubus)、甘鹿屬 (Saccharum)、Salpiglossis、黑麥屬（Secale)、千里光屬（Senecio)、狗尾草屬（Setaria)、 白芥屬（Sinapis)、煎屬（Solanum)、高粱屬（Sorghum)、鈍葉草屬（Stenotaphrum)、可可屬 (Theobroma)、車軸草屬（Trifolium)、胡盧巴屬（Trigonella)、小麥屬（Triticum)JH^S 屬（Vicia)、紅豆屬（Vigna)、葡萄屬（Vitis)、玉蜀黍屬（Zea)和莪利竹族（Olyreae)、早熟 禾亞科（Pharoideae)及其他。
[0133] 優選地，本發明的方法適用于雙子葉植物如本塞姆氏煙草、煙草、棉、大豆、油籽油 菜、椒、馬鈴薯或番茄。
[0134] 在一個實施方案中，本發明的方法可以用于在一株植物中或在田間生長的許多植 物中產生目的蛋白。為此目的，可以在植物的所需生長狀態，用包含農桿菌細胞的懸液噴灑 植物，所述農桿菌細胞含有所需的雙元載體。如果主要目的是實現最高的可能表達水平并 隨后收獲植物用于獲得含有高量蛋白質的植物材料，則可以使用病毒載體，因為它們通常 廣生最尚的表達水平。
[0135] 在另一個實施方案中，本發明的方法用于在植物中產生或改變性狀例如輸入性 狀。在這個實施方案中，可能不希望目的蛋白質或RNA的過量表達以避免對植物健康的 有害影響。對于此類實施方案，優選非復制型載體（在本文中也稱為"轉錄載體"），即缺 乏被植物細胞中存在的核酸聚合酶識別的功能性復制起點的載體。本發明的另一個應用 是RNA表達，例如用于RNA干擾，其中干擾信號可以在植物中從已表達信號的細胞傳播到 其他細胞。一個例子是，如Pooggin在Nat. Biotech. 21 (2003) 131中所描述，在植物中對 不想要的病毒DNA打靶。可以適應于瞬時系統的癌基因沉默的一個例子由Escobar等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442 描述。又一個例子是通過類似于 Baum 等 人，Nat. Biotech. 25 (2007) 1322-1326所描述的RNA干擾來控制鞘翅類病害昆蟲，這可以 通過以下方式適用于本發明的瞬時方法：用編碼dsRNA從而可以表達該dsRNA的目的DNA 序列瞬時轉染害蟲侵染的植物。適用于本發明瞬時方法的其它方法是Huang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306 ;Chuang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990 描述的那些。
[0136] 另外，本發明的方法允許在目的時間點及時改變性狀，所述性狀涉及調節開花時 間或果實形成，例如馬鈴薯中的塊莖形成（tuborisation) (Martinez-Garcia等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002) 15211-15216)或利用轉錄因子調節類黃酮途徑（Deluc 等人，Plant Physiol. 147(2008)2041-2053)。可以通過瞬時表達可移動性成花素蛋 白 FT 來誘導開花（Zeevaart，Current Opinion in Plant Biology 11(2008)541-547; Corbesier 等人，Science 316(2007) 1030-1033)。可以使用本發明和 Pandolfini 等人，BMC Biotechnology 2(2002)描述的方法在番爺中大規模產生單性果實。本發明還應用于通過 MYB轉錄因子改變棉纖維發育（如Lee等人，Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401描述 的）或活化植物防御基因 （Bergey 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058) 的情況。
[0137] 本發明還提供保護田間作物植物免遭害蟲影響的方法。在這種方法中，可以從一 塊田地或農田上生長的多株植物確定對至少一種植物的侵染。鑒于本發明方法的快速性， 只有確定害蟲侵染時，才需要引起對害蟲有害的蛋白質或RNA的表達。因此，在不存在侵染 風險的情況下，無需強烈和組成型表達害蟲毒素或用于RNAi的dsRNA。在用攜帶相應的基 于PVX的表達載體的稀釋農桿菌培養物噴霧后蘇云金芽孢桿菌內毒素的瞬時表達保護了 本塞姆氏煙草植物不受煙草天蛾幼蟲的采食損害（參見W02012/019660的圖30)。 實施例
[0138] 參考實施例1 :根據菌落形成單位（Cfu)確定液體培養物中的農桿菌細胞濃度
