鑒定和區分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的pcr-rflp檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定和區分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒。該試劑盒包含如SEQ?ID?NO.1和2所示的Em和Es通用引物、限制性內切酶EcoR?Ⅰ和/或Ssp?Ⅰ；還包含PCR試劑和多房棘球蚴和石渠棘球蚴DNA模板標準物。通過提取待檢測樣品單個包囊的DNA作為模板，再使用通用引物進行PCR擴增，PCR產物純化后再使用EcoR?Ⅰ或Ssp?Ⅰ內切酶酶切，對酶切產物進行電泳即可達到鑒定和區分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的目的。本發明省去了測序造成的耗時、耗錢和數據處理的繁瑣過程，且不需要復雜的操作系統，可以快速、方便、經濟的區分鑒定野生嚙齒動物感染多房棘球蚴還是感染石渠棘球蚴。
【專利說明】鑒定和區分多房棘球蚴和石渠棘球蚴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及寄生蟲的檢測，特別涉及一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis, Em)幼蟲與石渠棘球絳蟲(Echinococcus shiquicus, Es)幼蟲均可寄生于哨齒動物體(如高原鼠兔、青海田鼠等)內，且兩者包囊外形極其相似，長時間內均被認為是多房棘球絳蟲的幼蟲，直至在藏狐(Vuipes ferrilata)腸道內發現了石渠棘球絳蟲成蟲,才明確地將石渠棘球絳蟲與多房棘球絳蟲區分開來，進而確定石渠棘球絳蟲為棘球屬的一個新種。多房棘球絳蟲成蟲的蟲卵感染人和多種嚙齒動物，引起多房棘球蝴病，人的多房棘球蝴病危害嚴重，病死率極高，又稱“蟲癌”，嚴重威脅我國西部廣大牧民的生命與健康。石渠棘球絳蟲的幼蟲主要感染嚙齒動物，目前尚無人感染病例的報道。對嚙齒動物棘球絳蟲幼蟲感染的調查可以作為某一地區棘球蝴病流行情況的指標之一。因此，建立一種快速、經濟的方法區分該兩種棘球蝴的檢測試劑盒對開展棘球蝴病流行病學調查，預防和控制棘球蝴病的流行具有重要的意義。
[0003]目前鑒定區分兩個物種主要依靠其遺傳物質間的差異，這種方法涉及到測序，在沒有測序儀的基層單位，則顯得相對耗時、耗錢，同時由于序列處理、比對等涉及到相關的生物信息學工具，對大批量調查時則會造成數據處理繁瑣或易出錯等情況。
[0004]隨著多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的線粒體全基因的測序工作的相繼完成，在比對其線粒體全基因組序列后，發現存在兩段DNA序列上同一內切酶位點的個數和分布不同，這為利用內切酶對兩種棘球絳蟲線粒體基因組上同一、長度一致的片段進行切割產生條帶大小和個數不同提供了可行性，依據電泳圖便可直觀的將該兩種棘球絳蟲區分。此方法比測序具有快速、簡便和耗錢少的優點，不需要測序所需的PCR儀，該方法只需要恒溫水浴鍋和兩種內切酶即可完成，其中膠回收試劑盒可有可無。到目前為止，尚無應用此方法區分野生嚙齒動物感染多房棘球蝴和石渠棘球蝴的文獻報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種快速、簡便地鑒定和區分野生嚙齒動物多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法及檢測試劑盒。
[0006]本發明的目的通過下述技術方法實現:
[0007]一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法，PCR擴增的引物為Em和Es通用引物，限制性內切酶為EcoR I和/或Ssp I。所述的Em和Es通用引物為:
[0008]F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3’，
[0009]R:5’ -TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3’ ；
[0010]其中，W= A/T，R = A/G。
[0011]利用通用引物擴增出的Em DNA序列片段長度為1417bp，Es DNA序列片段長度為1426bp。
[0012]EcoR I和Ssp I酶切位點在Em和Es片段中的位置分別如圖1和圖2所示。使用通用引物擴增的Em DNA片段在261和757bp處有Ssp I酶切位點；擴增的Es DNA片段在254bp處有EcoR I酶切位點，在1175bp處有Ssp I酶切位點。
[0013]一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，包含上述通用引物、EcoR I和/或Ssp I ο
