卵巢組織凍融后早期體外培養液及培養方法
【專利摘要】本發明涉及生殖醫學領域，具體而言，涉及卵巢組織凍融后早期體外培養液及培養方法。該卵巢組織凍融后早期體外培養液，包括：用于將凍融后的卵巢組織預處理的第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液。第一培養液是一種膠原酶溶液，凍融后的卵巢組織通過其處理之后，用膠原酶對膠原等組織的酶解作用，溶解部分膠原蛋白，使致密的卵巢組織間質疏松，有利于后續長期培養中第二培養液滲透，使第二培養液與同組織中不同位置細胞(尤其中央位置細胞)充分接觸，有利于其充分吸收營養成分和排出代謝廢物，從而更好的體外生長發育。
【專利說明】卵巢組織凍融后早期體外培養液及培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生殖醫學領域，具體而言，涉及卵巢組織凍融后早期體外培養液及培 養方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，女性生育力保護和保存已成為生殖醫學領域亟需解決的重大課題。而在 女性生育力保存技術中，卵巢組織超低溫保存是最有潛力和最受關注的技術。具體的，先將 人卵巢組織進行超低溫保存；使用時對其進行解凍復蘇，凍融后人卵巢組織的應用技術主 要包括卵巢組織自體移植技術和卵巢組織體外培養技術。卵巢冷凍保存技術主要適用人群 為年輕惡性腫瘤存活者，因而自體移植技術可能因卵巢組織自體移植使腫瘤細胞傳播或再 種植。由于對自體移植技術安全性擔憂，使卵巢組織體外培養成為最有潛力的凍融后人卵 巢組織臨床應用技術，目前正逐漸成為生殖醫學研究的新熱點。
[0003] 研究者一直致力于卵巢組織體外培養體系的改進和創新。目前，人卵巢組織體外 培養采用多階段序貫培養，其中早期階段采用原位培養---始基卵泡不從間質組織中分離 出來的原位培養方式。離體的卵巢組織或卵泡沒有血供，其營養主要由培養液提供，所以培 養液的選擇對卵巢組織及卵泡的生長至關重要。
[0004] 但是，由于人卵巢組織結構致密，間質中含有豐富膠原，培養液滲透到卵巢組織的 中心非常困難，使得卵巢組織中心部位細胞（包括始基卵泡）不能充分吸收營養成分，妨礙 了整個卵巢組織在體外的生長發育。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種卵巢組織凍融后早期體外培養液，以解決凍融后的卵 巢組織在體外早期培養過程中，其中心部位不能充分吸收營養成分的技術問題。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種利用上述培養液來體外培養凍融后卵巢組織 的方法。
[0007] 在本發明的實施例中提供了卵巢組織凍融后早期體外培養液，用于將凍融后的卵 巢組織預處理的第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；其中，在所 述第一培養液中，按照體積份數計，包括：〇. 8-1. 2份膠原酶和8. 8-9. 2份含有10%胎牛血 清的L-15培養液；所述第二培養液以a -MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積 份數為8-12%人白蛋白、體積份數為0. 8-1. 2%的ITS，含量為0. 2-0. 4IU/ml的人卵泡刺 激素、45-55 y g/ml的維生素C、0. 4-0. 5mmol/L的丙酮酸、I. 5-2. 5mmol/L的L 一谷氨酰胺、 70-80IU/ml的青霉素和70-80ii g/ml鏈霉素。
[0008] 本發明提供的這種卵巢組織凍融后早期體外培養液，其包括用于將凍融后的卵巢 組織預處理的第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；第一培養液是 一種膠原酶溶液，凍融后的卵巢組織通過其處理之后，用膠原酶對膠原等組織的酶解作用， 溶解部分膠原蛋白，使致密的卵巢組織間質疏松，有利于后續長期培養中第二培養液滲透， 使第二培養液與同組織中不同位置細胞（尤其中央位置細胞）充分接觸，有利于其充分吸 收營養成分和排出代謝廢物，從而更好的體外生長發育。
[0009] 另外，本發明提供的第二培養液，其以a -MEM為基礎培養液，且還包括體積份 數為8-12 %人白蛋白、體積份數為0.8-1. 2 %的ITS，含量為02-0. 4IU/ml(體積份數 為0. 27-0. 54% )的人卵泡刺激素、45-55iig/ml的維生素C、0. 4-0. 5mmol/L的丙酮酸、 L 5-2. 5mmol/L 的 L 一谷氨酰胺、70-80IU/ml 的青霉素、70-80 ii g/ml 鏈霉素和 8-12mmol/L 的亮氨酸；既定濃度的各種有效因子可以保證預處理后的卵巢組織能夠充分的吸收營養， 為其體外產生長以及產生卵泡做好準備。更為重要的是，在第二培養液中，含有既定濃度的 亮氨酸，由于亮氨酸是mTOR的激動劑，添加了亮氨酸的第二培養液能激活始基卵泡中mTOR 的表達，從而解除對始基卵泡啟動的抑制，使卵巢組織中多個始基卵泡同時獲得激活，能夠 有多個卵泡同時發育，最大程度利用了卵巢組織中的卵泡儲備，減少生育力儲備的浪費。
