p110δ及其抗體在特異性標記滋養層巨細胞（pTGC）中的應用的制作方法

p110δ及其抗體在特異性標記滋養層巨細胞（pTGC）中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了p110δ及其抗體在特異性標記早期滋養層巨細胞（ParietalTGC，pTGC）中的應用。所述p110δ為p110δ的片段，該片段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根據本發明的記載，以p110δ抗體作為檢測媒介，通過常規的免疫組化、免疫熒光或PCR等技術方法，可以特異性地標識pTGC，且該標記更加簡便、檢測時間大大縮短、易于識別，成功率更高，使用者接受度更好，更加便于應用于臨床。另外，相比于原位雜交的核酸水平，本發明的觀測指標在于蛋白水平，更能直接反應機體效應情況，應用范圍更廣。
【專利說明】P110S及其抗體在特異性標記滋養層巨細胞（PTGC)中的 應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞檢測標記【技術領域】。更具體地，涉及pll〇 S及其抗體在特異性標 記滋養層巨細胞（PTGC)中的應用。

【背景技術】
[0002] 胎盤是哺乳動物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內膜聯合長成的母子間交換 物質的過渡性器官。對于在子宮中發育的胎兒來說，胎盤具有供給、代謝、排泄、分泌和免疫 等功能，胎盤異常則會引起胎兒缺氧、窘迫、營養不良、發育遲緩、智力受損、甚至胎死腹中 等現象。
[0003] 滋養層細胞中的滋養層巨細胞（Parietal TGC，pTGC)為一類線性排列在植入位 點及頂葉卵黃囊外側的多核巨型細胞，根據其分化形成的不同，分為初級與次級（Γ與 2° )，pTGC在胎盤形成與功能維持中的變化與胎盤異常的發生有密切聯系。pTGC的侵入是 胎盤形成中一個非常關鍵的過程，且受著嚴格的時空調控（Cross et al.，1994)。在人類， 滋養層侵入不足或過度侵入都會引起妊娠的異常，導致病理性妊娠，比如先兆子癇或絨毛 膜癌（Karmakar et al.，2004)。因此，pTGC的監測和標記對于胚胎以及妊娠過程的監測 具有非常重要的意義。
[0004] 目前，pTGC的標記方法的研究主要集中在原位雜交（in situ hybridization, ISH)檢測法，相關特異性指標有 P11、P12 與 Plf (Simmons DG et al·，Dev Biol, 2007)。 ISH是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探 針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子,經一定 的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。ISH是一項可以特異的檢 測目的基因表達的實驗技術，但是要想檢測到特定的基因表達，必須具備以下條件：（1)必 須專門設計的已知核酸序列的核酸片段-探針；（2)簡單而又可靠的探針標記方法；（3)敏 感性高且特異性強的檢測方法。不僅如此，無論自探針設計、制備還是后期實驗中，ISH都 體現諸多不便，操作步驟繁多，耗時長達三天，雖有試劑盒的出產以提高實驗成功率和便利 度，但相比免疫組化（IHC)等實體結構定位標記方法，ISH的"親民度"仍不高。但是，免疫 組化方法需要合適的標記抗體，才能保證標記的特異性和標記效果，因此標記靶標及其抗 體的選擇對免疫組化結果是至關重要的。


【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是克服現有滋養層巨細胞（pTGC)的標記技術缺陷和不 足，提供一種準確性好、特異性強、適用性廣的pTGC早期標記物pllOdelta (ρ110 δ )。
[0006] 本發明的目的是提供ρ110 δ及其抗體在特異性標記滋養層巨細胞（pTGC)中的應 用。