[0139] 可以使用下述方案，根據菌落形成單位/ml液體懸液（cfu/ml)確定液體懸液中 農桿菌細胞的濃度。在含有25mg/L卡那霉素（AppliChem，A1493)和50mg/L利福平（Carl Roth，4163. 2)的7. 5ml液體LBS培養基中生長用構建體pNMD620轉化的根癌農桿菌菌株 ICF 320的細胞。細菌培養物在28°C培育，伴隨連續振搖。在600nm波長處使用分光光度 計，監測Iml培養物等分試樣中以吸光度單位（AU)表示的細菌培養物的吸光度或光密度 (〇D_)。可以在OD6tltl值1 ;1. 3 ;1. 5 ; 1.7和1.8時，分析被估計為菌落形成單位數/毫升液 體培養物（cfu/ml)的細胞濃度。為此目的，將250 ill液體培養物等分試樣用LBS培養基 稀釋，以實現25ml最終體積（稀釋度1:100)。將2. 5ml這種1:100稀釋物與22. 5ml LBS 混合，以實現稀釋度1:1〇〇〇。類似地制備液體培養物稀釋物1:100 ;1:1，〇〇〇 ;1:1〇,〇〇〇 ; 1:100, 000 ;1: 1，000, 000 ;1:10, 000, 000 和 1:100, 000, 000。最后三個稀釋物的等分試樣涂 布在補充有25mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的瓊脂固化LBS培養基上（250 ill細菌培養 物/90mm直徑平板）。對于每個稀釋度，一式三份進行等分試樣的鋪板。在28°C溫育2日 后，對于每塊平板計數細菌菌落。1: 1，〇〇〇, 〇〇〇和1:10, 〇〇〇, 〇〇〇稀釋物的鋪板分別產生每 平板數百個菌落和數打個菌落。由于稀釋度1:100, 〇〇〇, 〇〇〇僅提供數個菌落/平板，所以 該稀釋度不用于計算細胞濃度。根據下式估計細胞濃度：cfu/ml = 4x每平板菌落數X稀 釋倍數。
[0140] 為了換算由600nm處吸光度量值（LB培養基中）所度量的細胞濃度和根據細胞形 成單位所度量的細胞濃度，本文中使用以下關系：1. 〇的OD6tltl對應于I. lxl09cfu/ml。
[0141] LBS培養某（液體）
[0142] 1%大豆蛋白胨（大豆柏的木瓜蛋白酶水解物；Duchefa，S1330)
[0143] 0.5%酵母提取物（〇11(：1^^3，￥1333)
[0144] 1 %氯化鈉 （Carl Roth，9265. 2)
[0145] 溶解于水中，并且用 IM NaOH(Carl Roth，6771. 2)調節至 pH 7. 5
[0146] 為制備固體LBS培養基，向液體LBS培養基補充I. 5%瓊脂（Carl Roth，2266. 2)。 將培養基在121°C高壓滅菌20分鐘。
[0147] 實施例1 :在下述實施例中使用的載體
[0148] 在這項研究中，我們使用基于TMV的和基于PVX的病毒載體以及基于35S CaMV啟 動子的標準轉錄載體。
[0149] 基于Marillonnet等人（2006)中描述的載體產生了具有細胞至細胞移動能力的 基于TMV的載體pNMD560、pNMD062、pNMD063和pNMD064(圖1A)。全部這些載體均設計 用于表達作為報道基因的GFP ;它們含有sGFP的編碼序列的插入物，所述sGFP是來自維 多利亞多管發光水母（Aequorea victoria)的修飾綠色突光蛋白（GFP) (GeneBank登錄 號EF030489)。pNMD560構建體按順序含有來自擬南芥肌動蛋白2(ACT2)啟動子的片段 (GenBank 登記號 AB026654) ;TVCV 的 5' 末端（GenBank 登記號 BRU03387,堿基對 1 - 5455) 和cr-TMV的片段[GenBank登記號Z29370,堿基對5457 - 5677,兩者一起含有16個內含子 插入物];sGFP編碼序列；cr-TMV 3'非翻譯區（3' NTR;GenBank登記號Z29370)和胭脂 堿合酶（Nos)終止子。將整個片段克隆在雙元載體的T-DNA左邊界和右邊界之間。
[0150] 基于pNMD560構建體產生pNMD062質粒。為此目的，通過PCR擴增以下DNA片 段并利用AfeI限制性位點插入質粒骨架中，所述DNA片段包含從5'末端側翼存在序列 ctgtcgatc并且從3'末端側翼存在序列aagatcgacag(SEQ ID N0:8)的來自根癌農桿菌 LBA4404菌株章魚堿型Ti-質粒的VirG基因的編碼序列和5'上游基因組區（GenBank登錄 號 AF242881. 1，堿基對 160603 - 161600)。
[0151] pNMD063構建體與pNMD062除了 N54D突變不同外，其它均是相同的。
[0152] 為了產生PNMD064構建體，通過PCR擴增以下DNA片段并利用AfeI限制性位點插 入PNMD560構建體的質粒骨架中，所述DNA片段包含來自根癌農桿菌GV3101菌株胭脂堿 型Ti-質粒的VirG基因的含有N54D突變的編碼序列和5'上游基因組區（GenBank登錄號 AE007871. 2,堿基對 194307 - 193333)。
[0153] PNMD570構建體（缺乏細胞至細胞運動能力的基于TMV的載體）與pNMD560除了 MP-編碼序列中導致MP翻譯失真的可讀框移碼的點突變不同之外，其它均是相同的（圖 1A)。
