一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法
【專利摘要】本發明公開了一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法，該復合酶由纖維素酶、酸性淀粉酶和果膠酶組成；1g復合酶中含纖維素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果膠酶6000-7000U。該復合酶能同時提取中草藥中兩種有效成分，效果顯著，可用于提取益母草、炙淫羊藿和金銀花中有效成分。
【專利說明】一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及【技術領域】，特別是涉及一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法。
【背景技術】
[0002]從中草藥中提取有效成分的方法有多種，其中酶提取法是較新的方法。其中，常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶。通常來說，由多種酶組成的復合酶的酶解效果要優于單獨使用一種酶的酶解效果。但是，由于中藥材的品種不同，其生物體細胞結構和有效成分有很大的差異；而酶又具有單一性，復合酶的組成、配比決定了其功效。所以，也就是說，復合酶的酶解效果并不一定優于單一酶的酶解效果，因所要酶解的中藥材而異。例如，由纖維素酶和果膠酶組成的復合酶在提取金銀花中綠原酸中的酶解效果與單一的纖維素酶在提取金銀花中綠原酸中的酶解效果相比，并沒有明顯差異。另一方面，目前對酶法提取中藥成分的研究主要還停留在針對某些單個具體提取對象。也就是說，目前只能針對一種中藥材進行研究，獲得僅適用于該中藥材提取特定成分的復合酶。
【發明內容】
[0003]本發明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法。該復合酶能同時提取中草藥中兩種有效成分，效果顯著，可用于提取益母草、炙淫羊藿和金銀花中有效成分。
[0004]本發明的一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法技術方案為，該復合酶由纖維素酶、酸性淀粉酶和果膠酶組成；lg復合酶中含纖維素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果膠酶 6000-7000U。
`[0005]Ig復合酶中含纖維素酶667U、酸性淀粉酶66.7U、果膠酶6667U。
[0006]該復合酶用于提取益母草中的還原糖和鹽酸水蘇堿；或者提取炙淫羊藿中的還原糖和淫羊藿苷；或者提取金銀花中的還原糖和綠原酸。
[0007]該復合酶提取中草藥中有效成分的方法，包括以下步驟:
(1)將中草藥粉碎成粉狀；
(2)將中草藥粉加入去離子水混合均勻，PH調至4.5，得料液；
(3)將復合酶用甘油水溶液稀釋得復合酶稀釋液；
(4)將步驟(2)的料液預熱，加入復合酶稀釋液，酶解后過濾，取濾液即可。
[0008]步驟(1)中，中草藥粉碎至40-200目。
[0009]步驟(3)中，甘油水溶液濃度為20wt %，將復合酶用甘油水溶液稀釋至
0.0020g-0.5g/ml，得復合酶稀釋液。
[0010]當中草藥為益母草時，復合酶稀釋液濃度為0.025-0.30g/ml ；
當中草藥為炙淫羊藿時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.28g/ml ；
當中草藥為金銀花時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.3g/ml。[0011]優選的,復合酶稀釋液的優選濃度為0.25g/ml.
[0012]步驟(4)中，將料液于水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊加入酶液，酶解溫度為40-55°C，時間 4-7h。
[0013]優選的，步驟(4)中，酶解溫度為50°C，時間5h。
[0014]每克益母草提取35.7-181mg還原糖和5.6-10.8mg鹽酸水蘇堿；每克炎淫羊藿提取38.85-97mg還原糖和8.4-10.8g淫羊藿苷；每克金銀花提取80.13-420.57mg還原糖和13.6-16.8mg 綠原酸。
[0015]優選的，具體步驟如下:稱取中草藥5.0OOg (粉狀)置于200ml燒杯中，加入200mL的去離子水搖勻；然后加入0.5mL lmol/L的硫酸溶液將pH值調至4.5，得料液。取復合酶(每克復合酶中含有纖維素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果膠酶6667u)用20#%甘油溶解稀釋稀釋至lml，得酶液。
[0016]將料液于50° C水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊迅速加入酶液，靜置保溫5h ;然后過濾，取濾液。
[0017]其中，1g中草藥需要復合酶稀釋液lml。
[0018]本發明的有益效果為:本發明的復合酶破壞中草藥的細胞壁，降低粘度，提高中草藥浸提收得率，能夠同時用于提取益母草、炙淫羊藿和金銀花中有效成分；從而克服了一種特定組成的復合酶只能用于一種中草藥的技術難題。另外，采用本發明的復合酶，能夠同時提取上述每種中藥材中兩種有效成分。具體來說，能夠提取益母草中的還原糖和鹽酸水蘇堿；能夠提取炙淫羊藿中的還原糖和淫羊藿苷；能夠提取金銀花中的還原糖和綠原酸；且提取率高。
[0019]本發明的方法，簡單易操作，能同時提取兩種有效成分，提取率顯著提高。