[0007] 本發明上述目的通過以下技術方案實現： 本發明提供了 pllO S在特異性標記早期滋養層巨細胞中的應用。
[0008] 所述應用是指ρ--ο δ在制備滋養層巨細胞的特異性標記物中的應用。
[0009] 所述ρ--ο δ為ρ--ο δ的片段，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發明還提供了 P110S抗體作為滋養層巨細胞的特異性標記物的應用，所述 pi 10 δ抗體是以SEQ ID NO. 1所示序列為抗原獲得的抗體。
[0011] 優選地，所述plio S抗體是以SEQ ID NO. 1所示的ρ--ο δ片段為抗原獲得。
[0012] 所述應用的方法為：以ρ110 δ抗體作為檢測標記物，利用免疫組化、免疫熒光或 PCR的方法，對滋養層巨細胞進行特異性標記。
[0013] 優選地，上述滋養層巨細胞是早期的滋養層巨細胞。
[0014] SEQ ID NO. 1所示序列即人源Ν端氨基酸363?582,具體如下： ValSerValCysSerGluProValTrpLysGlnArgLeuGluPheAspIleAsnlleCysAspLeuProArg MetAlaArgLeuCysPheAlaLeuTyrAlaVallleGluLysAlaLysLysAlaArgSerThrLysLysLysSerLy sLysAlaAspCysProIleAlaTrpAlaAsnLeuMetLeuPheAspTyrLysAspGlnLeuLysThrGlyGluArgC ysLeuTyrMetTrpProSerValProAspGluLysGlyGluLeuLeuAsnProThrGlyThrValArgSerAsnPro AsnThrAspSerAlaAlaAlaLeuLeuIleCysLeuProGluValAlaProHisProValTyrTyrProAlaLeuGl uLysIleLeuGluLeuGlyArgHisSerGluCysValHisValThrGluGluGluGlnLeuGlnLeuArgGluIleL euGluArgArgGlySerGlyGluLeuTyrGluHisGluLysAspLeuValTrpLysLeuArgHisGluValGlnGlu HisPheProGluAlaLeuAlaArgLeuLeuLeuValThrLysTrpAsnLysHisGluAspValAlaGlnMetLeuTy rLeuLeuCysSerTrpProGluLeuProValLeuSerAlaLeuGluLeu。
[0015] pllOdelta (pllO δ )是磷酸肌醇-3激酶（PI3K)的一種，即為pllO δ型磷酸肌 醇-3激酶。研究表明，ρ110 δ同工型牽涉在與免疫-炎癥性疾病相關的生物學功能中，包 括來自Β-細胞受體、Τ細胞受體的信號傳導，肥大細胞和單核細胞/巨噬細胞的FcR信號 傳導和破骨細胞功能/RANKL信號傳導。pllO δ基因缺失或選擇性引入pllO δ的催化失活 突變體導致Β細胞增殖和信號傳導的幾乎完全缺失，還導致通過Τ細胞進行的信號傳導受 損。
[0016] 本發明研究團隊長期致力于胎盤相關研究工作，在對pTGC的研究工作中，為了 克服現有PTGC的標記技術存在的操作復雜，耗時等問題，通過大量的研究和探索，發現 pllO δ特異性在pTGC中表達，可能與流產問題相關，進一步機制研究正在進行中。但是我 們已非常明確的是，將P110S抗體作為pTGC的特異性標記物，即以ρΙΙΟδ作為檢測媒介， 通過免疫組化、免疫熒光或PCR等技術方法，可以特異性地標識pTGCs，以此可以輔助與胚 胎發育相關的指標檢測。并且該標記更加簡便、易于識別，應用范圍更廣。另外，相比于原 位雜交的核酸水平，本發明的觀測指標在于蛋白水平，更能直接反應機體效應情況。
[0017] 本發明對所涉及的實驗檢測方法并不做嚴格限制，我們強調的是通過pllO delta (PllO δ )作為檢測標記物，可以特異性標識pTGC。檢測方法可以是常用的免疫組化（IHC)、 免疫熒光（IF)、聚合酶鏈反應（PCR)、原位雜交（ISH)等等，其反應條件參數等參考任何一 個可用的實驗指導說明，均可獲得相應的反應效果。