[0010] 一種根據上述培養液體外培養凍融后卵巢組織的方法，包括以下步驟：
[0011] 將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預處理 后卵巢組織；
[0012] 將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，在繼續培養，隔天更換 一次新鮮的第二培養液。
[0013] 可選的，在所述步驟將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱 下培養，得到預處理后卵巢組織中，具體包括：
[0014] 將凍融后的卵巢組織在無菌超凈工作臺上切成體積為1-1. 2_3的塊狀；
[0015] 將塊狀的所述卵巢組織放入含有10 %胎牛血清的L-15培養液后，在溫度為 35-37°C、CO2體積含量為4-5%的培養箱中孵育8-10分鐘，得到孵育后的卵巢組織小塊；
[0016] 將所述孵育后的卵巢組織小塊加入到第一培養液中，在35_37°C培養箱下培養，得 到預處理后的卵巢組織。
[0017] 可選的，在所述將塊狀的所述卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下 培養，得到預處理后的卵巢組織的步驟中：
[0018] 所述培養的時間為25-30分鐘。
[0019] 可選的，在所述將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培 養，隔天更換一次新鮮的第二培養液的步驟中；
[0020] 所述培養皿為4孔或24孔培養皿。
[0021] 可選的，在所述步驟將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35_37°C培養箱 下培養，得到預處理后的卵巢組織之后，在所述步驟將預處理后卵巢組織加入到含有第二 培養液的培養皿中，繼續培養，隔天更換一次新鮮的第二培養液之前，還包括：
[0022] 將培養皿的內部包被有由瓊脂糖或海藻酸鈉珠作為細胞外基質的三維支架。
[0023] 可選的，在所述將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培 養，隔天更換一次新鮮的第二培養液的步驟中，所述將預處理后卵巢組織加入到含有第二 培養液的培養皿具體包括：
[0024] 在培養皿的每個孔中預先加入700-850微升第二培養液，再加入3-4塊呈塊狀的 預處理后卵巢組織。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發明【具體實施方式】或現有技術中的技術方案，下面將對具體 實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前 提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
[0026] 圖1為本發明實施例四提供的卵巢組織凍融后早期體外培養液流程圖。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行 清楚、完整的描述，基于本發明中的【具體實施方式】，本領域普通技術人員在沒有做出創造性 勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發明所保護的范圍。
[0028] 本發明提供的這種卵巢組織凍融后早期體外培養液，用于將凍融后的卵巢組織 預處理的第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；其中，在所述第 一培養液中，按照體積份數計，包括：〇. 8-1. 2份膠原酶和8. 8-9. 2份含有10 %胎牛血清 的L-15培養液；所述第二培養液以a -MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積 份數為8-12 %人白蛋白、體積份數為0. 8-1. 2%的ITS，含量為02-0. 4IU/ml (體積份數 為0. 27-0. 54% )的人卵泡刺激素、45-55iig/ml的維生素C、0. 4-0. 5mmol/L的丙酮酸、 L 5-2. 5mmol/L 的 L 一谷氨酰胺、70-80IU/ml 的青霉素、70-80 ii g/ml 鏈霉素和 8-12mmol/ L的亮氨酸。需要指出的是，ITS(胰島素-轉鐵蛋白-硒鈉）是胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸 鈉的混合制劑，具有提高卵巢組織發育率的作用。在本發明中，優選的，1 % ITS含10 y g/ml 胰島素、5.511§/1111轉鐵蛋白和6.7叩/1111亞硒酸鈉。含10(%胎牛血清的1-15培養液 ；其是 指在L-15培養基中，加入胎牛血清，使其體積含量達到10% ;而L-15培養基是細胞生物學 領域常用的一種培養基，在此不做贅述。