[0154] PNMD620構建體（用于GFP表達的無細胞至細胞和全身性移動能力的基于PVX的 載體）按順序含有35S CaMV啟動子、RNA依賴性RNA聚合酶的編碼序列、包含25kDa、12kDa 和SkDa蛋白質的三重基因區段模塊、sGFP編碼序列和3'非翻譯區。將整個片段克隆到雙 元載體的T-DNA左邊界和右邊界之間（圖1B)。
[0155] 全部轉錄載體均基于pICBV10(pBIN19衍生的雙元載體）（Marillonnet等人， 2004,2006)產生。它們含有在相同T-DNA區的右邊界和左邊界內部插入的兩個表達盒 (圖1B)。在pNMD1971構建體的情況下，與右邊界毗鄰的表達盒按順序包含花椰菜花葉病 毒（CaMV) 35S啟動子、來自煙草花葉病毒的《翻譯增強子、來自大腸桿菌的￠-葡糖醛酸 糖苷酶的編碼序列（GenBank登錄號S69414)，其含有來自矮牽牛（Petunia hybrids) PSK7 基因的內含子（GenBank登錄號AJ224165. I，堿基對4411-4484)，和來自根癌農桿菌胭脂堿 合酶基因的終止子。第二表達盒在第一表達盒和T-DNA左邊界之間插入。它按順序含有花 椰菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動子，來自煙草花葉病毒的《翻譯增強子、來自番茄叢矮病毒 (TBSV)的P19沉默阻抑蛋白的編碼序列（GenBank登錄號CAB56483.1)和來自根癌農桿菌 章魚堿合酶基因的終止子。
[0156] 基于pNMD1971載體產生pNMD2180構建體。為此目的，將pNMD1971構建體的NotI/ NdeI片段替換為pNMD064構建體的相同片段，所述相同片段含有旁側分布有5'上游基因組 區域的來自根癌農桿菌GV3101菌株的胭脂堿型Ti-質粒的virGN54D基因。
[0157] 以相似的方式產生pNMD2190。將pNMD1971構建體的Notl/Ndel片段替換為 PNMD063載體的相同片段，所述相同片段含有旁側分布有5'上游基因組區域的來自根癌農 桿菌LBA4404菌株的章魚堿型Ti-質粒的virGN54D基因。
[0158] 實施例2 :如果與常規使用的根癌農桿菌菌株相比，菌株CryX顯示更強的本塞姆 氏煙草瞬時轉染
[0159] 我們測試用于瞬時轉染本塞姆氏煙草植物的根癌農桿菌菌株的數目，所述根癌農 桿菌菌株包括 AGL1、EHA105、GV3101、ICF320、CryX、LBA4404 和 LBA9402。為此目的，使用 無針頭注射器，將植物葉用上述7個菌株的KT3和KT4稀釋度的0D_ = 1. 3農桿菌培養物 滲入，所述菌株攜帶如圖2A中所示的表達GFP的能夠進行細胞至細胞運動的基于TMV的載 體（TMV-GFP，pNMD560構建體）。平行地，將葉用相同菌株的10_2和10_3稀釋度的過夜農桿 菌培養物滲入，所述菌株攜帶如圖2B中所示的缺乏細胞至細胞運動能力的基于TMV的載體 (TMV (f sMP) -GFP，pNMD570 構建體）。
[0160] 基于熒光點的密度和GFP熒光的強度，我們證明幾個菌株（例如，AGLUEHA105和 LBA9402)的高效瞬時轉染，然而如果與任何其他測試的菌株相比，對于兩種構建體的全部 所測試稀釋度的農桿菌培養物而言，CryX菌株的瞬時轉染效率顯著地更高。
[0161] 為了定量評價CryX菌株的瞬時轉染效率，我們估計細菌懸液中在葉中滲入的細 胞數目和被視為單個轉染事件的、產生的GFP熒光點數目之間的比例。為此目的,使用無針 頭的注射器以200 ill 0D_ = 1. 3的農桿菌培養物滲入6周齡本塞姆氏煙草植物的葉，其 中所述農桿菌培養物用5mM MES、pH 5. 3和IOmM MgCl2組成的緩沖液按稀釋倍數10_5、10_6和KT7稀釋。CryX、EHA105、GV3101和ICF320農桿菌細胞攜帶構建體pNMD560 (TMV-GFP載 體）。為評價細菌細胞，將用于葉滲入的細菌懸液的100 等分試樣一式三份涂布在含有 50iU/l利福平和50iU/l卡那霉素的LB瓊脂平板上。將平板在28°C溫育2日并且此后 計數cfu (菌落形成單位）數。根據我們的估計，100 ill CryX、EHA105、GV3101和ICF320 細菌培養物含有 7. 38+/-L 72、5. 00+/-L 50、2. 53+/-0. 87 和 6. 17+/-1. 37cfu (表 1)。平 行地在感染后4日，對本塞姆氏煙草葉評定GFP熒光點。平均而言，對于CryX，EHA105， GV3101和ICF320菌株，每100 ill KT7稀釋度的滲入農桿菌培養物分別產生7. 38+/-1. 72、 5. 00+/-1. 50、2. 53+/-0. 87和6. 17+/-1. 37個熒光點。對于CryX菌株，每個農桿菌細胞產 生0. 46個轉染位點，并且對于全部其他測試的菌株，產生0. Ol個轉染位點，CryX菌株比 EHA105、GV3101 和 ICF320 菌株效率高 46 倍。
[0162] 表1在濃縮倍數10_7的農桿菌培養物時與其他菌株相比CryX的轉染效率 (PNMD560構建體，感染后4日）。
[0163]
【權利要求】