[0018] 本發明具有以下有益效果： 本發明提供了 PllO s及其抗體在特異性標記滋養層巨細胞（pTGC)中的應用，克服了 現有pTGC的標記技術存在的操作復雜，耗時等問題，將pllO δ抗體作為pTGC的特異性標 記物，即以pllO S作為檢測媒介，通過免疫組化、免疫熒光或PCR等技術方法，可以特異性 地標識pTGCs，即可在胚胎中清晰辨別出pTGCs，以此可以輔助與胚胎發育相關的指標檢 測。
[0019] 本發明以ρ--ο δ作為pTGC的特異性標記物，對所涉及的實驗檢測方法并不做嚴 格限制；如免疫組化（IHC)、免疫熒光方法（IF)等均是更商業化的檢測方法和試劑，實驗技 術應用廣泛，且操作更易上手，實驗時間可縮短為一天(原有的ISH檢測三天一周期)，標記 結果更易于識別，應用范圍更廣，這些方法均是廣大實驗室和臨床監測中的常用特異性實 體結構定位標記方法。拓展了對PTGC進行定位檢測的技術手段，使得實驗的完成比以往更 便利，成功率更高，使用者接受度更好，更加便于應用于臨床（目前IHC為臨床診斷檢測中 一個核心檢測技術)。
[0020] 除了監測手段上的優化之外，在特異性的標記物方面，我們的新發現ρ--ο δ作為 一個經典的ΡΙ3Κ信號通路中的重要成員，以其作為特異性蛋白標記物，借助常用的IHC或 IF等方法，即可特異識別出p-TGCs，方便且實用，ρ110 δ可以是已商業化的抗體，應用更簡 便。另外，相比于原位雜交的核酸水平，本發明的觀測指標在于蛋白水平，更能直接反應機 體效應情況。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為小鼠妊娠第8. 5天時胚胎HE染色結果。
[0022] 圖2為小鼠妊娠第8. 5天胚胎pTGCs經pi 10 δ IHC檢測顯示細胞漿的特異性強 陽性表達結果。
[0023] 圖3為小鼠妊娠第8. 5天胚胎pTGCs經CK7 IHC檢測顯示細胞漿的特異性強陽性 表達結果。
[0024] 圖4為小鼠妊娠第10. 5天胚胎pTGCs經pi 10 δ IHC檢測顯示細胞漿的特異性弱 陽性表達結果。
[0025] 圖5為小鼠妊娠第13. 5天胚胎pTGCs經pi 10 δ IHC檢測顯示細胞漿的無表達結 果。
[0026] 圖6為小鼠妊娠第8. 5天胚胎pTGCs經pi 10 δ IF檢測顯示細胞漿的特異性表達 結果(未共標CK7)。
[0027] 圖7為小鼠妊娠第8. 5天胚胎pTGCs經pi 10 δ IF檢測顯示細胞漿的特異性表達 結果(共標CK7)。

【具體實施方式】
[0028] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試 齊U、方法和設備。
[0029] 除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0030] pllO delta (ρ110 δ )抗體購買于 Santa Cruz 公司（sc-55589)。按照抗體說明 書的使用范圍均可使用。本發明中應用的抗體體積稀釋配比為1 :150,稀釋液體為1% (w/ v) BSA 液體或 ρΗ7· 2?7. 6 的 PBS。
[0031] 本發明研究發現plio δ特異性在滋養層巨細胞（PTGC)中表達，尤其是在早期的 PTGC，即自胚胎植入完成至胎盤形成期間(本發明中的檢測時間點為第7. 5~8. 5天)的pTGC 特異性地陽性表達，如附圖2飛所示，胚胎發育早期pTGC為強陽性表達，隨著胎盤發育， PTGC遷移后，其ρΙΙΟδ陽性減弱。因此，Ρ110δ可以作為早期pTGC的特異性標記物。以 下實施例利用常用的免疫組化和免疫熒光技術為例，以pll〇 S為檢測媒介，來特異性標記 早期pTGC。
[0032] 實施例1免疫組化（IHC)檢測pTGC 1、pl 10 δ抗體的制備 以人源P110S的部分片段，即SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列作為信息依據制備ρΙΙΟδ 抗體。