[0014]優選的，所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，還包含用于DNA擴增的PCR試劑。
[0015]更優選的，所述的試劑盒還包含多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標準物。
[0016]所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒的制備方法優選如下:
[0017](I)通用引物的設計與酶切位點的選擇
[0018]根據NCBI中提交的已完成的多房棘球絳蟲(登錄號:AB018440)和石渠棘球絳蟲(登錄號:AB208064)線粒體基因組序列，利用DNAMAN軟件分別找出兩個線粒體DNA中含有的酶切位點及其所在的位置，再結合ClustalW軟件進行比對的結果，找出兩個物種線粒體DNA上同時或某一個具備某一限制性內切酶位點的一段DNA序列，參考TaKaRa公司限制性內切酶產品目錄及報價信息，最終確定了多房棘球絳蟲線粒體基因組上位置為7123-8539和石渠棘球絳蟲線粒體基因組上位置為7160-8585的兩段序列作為鑒定的參考序列，設計上下游兼并引物，選擇兩種限制性內切酶EcoR I和Ssp I用于相互驗證酶切結果。
[0019](2) DNA聚合酶及限制性內切酶的選擇
[0020]本著經濟、簡便、高效與準確的原則，DNA聚合酶采用TransGen(北京)公司的2X EmyTaqn PCR SuperMix,該產品包括Easy7?/+ DNA聚合酶、dNTPs和優化的反應緩沖液，濃度為2X ;EcoR I內切酶為TaKaRa(大連)公司所生產，包括EcoR I內切酶(10000U)和1XEcoR I Buffer ；Ssp I內切酶為TaKaRa(大連)公司所生產，包括SspI 內切酶(500U)和 1XSsp I Buffer0[0021 ] (3)多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標準物的制備
[0022]野外采集的嚙齒動物肺臟包囊或肝臟包囊，用鑷子把單個的包囊分離出來，然后根據組織DNA提取試劑盒說明書提取單個包囊的DNA，分別擴增其線粒體基因組上的coxl基因片段，送測序公司測序后，根據已提交的兩種棘球絳蟲的coxl基因比對后，確定其蟲種，而相應的單個包囊的DNA或者用重組目的基因質粒DNA作為DNA模板標準物。
[0023]所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒的使用方法包括如下步驟:
[0024](I)提取待檢測樣品單個包囊的DNA。
[0025](2)以提取的DNA為模板，使用PCR試劑按如下條件進行PCR擴增:94°C 4min ；94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，35 個循環；72°C 1min0
[0026](3)對PCR產物進行純化。
[0027](4)再使用EcoR I或Ssp I內切酶酶切純化的PCR產物。
[0028](5)對酶切產物進行電泳鑒定。
[0029]使用本發明試劑盒和方法可以快速、方便、經濟的區分鑒定野生嚙齒動物感染多房棘球蝴還是感染石渠棘球蝴，省去了測序造成的耗時、耗錢和數據處理的繁瑣過程，同時不需要復雜的操作系統，在普通的實驗室就可進行，因此存在潛在的實驗研究和極具潛力的臨床應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是EcoR I酶切位點在Em和Es片段中的位置示意圖。
[0031]圖2是Ssp I酶切位點在Em和Es片段中的位置示意圖。
[0032]圖3是實施例2DNA模板標準物PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA標準分子DL2000，EM:Em DNA模板標準物；ES:Es DNA模板標準物。
[0033]圖4是實施例2DNA模板標準物PCR擴增產物酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M =DNA標準分子DL2000 ;左圖為EcoR I內切酶酶切結果，1:未酶切的Em DNA模板標準物，2:經酶切后的Em DNA模板標準物，3:未酶切的EsDNA模板標準物，4:經酶切后的EsDNA模板標準物；右圖為Ssp I內切酶酶切結果，1:未酶切的Em DNA模板標準物，2:經酶切后的Em DNA模板標準物，3:未酶切的Es DNA模板標準物，4:經酶切后的Es DNA模板標準物。
[0034]圖5是實施例3臨床樣品PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M =DNA標準分子DL2000 ; 1-3分別為多房棘球絳蟲達日縣株、玉樹株和久治縣株；4-9:石渠棘球絳蟲久治縣株、達日縣株(5個)。