[0020]經檢測，采用本發明方法，每克益母草可以提取35.7-181mg還原糖和5.6-10.8mg鹽酸水蘇堿；每克炙淫羊藿可以提取35.04-97mg還原糖和8.4-10.Sg淫羊藿苷；每克金銀花為可以提取80.13-420.57mg還原糖和13.6-16.8mg綠原酸。與未采用酶水解或采用纖維素酶和果膠酶組成的復合酶水解相比，每種原料中的兩種有效成分的提取率均大幅度提高，提取率提高了 16.4-495%。
[0021]由于復合酶的濃度會對酶的活性產生影響，從而影響整個提取過程；而不同原料其生物體細胞結構和有效成分有很大的差異；所需要的最優復合酶濃度不同。因此，所以上述方法中，當原料為益母草時，復合酶稀釋液的優選濃度為0.025-0.30g/ml ;此時，還原糖提取率為57.3-181mg/g,鹽酸水蘇堿的提取率為8.4-10.8mg/g。最優選的，復合酶稀釋液的優選濃度為0.25g/ml ;此時，還原糖提取率為181mg/g，鹽酸水蘇堿的提取率為10.8mg/g°
[0022]當原料為炙淫羊藿時，復合酶稀釋液的優選濃度為0.025-0.28g/ml ;此時，還原糖提取率為38.85-97mg/g,淫羊藿苷的提取率為9.6-10.8mg/g。最優選的，復合酶稀釋液的優選濃度為0.25g/ml ;此時，還原糖提取率為97mg/g，淫羊藿苷的提取率為10.8mg/g。
[0023]當原料為金銀花時，復合酶稀釋液的優選濃度為0.025-0.3g/ml ;此時，還原糖提取率為168.3-420.57mg/g，綠原酸的提取率為14.8-16.8mg/g。最優選的，復合酶稀釋液的優選濃度為0.25g/ml ;此時，還原糖提取率為420.57mg/g，綠原酸的提取率為16.8mg/g。
[0024]【具體實施方式】:為了更好地理解本發明，下面用具體實例來詳細說明本發明的技術方案。
[0025]本發明中的果膠酶、纖維素酶、酸性淀粉酶為:
果膠酶QB1502-92:lg酶粉在50°C、pH3.5的條件下，Ih分解果膠產生Img半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
[0026]纖維素酶NY/T912-2004:在37°C、pH為5.50的條件下，每分鐘從濃度為4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放I μ mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
[0027]酸性淀粉酶:Ig酶，于40°C、pH3.0條件，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以u/ g表示。
[0028]本發明的一種復合酶及其提取中草藥中有效成分的方法，該復合酶由纖維素酶、酸性淀粉酶和果膠酶組成；lg復合酶中含纖維素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果膠酶6000-7000U。
[0029]該復合酶用于提取益母草中的還原糖和鹽酸水蘇堿；或者提取炙淫羊藿中的還原糖和淫羊藿苷；或者提取金銀花中的還原糖和綠原酸。
[0030]該復合酶提取中草藥中有效成分的方法，包括以下步驟:
(1)將中草藥粉碎成粉狀； (2)將中草藥粉加入去離子水混合均勻，PH調至4.5，得料液；
(3)將復合酶用甘油水溶液稀釋得復合酶稀釋液；
(4)將步驟(2)的料液預熱，加入復合酶稀釋液，酶解后過濾，取濾液即可。
[0031 ] 步驟(1)中，中草藥粉碎至40-200目。
[0032]步驟(3)中，甘油水溶液濃度為20wt %，將復合酶用甘油水溶液稀釋至
0.0020g-0.5g/ml，得復合酶稀釋液。
[0033]當中草藥為益母草時，復合酶稀釋液濃度為0.025-0.30g/ml ；
當中草藥為炙淫羊藿時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.28g/ml ；
當中草藥為金銀花時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.3g/ml。
[0034]步驟(4)中，將料液于水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊加入酶液，酶解溫度為40-55°C，時間 4-7h。
[0035]實施例中提及還原糖的測定，具體方法為:
葡萄糖溶液:稱取無水葡萄糖1.000g，加蒸餾水溶解，定容至100mLDNS試劑:稱取3，5- 二硝基水楊酸3.15g(化學純)，加水500ml，攪拌5s，水浴至45°C。然后逐步加入100mL氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意:在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48°C。)。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。
[0036]吸取蒸餾水4.0ml，加入DNS試劑5.0ml，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml，制成標準空白樣。
[0037]取2ml上清液加入2ml蒸餾水、5mlDNS試劑混勻后沸水浴5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml后混勻。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度。
[0038]標準曲線的繪制分別吸取葡萄糖溶液1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml，分別用蒸餾水定容至100ml,配制成濃度為0.10一0.70mg/ml葡萄糖標準溶液。