[0029] 接下來，本發明是結合上述內容，舉出了第一培養液和第二培養液的具體實施例， 請參考以下內容：
[0030] 實施例一
[0031] 本實施例的卵巢組織凍融后早期培養液包括：用于將凍融后的卵巢組織預處理的 第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；其中，在所述第一培養液中， 按照體積份數計，包括：〇. 8份膠原酶和9. 2份含有10%胎牛血清的L-15培養液；所述第 二培養液以a -MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積份數為8%人白蛋白、體 積份數為0. 8%的ITS，含量為0. 2IU/ml的人卵泡刺激素、45ii g/ml的維生素C、0. 4mmol/ L的丙酮酸、I. 5mmol/L的L 一谷氨酰胺、70IU/ml的青霉素、70 ii g/ml鏈霉素和8mmol/L的 亮氨酸。
[0032] 實施例二
[0033] 本實施例的卵巢組織凍融后早期培養液包括：用于將凍融后的卵巢組織預處理的 第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；其中，在所述第一培養液中， 按照體積份數計，包括：1份膠原酶和9份含有10 %胎牛血清的L-15培養液；所述第二培養 液以a -MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積份數為10%人白蛋白、體積份數 為1%的ITS，含量為0. 3IU/ml的人卵泡刺激素、50ii g/ml的維生素C、0. 47mmol/L的丙酮 酸、2mmol/L的L 一谷氨酰胺、75IU/ml的青霉素、75ii g/ml鏈霉素和lOmmol/L的亮氨酸。
[0034] 實施例三
[0035] 本實施例的卵巢組織凍融后早期培養液包括：用于將凍融后的卵巢組織預處理的 第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的第二培養液；其中，在所述第一培養液中， 按照體積份數計，包括：1. 2份膠原酶和8. 8份含有10%胎牛血清的L-15培養液；所述第 二培養液以a-MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積份數為12%人白蛋白、體 積份數為1.2%的ITS，含量為0.4IU/ml的人卵泡刺激素、55iig/ml的維生素C、0. 5mmol/L 的丙酮酸、2. 5mmol/L的L 一谷氨酰胺、80IU/ml的青霉素、80ii g/ml鏈霉素和12mmol/L的 亮氨酸。
[0036] 為了使得本發明上述實施例的卵巢組織凍融后早期體外培養液得到更好的應用， 更加有效應用到醫學領域中，本發明還在上述實施例的基礎之上提供了實施例四，實施例 四給出了利用上述實施例的卵巢組織凍融后早期體外培養液培養凍融后卵巢組織的方法， 現做詳細的闡述和解釋，請參考圖1 :
[0037] 實施例四
[0038] 請參考圖1，在本實施例中，卵巢組織凍融后早期體外培養液的制備方法包括以下 步驟：
[0039] 步驟101 :將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35_37°C培養箱下培養， 得到預處理后卵巢組織；
[0040] 在該步驟中，由于凍融后的卵巢組織，為了使其能夠充分恢復活性，優選的，在進 行預處理之前需要對其進行孵育操作，具體的，在本實施例中，為了實現較好的孵育效果， 其操作可以按照以下步驟進行：
[0041] Sl :將凍融后的卵巢組織在無菌超凈工作臺上切成體積為1-1. 2_3的塊狀；
[0042] 將凍融后卵巢組織裁剪成體積為1-1. 2mm3的塊狀組織，使后續培養組織塊體積更 小，有利于后續培養的過程中，營養液更容易滲入，使得組織細胞能夠更加充分的吸收營養 液。
[0043] S2 :將塊狀的所述卵巢組織放入含有10%胎牛血清的L-15培養液后，在溫度為 35-37°C、CO2體積含量為4-5%的培養箱中孵育8-10分鐘，得到孵育后的卵巢組織小塊；
[0044] 在培養箱中，將溫度設定在35_37°C、CO2體積含量為4-5%，進而為卵巢組織提 供適宜的體外生長條件，可保證其健康生長；另外，在孵育的過程中，培養時間優選控制在 8-10分鐘。
[0045] S3 :將所述孵育后的卵巢組織小塊加入到第一培養液中，在35_37°C培養箱下培 養，得到預處理后的卵巢組織。
[0046] 具體的，在利用第一培養液酶解的過程中，為了不至于酶解過度造成損傷，且還能 使卵巢組織達到適宜疏松度的，優選的，培養的時間為25-30分鐘。
[0047] 步驟102 :將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培養，隔 天更換一次新鮮的第二培養液；