1. 瞬時轉染植物或植物上的葉的方法，包括使所述植物或所述葉與包含農桿菌菌株 CryX或菌株CryX的衍生菌株的細胞的懸液接觸， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 質粒或所述vir質粒的衍生物。
2. 在植物中瞬時表達目的DNA序列的方法，包括使所述植物或所述植物上的所述葉與 包含農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的細胞的懸液接觸， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 質粒或所述vir質粒的衍生物。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有雙元載 體，所述雙元載體具有包含待轉染入所述植物或葉的細胞中的目的DNA序列的T-DNA。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有 卸甲vir質粒或卸甲Ti-質粒。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中菌株CryX的所述衍生菌株含有vir 質粒，所述vir質粒是菌株CryX的vir質粒的衍生物，并且所述衍生菌株實現T-DNA從含 有T-DNA的雙元載體至植物細胞的轉移效率是采用菌株CryX時的T-DNA轉移效率的至少 70%。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中菌株CryX的vir質粒的所述衍生物 編碼菌株CryX的virG蛋白。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中菌株CryX的vir質粒的所述衍生物含有菌株CryX 的vir質粒的vir區。
8. 根據權利要求3所述的方法，其中所述雙元載體包含在所述菌株CryX或所述衍生菌 株中可表達的virG基因。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述virG基因編碼來自根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株 LBA4404 的 SEQ ID NO: 1 的 VirG 蛋白、或來自根癌農 桿菌菌株LBA4404的virG基因編碼的VirG蛋白的N54D突變體。
10. 根據權利要求1或2所述的方法，其中通過將目的T-DNA引入菌株CryX的vir質 粒中獲得菌株CryX的vir質粒的所述衍生物。
11. 根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中通過噴灑或者通過用所述懸液真 空滲入所述植物或者所述植物上的葉，使所述植物或者所述植物上的葉與所述懸液接觸。
12. 根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物如本塞姆 氏煙草（Nicotiana benthamiana)、煙草、棉、大豆、油籽油菜、椒、馬鈴薯、番爺，或單子葉植 物。
13. 根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述農桿菌菌株CryX是具有DSM 登錄號DSM25686的菌株。
14. 具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株，其中所述 衍生菌株具有菌株CryX的染色體背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir質粒或所述 vir質粒的衍生物；或菌株CryX或所述衍生菌株的農桿菌細胞。
15. 根據權利要求14所述的農桿菌細胞，其中所述細胞還包含雙元載體，所述雙元載 體包含了含有待轉染入植物中的目的DNA序列的T-DNA。
16. 試劑盒，其包含： -權利要求14中定義的所述菌株或所述衍生菌株的農桿菌細胞和 -含有在T-DNA中的待轉染入植物細胞中的目的DNA序列的載體。
17. 具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX的Vir質粒。
18. 農桿菌細胞，具有DSM登錄號DSM25686的菌株CryX的染色體。
19. 具有DSM登錄號DSM25686的農桿菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的含水細胞 懸液，所述懸液具有最多1. lxl06cfu/ml懸液、優選地最多4. 4xl05cfu/ml懸液和更優選地 最多1. lxl05cfu/ml懸液的細胞濃度。
【文檔編號】C12N15/82GK104334730SQ201380029089
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年4月3日 優先權日:2012年4月3日
【發明者】P·勒默爾, L·波特西, D·泰德, A·吉里奇, Y·格萊巴 申請人:諾麥生物科學有限公司