[0039]分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標準溶液各2.0Oml (做二個平行)，分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試劑。電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標準空白樣為對照調零，在540nm處測定吸光度OD值A。
[0040]以葡萄糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。
[0041]還原糖的計算:
Xd = AXK + C0
Xd 一試樣稀釋液中的還原糖濃度，mg/ml ；
A一反應液的吸光度；
K 一標準曲線的斜率；
C0 一標準曲線的截距。
[0042]實施例1
稱取益母草5.0OOg粉碎至100目置于200ml燒杯中，加入200mL的去離子水搖勻；然后加入0.5mL lmol/L的硫酸溶液將pH值調至4.5，得益母草液。取復合酶(每克復合酶中含有纖維素酶667u、酸性淀粉酶66.7u和果膠酶6667u)用20wt%甘油溶解稀釋稀釋至1ml，
得酶液。
[0043]將益母草液于50° C水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊迅速加入酶液，靜置保溫5h ；然后過濾，取濾液。
[0044]上述操作共重復進行5次，每次復合酶的用量均不同，依次為0g、0.0025g、
`0.025g、0.25g 和 0.3g。
[0045]分別檢測將5次操作所獲取的濾液中的原糖含量和鹽酸水蘇堿含量。
[0046]檢測結果如表1。
[0047]表1
還原糖益酸水蘇堿 中藥名稱酶添加量-------- 含量mg ml 收率mg g含量mg ml 收率mg g
益母萆 O O J605 30.42 OJl4—4
益母萆 OmiSg 0.3919 35.7 0.145.6 。
益母萆 0_025g L4313 5'3 0.21S.4 益母萆 025g 4 530 ISl O—2 了10—S 益母萆 Olg 4.235 169J 02610—4
[0048]實施例2
稱取益母草5.0OOg粉碎至180目置于200ml燒杯中，加入200mL的去離子水搖勻；然后加入0.5mL lmol/L的硫酸溶液將pH值調至4.5，得益母草液。取復合酶用20Wt%甘油溶解稀釋稀釋至lml，得酶液。
[0049]將益母草液于50° C水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊迅速加入酶液，靜置保溫5h ；然后過濾，取濾液。
[0050]上述操作共重復進行3次，每次復合酶用量0.25g，復合酶中的各種酶含量均不同:
①每克復合酶中含有纖維素酶300u、酸性淀粉酶IOOu和果膠酶200u；
②每克復合酶中含有纖維素酶500u、酸性淀粉酶70u和果膠酶6500u；
③每克復合酶中含有纖維素酶700u、酸性淀粉酶60u和果膠酶6000u。
[0051]分別檢測原糖含量和鹽酸水蘇堿含量。
[0052]檢測結果如表2。
[0053]表 2
【權利要求】
1.一種復合酶，其特征在于，由纖維素酶、酸性淀粉酶和果膠酶組成；lg復合酶中含纖維素酶500-700U、酸性淀粉酶60-75U、果膠酶6000-7000U。
2.根據權利要求1所述的一種復合酶，其特征在于，Ig復合酶中含纖維素酶667U、酸性淀粉酶66.7U、果膠酶6667U。
3.根據權利要求1所述的一種復合酶，其特征在于，該復合酶用于提取益母草中的還原糖和鹽酸水蘇堿；或者提取炙淫羊藿中的還原糖和淫羊藿苷；或者提取金銀花中的還原糖和綠原酸。
4.如權利要求3所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將中草藥粉碎成粉狀； (2)將中草藥粉加入去離子水混合均勻，PH調至4.5，得料液； (3)將復合酶用甘油水溶液稀釋得復合酶稀釋液； (4)將步驟(2)的料液預熱，加入復合酶稀釋液，酶解后過濾，取濾液即可。
5.根據權利要求4所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，步驟(I)中，中草藥粉碎至40-200目。
6.根據權利要求4所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，步驟(3)中，甘油水溶液濃度為20Wt%，將復合酶用甘油水溶液稀釋至0.0020g-0.5g/ml，得復合酶稀釋液。
7.根據權利要求6所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，當中草藥為益母草時，復合酶稀釋液濃度為0.025-0.30g/ml ； 當中草藥為炙淫羊藿時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.28g/ml ； 當中草藥為金銀花時，復合酶稀釋液的濃度為0.025-0.3g/ml。
8.根據權利要求7所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，復合酶稀釋液的濃度為0.25g/ml。
9.根據權利要求4所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，步驟(4)中，將料液于 水浴鍋中預熱2min，邊攪拌邊加入酶液，酶解溫度為40_55°C，時間4-7h。
10.根據權利要求4所述的一種復合酶提取中草藥中有效成分的方法，其特征在于，步驟(4)中，酶解溫度為50。。，時間5h。
【文檔編號】C12N9/42GK103865913SQ201410130287
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】吳秀玉, 宋迪, 郭殿梁 申請人:濟南諾能生物工程有限公司