白介素6檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種白介素6檢測試劑盒。試劑盒包含兩株特異性白介素6單克隆抗體。多孔板上包被的單克隆抗體與生物素標記的單克隆抗體以及被測樣本的白介素6形成“包被抗體-抗原-生物素標記抗體”的夾心復合物結構。抗體上所標記的生物素與HRP標記的鏈霉親和素結合，HRP進而與底物反應產生信號，用以進行白介素6定量分析。通過本發明的試劑盒，使得能夠迅速、靈敏地定量檢測樣本中的白介素6含量。
【專利說明】白介素6檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子免疫學領域，具體涉及一種檢測白介素6(IL-6)蛋白含量的試劑盒。
【背景技術】
[0002]機體在受到不同類型的創傷和刺激后會出現一個類似炎癥反應的狀態，即全身炎癥反應綜合征(SIRS)。在這一過程中損傷因素刺激機體炎性細胞釋放炎癥介質。通常情況下，作為防御機制有益于機體創傷后的恢復，并會隨著創傷的痊愈而自行消退。然而，如果由于感染、再次損傷等原因使這種炎癥反應過度或者反應時間過長，機體合成釋放過多的炎癥介質，就會引起失控和逐級放大的連鎖反應。機體進入一種不良的全身狀態，表現出中重度SIRS，隨著病情進一步惡化，嚴重多發傷繼發多器官功能不全綜合征(MODS)就會序貫發生。因此，創傷、SIRS、MODS在發展上是一個漸進的過程，炎癥反應的強度與患者創傷的發展和轉歸密切相關。
[0003]IL-6是降鈣素的前體，生理情況下由甲狀腺C細胞合成與分泌。正常情況下，體內不能檢測到IL-6的存在，在危重病患者的外周血、肺及肝組織中可被檢測到，且被認為對全身性感染具有較好的診斷價值和預警作用。
[0004]IL-6由T淋巴細胞、B淋巴細胞及內皮細胞產生，它能刺激T細胞、B細胞的增殖，并能促進細胞毒性T細胞分化，提高自然殺傷細胞的活力。創傷后不良者早期血液中即可檢測到IL-6的異常升高。在SIRS過程中，促炎細胞因子首先被激活，而后促使機體釋放IL-6，后者又正反饋于單核巨噬細胞系統和多形核粒細胞，進一步產生更多的各種炎癥介質。因此，IL-6在炎癥反應中起核心調節作用，是炎癥免疫反應的重要介質。
【發明內容】
[0005]根據一些實施方式，提供了一種檢測樣本中白介素6的ELISA試劑盒，其包含:
[0006]包被有第一白介素6單克隆抗體的多孔板、
[0007]試劑1、
[0008]試劑2、
[0009]試劑3、
[0010]樣本稀釋液、和
[0011]底物液。
[0012]在一些實施方案中，包被有第一白介素6單克隆抗體的多孔板中第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796或8797的雜交瘤細胞所產生。
[0013]在一些實施方案中，試劑I也作生物素標記的白介素6單克隆抗體工作液。其包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉，小牛血清、生物素標記的第二白介素6單克隆抗體和防腐劑。在一些實施方案中，第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797或8796的雜交瘤細胞所產生。第二白介素6單克隆抗體能特異性識別并結合樣本中的IL-6，抗體上所標記的生物素與HRP標記的鏈霉親和素結合，HRP進而與底物反應產生信號。產生的信號換算成濃度，用于定量分析。在一些實施方案中，試劑I包含5.8g/L磷酸氫二鈉、0.593g/L磷酸二氫鈉、8.0g/L氯化鈉、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素標記的第二白介素6單克隆抗體。當第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生；或者當第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCCN0.8797的雜交瘤細胞所產生。
[0014]在一些實施方案中，試劑2用作生物素標記抗體的稀釋液、或用作辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素的稀釋液。在一些實施方案中，試劑2包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉，小牛血清、和防腐劑。在具體實施方案中，1000ml的試劑2中包含5.8g磷酸氫二鈉、
0.593g磷酸二氫鈉、8.0g氯化鈉、200ml小牛血清和0.5ml Proclin-300?