[0033] 所述ρ110 δ抗體購買于圣克魯斯生物技術公司（Santa Cruz Biotechnology),商 品名PI3-kinase ρΙΙΟδ抗體（A-8) (sc-55589)，為單克隆小鼠來源抗體，可針對小鼠及 人源性標本進行實驗檢測。
[0034] 2、獲取小鼠胚胎/胎盤 分別選取妊娠第7. 5~8. 5天、第10. 5~12. 5天和第13. 5~15. 5天的小鼠（C57BL/6J小 鼠，購于廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK (粵）2008-0002)，按照以下方法獲 取小鼠胚胎/胎盤： 51. 將小鼠頸部脫臼處死； 52. 將小鼠仰臥，腹中間開口暴露腹腔，將腸道組織翻向外側，暴露妊娠中子宮，用鑷子 夾住陰道部，子宮兩側將妊娠子宮分離出來，放入盛有磷酸鹽緩沖液（PBS)的小皿中； 53. 沿子宮系膜一側，用精細的鑷子與剪刀配合，將子宮剖開，分離出胚胎/胎盤，并將 其放入專用小盒編號，后固定、脫水、包埋。
[0035] 3、將上述獲得的胚胎/胎盤進行切片、染色，利用IHC的方法，以ρΙΙΟδ抗體(一 抗）進行檢測。以CK7 (細胞角蛋白7)作為陽性對照，CK7是滋養層細胞公認的標示物。
[0036] IHC操作流程如下： (1)脫蠟：按照如下順序進行處理：二甲苯Ι，π各處理20min，無水乙醇處理15min，再 換新的無水乙醇處理l〇min，95%酒精處理10min，90%酒精處理10min，80%酒精處理10min， 70%酒精處理10min，流水沖洗3min。
[0037] (2)蒸餾水泡 2min。
[0038] (3)檸檬酸鹽（ΡΗ=6· 0)修復：T3min30s (先將檸檬酸鹽置于高壓鍋中煮沸，然后放 入切片，待充氣后:T3min30s)。
[0039] (4)少量流水沖洗高壓鍋冷至室溫(約2(T25min)。
[0040] (5)蒸餾水泡 2min。
[0041] (6 ) 3% 的 H202 常溫 30min。
[0042] (7)蒸餾水泡洗 2min，PBS (ρΗ=7· 2?7. 4) 10min，重復 3 次。
[0043] (8) 10%胎牛血清（PBS稀釋）室溫封閉1小時。
[0044] (9)加入一抗，4°C過夜。
[0045] (10)蒸餾水泡洗 2min，后 PBS (ΡΗ=7· 2?7. 6) 10min，重復 3 次。
[0046] (11)加二抗(羊抗小鼠 IgG，購于博士德公司，1 :150稀釋后使用）室溫放置廣2h。
[0047] (12) PBS 洗 3min，重復 5 次。
[0048] (13) DAB 顯色（使用 Thermo SCIENTIFIC 公司的 DAB 濃縮液（10X)，配合 Thermo SCIENTIFIC公司DAB稀釋液，進行1 :9稀釋后，按照使用說明書進行)。
[0049] (14)自來水涮洗5?10下。
[0050] (15)蘇木素復染30 s。
[0051] (16)自來水洗一下，1%鹽酸分化f 2s，自來水再洗2h (17) 80%酒精處理2min，95%酒精處理2min，無水乙醇處理2min (兩次)，二甲苯處理 2min (兩次)。
[0052] (18)風干，封片劑封片。所述封片劑為中性樹膠，購于國藥集團化學試劑有限公 司。
[0053] 4、檢測結果 結果分別如附圖Γ5所示，附圖1所示為小鼠妊娠第8. 5天時胚胎HE染色結果。圖 2為小鼠妊娠第8. 5天時胚胎pTGCs經pi 10 δ IHC檢測顯示細胞漿的特異性強陽性表達結 果。圖3為小鼠妊娠第8.5天時胚胎pTGCs經CK7 IHC檢測顯示細胞漿的特異性強陽性表 達結果。圖4為小鼠妊娠第10. 5天時胚胎pTGCs經ρ110 δ IHC檢測顯示細胞漿的特異性 弱陽性表達結果。圖5為小鼠妊娠第13.5天時胚胎pTGCs經ρΙΙΟδ IHC檢測顯示細胞漿 的無表達結果。
