從d-氨基酸制備l-氨基酸的方法
【專利摘要】本發明涉及重組微生物，其與起始微生物相比具有更高濃度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氫酶、NADH共底物再生酶的一種，及如果需要還有過氧化氫酶，本發明還涉及一種通過使用這些微生物從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法。
【專利說明】從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法
[0001]本申請是2005年I月27日提交的題為“從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法”的中國專利申請200580005253.7的分案申請。
[0002]本發明涉及重組微生物，其與起始微生物相比具有更高濃度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氫酶、NADH共底物再生酶、并且如果需要還具有過氧化氫酶，本發明還涉及通過使用這些微生物從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法。
[0003]目前許多天然氨基酸是通過用遺傳優化的細菌進行發酵而以對映異構體純的形式而制備(de Graaf AA, Eggeling L, Sahm H2001.Metabolic Engineeringfor L-Lysine Production by Corynebacterium glutamicum.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73:9-29 ；Sahm H, Eggeling L, Eikmanns B,Kramer R.1996,Constructionof L-Lysine-,L-Threonine-, and L-1soleucin Overproducing Strains ofCorynebacterium Glutamicum.Ann N Y Acad Sci782:25-39)。
[0004]誠然,不是所有的蛋白質氨基酸(proteinogenic amino acids)并且僅極少數非天然氨基酸和D —氨基酸可以這種方式制備。由于對映異構體純的氨基酸的化學合成非常昂貴，因此已經開發了一系列酶學方法，其中一些方法已經可以達到每年生產數噸的規模。
[0005]所述方法的范圍包括從借助于酰基轉移酶、酰胺酶、酯酶、海因酶(hydantoinase)、氨基酸氧化酶和蛋白酶的動態外消旋物裂解到利用裂合酶、氨基轉移酶和脫氫酶的對映體選擇性合成(Schmid A.et al.(2002) “The Use of Enzymes in theChemical Industry in Europe，，，Curr Opin Biotechnol13(4):359-366)。
[0006]除了對映體選擇性合成法之外，動態外消旋物裂解(dynamisch kinetischeRacematspaltungen)也特別有效，其中不希望的對映異構體被原位外消旋化。在動態外消旋物裂解中，通過組合D-或L-氨基酸氧化酶與非選擇性化學還原初始亞氨基酸為主要氨基酸，也可以達 到100%得率。然而，還原劑如NaBH4必須以至少25倍當量過量應用，這樣導致這種方法非常昂貴(Enright et al., “Stereoinversion of Beta-andGamma-Substituted Alpha Amino Acids Using a Chemo-Enzymatic Oxidation-ReductionProcedure”，Chemical Communications (2003), (20), 2636-2637.)
[0007]本領域通常已知氨基酸脫氫酶對α -酮酸的氨基化。然而無可否認所得離析物與例如相應的外消旋氨基酸相比更加昂貴許多倍。
[0008]然而，通過聯合氨基酸氧化酶與氨基酸脫氫酶，可以從氨基酸原位獲得相應的酮酸。當這兩種酶具有相反的對映體選擇性時，D-氨基酸可以完全轉變為L-氨基酸或者L 一氨基酸完全轉變為D-氨基酸。從外消旋物開始，從中可以產生對映異構體純的化合物。
[0009]在此NADH共底物必須使用酶再生，因為其太昂貴以至于不能以化學計量的量應用。從其底物中釋放二氧化碳并因此使得反應不可逆的酶如甲酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶(脫羧化)是特別適用的(Hanson, R.L.et al.“Enzymatic Synthesis of L_6_Hydroxynorisoleucine，，, Bioorganic&Medicinal Chemistry (1999), 7 (10), 2247-2252,及 Nakajima N.et al., “Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to theL-Enantiomer，，，Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1990),(
【權利要求】
1.大腸桿菌或芽孢桿菌重組微生物，其與起始生物體相比具有更高濃度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氫酶和NADH共底物再生酶。
2.權利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是甲酸脫氫酶。
3.權利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是蘋果酸脫氫酶。
4.權利要求1的微生物，其中所述NADH共底物再生酶是醇脫氫酶。
5.權利要求1的微生物，其中所述L一氨基酸脫氫酶是L-亮氨酸脫氫酶。
6.權利要求1的微生物，其中所述D-氨基酸氧化酶是原玻璃蠅節桿菌或三角酵母的D-氨基酸氧化酶。
7.權利要求1的微生物，其中D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氫酶和NADH輔酶再生酶的胞內活性通過增加編碼所述酶的核苷酸序列的拷貝數或者使用強啟動子或者組合這兩種措施而與起始微生物相比是增高的。
8.權利要求1的微生物，其中所述細胞是靜態細胞。
9.通過使用對映體選擇性酶合成途徑從D-氨基酸生產L-氨基酸的方法，其特征在于將權利要求1-7任一項的重組微生物與含有D-氨基酸的溶液反應，并分離所得L-氨基酸。
10.權利要求9的方法，其特征在于應用權利要求8的微生物。
11.權利要求9或10 的方法，其特征在于選擇蘋果酸脫氫酶作為NADH共底物再生酶，并且將L-蘋果酸鹽或者L-蘋果酸加入含有D-氨基酸的溶液。
12.權利要求9或10的方法，其特征在于使用微生物的靜態細胞。
13.權利要求9或10的方法，其特征在于所用細胞的細胞壁通過化學或者物理措施而變得可通透并從溶液中吸收D-氨基酸。
14.權利要求9或10的方法，其特征在于應用選自如下一組的D-氨基酸或者外消旋DL-氨基酸:賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、組氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸、頭孢菌素。
15.權利要求9或10的方法,其中應用D-甲硫氨酸或DL-甲硫氨酸。
【文檔編號】C12P13/12GK103834607SQ201410044828
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2005年1月27日 優先權日:2004年2月19日
【發明者】維爾納·胡梅爾, 比吉特·戈伊克, 斯特芬·奧斯瓦爾德, 克里斯托夫·韋克貝克, 克勞斯·胡特馬赫爾 申請人:贏創德固賽有限公司