[0015]在一些實施方案 中，試劑3用作辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素工作液。在一些實施方案中，試劑3包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、和防腐劑。
[0016]在一些實施方案中，樣本稀釋液包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、山羊血清、吐溫20和防腐劑。在具體實施方案中，1000ml樣本稀釋液是IOX的，其包括58g/L磷酸氫二鈉、5.94g/L磷酸二氫鈉、180g/L氯化鈉、250ml/L山羊血清、10ml/L吐溫20和5ml/L防腐劑。樣本稀釋液可以配制成濃縮型，也可以不是。技術人員可以理解，其它濃縮倍數也包括在本發明范圍內。
[0017]在一些實施方案中，底物液包含:辣根過氧化物酶底物。在具體實施方案中，底物液包含底物液A和底物液B。底物液A是含有過氧化脲的檸檬酸緩沖液。底物液B是含有TMB的檸檬酸緩沖液。
[0018]應當理解，本發明的各試劑可以配制成濃縮型，也可以不是。在一些實施方案中，一些試劑配制成濃縮型，這可以減少運輸、儲存體積。技術人員可以理解，除了具體實例以外的其它濃縮倍數也包括在本發明范圍內。
[0019]在一些實施方案中，樣本來自哺乳動物，優選來自人類。樣本選自全血、血漿、和血清。在具體實施方案中，樣本為人血清。
[0020]在一些實施方案中，本發明的試劑盒還可以根據需要包括校準品。校準品用于標準曲線的繪制。校準品包含已知濃度的白介素6，白介素6濃度在0-1500pg/ml范圍內。在具體實施方案中，校準品中白介素6濃度分別為0、10、25、250、750、1500pg/ml。
[0021 ] 在一些實施方案中，本發明的試劑盒還可以根據需要包括質控品。質控品包含已知濃度的白介素6，白介素6濃度在200-1000pg/ml范圍內。在具體實施方案中，質控品中白介素 6 濃度分別為 700pg/ml - 900pg/ml ；200pg/ml - 400pg/ml。
[0022]在一些實施方案中，校準品或質控品是已知IL-6濃度的血清；血清可以是任何市售血清、或收集自臨床機構的人血清；其經滅活處理，并且抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均為陰性。在一些實施方案中，還可以使用陰性血清稀釋IL-6純品來制備校準品或質控品O
[0023]根據一些實施方案，提供了一種白介素6單克隆抗體，其由保藏號為CGMCCN0.8796的雜交瘤細胞所產生。[0024]根據另一些實施方案，提供了一種白介素6單克隆抗體，其由保藏號為CGMCCN0.8797的雜交瘤細胞所產生。
[0025]根據一些實施方案，提供了本發明的白介素6單克隆抗體在制備ELISA診斷試劑中的用途。在一個具體實施方案中，保藏號為CGMCCN0.8796和8797的雜交瘤細胞所產生2株白介素6單克隆抗體共同用于制備ELISA診斷試劑。
[0026]根據一些實施方案，提供了保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞。
[0027]根據另一些實施方案，提供了保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞。
【具體實施方式】
[0028]為了使本發明易于理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明。以下提供了本發明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是，這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發明。
[0029]實施例1.1L-6重組蛋白的制備
[0030]從NCBI數據庫中獲得IL-6編碼序列，構建原核表達載體pET32_IL6，誘導表達IL-6重組抗原,經Western印跡分析蛋白有免疫反應,鎳親和層析柱純化大量制備IL-6重組蛋白，該蛋白可以用于抗體的制備。
[0031]1.pET28-1L-6表達載體構建
[0032]IL-6基因購買于武漢三鷹生物技術有限公司，參照IL-6cDNA序列設計引物:
[0033]IL-6-F:cgggatccccagtacccccaggag(SEQ ID N0.1)和
[0034]IL-6-R:ccgctcgagctacatttgccgaag(SEQ ID N0.2)。
[0035]PCR擴增IL-6基因，PCR體系:
[0036]
【權利要求】
1.一種檢測樣本中白介素6的ELISA試劑盒，其包含: 包被有第一白介素6單克隆抗體的多孔板、 試劑1、 試劑2、 試劑3、 樣本稀釋液、和 底物液； 其中: 試劑I包含:磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、生物素標記的第二白介素6單克隆抗體、和防腐劑； 試劑2包含:磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、和防腐劑； 試劑3包含:磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、小牛血清、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、和防腐劑； 樣本稀釋液包含:磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、山羊血清、吐溫20和防腐劑； 底物液包含:辣根過氧化物酶底物； 當第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生；或者當第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生； 樣本來自哺乳動物，優選人類，樣本選自全血、血漿和血清。
2.根據權利要求1所述的檢測樣本中白介素6的ELISA試劑盒，還包括: 校準品，校準品包含已知濃度的白介素6，白介素6濃度在0-1500pg/ml范圍內。
3.根據權利要求1所述的檢測樣本中白介素6的ELISA試劑盒，還包括質控品，質控品包含已知濃度的白介素6，白介素6濃度在200-1000pg/ml范圍內。
4.一種檢測樣本中白介素6的ELISA試劑盒，其包含: 包被有第一白介素6單克隆抗體的多孔板、 試劑1、 試劑2、 試劑3、 樣本稀釋液、和 底物液； 其中: 試劑I包含:5.8g/L磷酸氫二鈉、0.593g/L磷酸二氫鈉、8.0g/L氯化鈉、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素標記的第二白介素6單克隆抗體；
試劑2包含:5.8g/L磷酸氫二鈉、0.593g/L磷酸二氫鈉、8.0g/L氯化鈉、200ml/L小牛血清、和 0.5ml/L Proclin-300 ； 試劑3包含:5.8g/L磷酸氫二鈉、0.593g/L磷酸二氫鈉、8.0g/L氯化鈉、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12mg/L辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素； 樣本稀釋液包含:58g/L磷酸氫二鈉、5.94g/L磷酸二氫鈉、180g/L氯化鈉、250ml/L山羊血清、lOml/L吐溫20和5ml/L防腐劑； 底物液由底物液A和底物液B組成，底物液A含有過氧化脲和檸檬酸緩沖液，底物液B含有四甲基聯苯胺和檸檬酸緩沖液； 當第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生；或者當第二白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生時，第一白介素6單克隆抗體由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生。
5.一種白介素6單克隆抗體，其由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生。
6.一種白介素6單克隆抗體，其由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生。
7.如下兩株白介素6單克隆抗體的組合在制備ELISA診斷試劑中的用途: 由保藏號為CGMCC N0.8796的雜交瘤細胞所產生的白介素6單克隆抗體、以及由保藏號為CGMCC N0.8797的雜交瘤細胞所產生的白介素6單克隆抗體。
8.一種雜交瘤細胞， 其選自保藏號為CGMCC N0.8796 JPCGMCC N0.8797的雜交瘤細胞。
【文檔編號】C12N5/20GK103969438SQ201410176133
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】于暉, 李雨心, 王旭, 陳勤慧, 李鑫, 劉琦, 李麗萍 申請人:北京普恩光德生物科技開發有限公司