[0048] 在步驟102中，在長期培養的過程中優選使用4孔或24孔培養皿；并且還利用 35-37°C培養箱進行培養。另外，在長期培養的過程中，為了實現更好的培養效果，使得細胞 能夠正常擴增，優選的，在步驟101和步驟102之間還包括：將培養皿的內部包被有由瓊脂 糖或海藻酸鈉株作為細胞外基質的三維支架，使用細胞外基質作為培養支架，可以使卵巢 組織塊更好地貼壁生長，有利于間質組織向外生長以及營養物質的充分交換。。
[0049] 另外，在培養的過程中，優選的，在培養皿的每個孔中預先加入700-850微升第二 培養液后，再加入3-4塊呈塊狀的預處理后卵巢組織，該操作可以使得所有的塊狀卵巢組 織能夠被完全浸沒，進而使得卵巢組織的各個部位的細胞能夠充分的吸收營養，為其提供 維持生長所需足夠的營養物質。另外，該實施例的方法中所用的培養液均為實施例二中所 舉出的培養液。
[0050] 表1本發明的卵巢組織凍融后早期體外培養系統與現有技術對比1
[0051]
【權利要求】
1. 一種卵巢組織凍融后早期體外培養液，其特征在于，包括： 用于將凍融后的卵巢組織預處理的第一培養液和將預處理后的卵巢組織長期培養的 第二培養液； 其中，在所述第一培養液中，按照體積份數計，包括：〇. 8-1. 2份膠原酶和8. 8-9. 2份含 有10%胎牛血清的L-15培養液； 所述第二培養液以α-MEM為基礎培養液，且所述第二培養液中包括體積份數為 8-12%人白蛋白、體積份數為0. 8-1. 2%的ITS，含量為0. 2-0. 4IU/ml的人卵泡刺激素、 45-55 μ g/ml 的維生素 C、0. 4-0. 5mmol/L 的丙酮酸、1. 5-2. 5mmol/L 的 L 一谷氨酰胺、 70-80幾/1111的青霉素、70-8(^8/1111鏈霉素和8-12臟〇1/1的亮氨酸。
2. -種根據權利要求1的培養液體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，包括 以下步驟： 將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預處理后卵 巢組織； 將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培養，隔天更換一次新 鮮的第二培養液。
3. 根據權利要求2所述的體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，在所述步驟 將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預處理后卵巢組 織中，具體包括： 將凍融后的卵巢組織在無菌超凈工作臺上切成體積為1-1. 2mm3的塊狀； 將塊狀的所述卵巢組織放入含有1〇%胎牛血清的1-15培養液后，在溫度為35-371：、 C〇2體積含量為4-5%的培養箱中孵育8-10分鐘，得到孵育后的卵巢組織小塊； 將所述孵育后的卵巢組織小塊加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預 處理后的卵巢組織。
4. 根據權利要求3所述的體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，在所述將塊 狀的所述卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預處理后的卵巢組 織的步驟中： 所述培養的時間為25-30分鐘。
5. 根據權利要求4所述的體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，在所述將預 處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培養，隔天更換一次新鮮的第二 培養液的步驟中； 所述培養皿為4孔或24孔培養皿。
6. 根據權利要求5所述的體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，在所述步驟 將凍融后的卵巢組織加入到第一培養液中，在35-37°C培養箱下培養，得到預處理后的卵巢 組織之后，在所述步驟將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培養， 隔天更換一次新鮮的第二培養液之前，還包括： 將培養皿的內部包被有由瓊脂糖或海藻酸鈉珠作為細胞外基質的三維支架。
7. 根據權利要求6所述的體外培養凍融后卵巢組織的方法，其特征在于，在所述將預 處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿中，繼續培養，隔天更換一次新鮮的第二 培養液的步驟中，所述將預處理后卵巢組織加入到含有第二培養液的培養皿具體包括： 在培養皿的每個孔中預先加入700-850微升第二培養液，再加入3-4塊呈塊狀的預處 理后卵巢組織。
【文檔編號】C12N5/075GK104293733SQ201410488056
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】肖準 申請人:四川大學華西第二醫院