[0054] 結果顯示，可在早期發育胚胎中（從小鼠胚胎植入開始，至胎盤形成前）清晰辨別 出pTGCs。另外本發明中分別檢測了胚胎蛻膜發育前期(第7. 5~8. 5天)、胎盤初步形成 期(第10. 5~12. 5天）和胎盤期(本專利檢測點為胚胎發育第13. 5~15. 5天的胎盤）的小鼠 pTGCs中ρΙΙΟ δ的特異性表達，結果顯示，僅在胎盤形成前的標本中（本發明中顯示為第 7. 5~8. 5天）的pTGC特異性地陽性表達ρ110 δ。
[0055] 綜上所述，胚胎發育早期pTGC為強陽性表達，隨著胎盤發育，pTGC遷移后，其 P110S陽性減弱。
[0056] 實施例2免疫熒光技術（IF)檢測pTGC l、pll〇S抗體的制備以及小鼠胚胎/胎盤的獲取同實施例1。
[0057] 2、將上述獲得的胚胎進行切片、染色，利用IF的方法，以ρΙΙΟ δ抗體(一抗）進行 檢測。以CK7 (細胞角蛋白7)作為陽性對照，CK7是滋養層細胞公認的標示物。
[0058] IF的操作流程如下： (1)石蠟切片正常脫蠟至水，PBS洗5分鐘，3次。
[0059] (2)抗原修復：0· 01M枸櫞酸鹽緩沖液ρΗ=6· 0 (修復液)，沸水浴熱修復15分鐘。
[0060] (3) 10%胎牛血清（PBS稀釋）室溫封閉1小時 (4) 一抗孵育，4°C過夜(抗體1 :200倍稀釋)。
[0061] (5) PBS 洗 5 分鐘，3 次。
[0062] (6)二抗孵育（AlexaFluor 488標記的羊抗小鼠 IgG，1 :200倍稀釋)，37°C，60分 鐘。
[0063] (7) PBS 洗 5 分鐘，3 次。
[0064] (8) DAPI復染5?10分鐘，PBS洗5分鐘，3次。
[0065] (9)防猝滅熒光封片劑封片。
[0066] (10)鏡檢。
[0067] 其中，所述的0. 01M枸櫞酸鹽緩沖液（Citrate buffer)的配制方法如下： 儲存液:Α. 0. 1M枸櫞酸溶液：稱取21. Olg枸櫞酸（C6H807*H20)溶于1000mL蒸餾水中。
[0068] B. 0· 1M枸櫞酸鈉溶液：稱取29. 41g枸櫞酸三鈉（C6H5Na307*2H 20)溶于1000mL蒸 餾水中。
[0069] 工作液：取9mL A液和41mL B液加入450mL蒸饋水中，溶液pH值應為5. 9?6. 1。
[0070] 所述防猝滅熒光封片劑為購于北京中杉金橋生物技術有限公司的Mounting Medium。
[0071] 3、檢測結果 結果如附圖6和附圖7所示，可在胚胎中清晰辨別出pTGCs，妊娠第7. 5~8. 5天的小鼠 胚胎pTGCs可被ρΙΙΟδ特異標識。胚胎發育早期時PTGC為ρΙΙΟδ強陽性表達。
[0072] 經過以上兩個實施例的驗證，我們可以知道，ρ110 δ確實特異性地在早期pTGC中 表達，可以作為早期PTGC的特異性標記物。但是本發明對所涉及的實驗檢測方法并不做嚴 格限制，不僅僅限制于上述IHC或IF。
【權利要求】
1. pllO δ在特異性標記滋養層巨細胞中的應用。
2. 根據權利要求1所述應用，其特征在于，所述應用是指ρΙΙΟ δ在制備滋養層巨細胞 的特異性標記物中的應用。
3. 根據權利要求1所述應用，其特征在于，所述ρΙΙΟδ為Ρ110δ的片段，該片段的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
4. ρ110δ抗體作為滋養層巨細胞的特異性標記物的應用，其特征在于，所述ρΙΙΟδ抗 體是以ρΙΙΟδ為抗原獲得的抗體。
5. 根據權利要求4所述應用，其特征在于，所述所述ρΙΙΟδ抗體是以SEQ ID NO. 1所 示的P110S片段為抗原獲得。
6. 根據權利要求4所述應用，其特征在于，所述應用的方法為：以ρΙΙΟδ抗體作為檢 測標記物，利用免疫組化、免疫熒光或PCR的方法，對滋養層巨細胞進行特異性標記。
7. 根據權利要求Γ6所述應用，其特征在于，所述滋養層巨細胞是早期的滋養層巨細 胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK104155440SQ201410336883
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】王麗京, 胡曦文, 李江超, 楊雪松, 章倩倩 申請人:廣東藥學院