[0035]圖6是實施例3臨床樣品PCR擴增產物酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA標準分子DL2000 ;左圖為EcoR I內切酶酶切結果，1:未酶切的Em DNA模板標準物，2-4:多房棘球絳蟲達日縣株、玉樹株和久治縣株酶切結果，5:未酶切的Es DNA模板標準物，6-11:石渠棘球絳蟲久治縣株和達日縣株(5個)酶切結果；右圖為Ssp I內切酶酶切結果，1:未酶切的Em DNA模板標準物，2-4:多房棘球絳蟲達日縣株、玉樹株和久治縣株酶切結果，5:未酶切的Es DNA模板標準物，6-11:石渠棘球絳蟲久治縣株和達日縣株(5個基因型)酶切結果。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述。應理解，下面的實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0037]實施例1
[0038]一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，包含:TransGen (北京)公司的 2 X EasyTai廣.PCR SuperMix^TaKaRa (大連)公司 EcoR I 和 Ssp
I內切酶、通用引物以及多房棘球蝴和石渠棘球蝴的DNA模板標準物。
[0039]通用引物的序列為:
[0040]F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3，，
[0041]R:5’ -TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3，，
[0042]其中，W= A/T, R = A/Go
[0043]實施例2對DNA模板標準物進行鑒定
[0044](I)DNA模板標準物PCR擴增
[0045]用實施例1中的試劑盒中提供的PCR試劑、通用引物、兩種棘球絳蟲的DNA模板標準物，分別做PCR擴增。為驗證野外條件下可能存在多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲混合感染的情況，另增加一個標準模板各半的PCR反應。PCR反應體系如下:
[0046]
【權利要求】
1.一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP方法，其特征在于:PCR擴增的引物為Em和Es通用引物，限制性內切酶為EcoR I和/或Ssp I ;所述的Em和Es通用引物為:
F:5’ -TAA GffT RAG TGT GTG TGT TGG T-3’，
R:5，-TAA RCA AAC CTC TCA ACG AGA C-3，， 其中，W = A/T, R = A/Go
2.一種鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，其特征在于:包含權利要求1所述的Em和Es通用引物、EcoR I和/或Ssp I。
3.根據權利要求2所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，其特征在于:包含PCR試劑。
4.根據權利要求2或3所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒，其特征在于:包含多房棘球蝴和石渠棘球蝴DNA模板標準物。
5.權利要求2所述的鑒定和區分多房棘球蝴和石渠棘球蝴感染的PCR-RFLP檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提取待檢測樣品單個包囊的DNA； (2)以提取的DNA為模板，使用PCR試劑按如下條件進行PCR擴增:94V 4min ；94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，35 個循環；72°C 1min ； (3)對PCR產物進行純化； (4)再使用EcoRI或Ssp I內切酶酶切純化的PCR產物； (5)對酶切產物進行電泳鑒定。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164512SQ201410426254
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月26日 優先權日:2014年8月26日
【發明者】賈萬忠, 范彥雷, 婁忠子, 李立, 閆鴻斌, 蔡進忠, 史萬貴, 李建秋, 劉聰暖, 楊玉榮, 唐納德·麥克麥納斯 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所