轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用，包括3對短肽，3對短肽分別為第一對短肽、第二對短肽和第三對短肽，第一對短肽識別SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的DNA序列，第二對短肽識別SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的DNA序列，第三對短肽識別SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的DNA序列。本發明利用這3對短肽構建獲得的轉錄激活子樣效應因子，能夠分別特異識別人miRNAs：miR-133b、miR-141和miR-488基因種子序列附近的二段相鄰核苷酸；利用這3對轉錄激活子樣效應因子構建獲得的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，能夠對人miRNAs：miR-133b,miR-141和miR-488基因進行準確、高效地打靶。
【專利說明】轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體為轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與 應用，尤其為應用于人類miRNAs基因的敲除。
【背景技術】
[0002] 基因組祀向修飾是近年來生命科學研究的熱點之一，特別是在基因治療人類疾病 方面，基因組祀向修飾具有廣闊的應用前景。通過轉基因或者基因敲除等操作改變基因的 遺傳組成，獲得滿足各種需要的基因工程工具。傳統較常用的轉基因方法為質粒穩定轉染 法、反轉錄病毒攜帶法和同源重組法。但質粒轉染穩定篩選的插入位點隨機，且需要抗生素 維持，容易導致非正常的細胞表型；而反轉錄病毒攜帶目的基因的效率雖高，但是插入位點 不確定，影響其它內源基因的表達，限制了該方法的應用；另外，同源重組法雖然可W定點 插入，但是成功率很低(重組概率為！(T 6-I(T7)D
[0003] 目前，基因組工程學中的H大利器為；ZFN (Zinc Finger Nucleases)、TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)和 CRISPR/Cas9。
[0004] ZFN是指鋒指蛋白，是轉錄因子，每個模塊識別3-4個堿基序列，將該些模塊混合 搭配，可W祀定任何序列，然后，通過C末端的化k I核酸內切酶結構域可W切斷雙鏈DNA分 子。Sangamo生物科學公司和Sigma- Al化ich公司已經將ZFN技術商業化，推出CompoZr? ZFN平臺。但是，由于鋒指蛋白之間存在相互作用，鋒指模塊與DNA序列之間沒有一個簡單 的對應關系，所W W鋒指蛋白為基礎設計針對序列特異性DNA結合蛋白依然是個難題，并 且花費昂貴，經常要做大規模的篩選，構建過程長達幾周至數月。
[0005] CRISPR/tas9系統是由短的向導RNA介導，化s9核酸酶在特定的雙鏈DNA位點上 產生斷裂。CRISPR/Cas可通過添加多個向導RNA而實現多重編輯。然而，由于向導RNA序 列比ZFN或TALEN所祀定的序列短，致使脫祀效應高。但化urch最近發現，通過利用化s9 的一種突變形式(只切割單鏈DM)和兩個緊挨著的向導RNA，有可能大大提高系統的切割 位點保真性，降低脫祀效應。
[0006] TALEN技術是一種嶄新的分子生物學工具。TALEN是轉錄激活樣效應因子，來源 于黃單胞桿菌。利用TALEN蛋白的核酸結合結構域的氨基酸序列與核酸序列有恒定的對 應關系，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，再通過添加非特異內切酶化k I 結構域，TALEN蛋白在理論上可W祀向切割任意基因組DNA雙鏈。TALEN蛋白中DNA結 合域為高度保守的重復單元，每個重復單元含有34個氨基酸，除了第12和13位氨基酸 變化外，其它氨基酸都是相同的，該兩個可變氨基酸被稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基 (r巧eatvari油Ie di-resi化es, RVD),與堿基識別相關。TALEN識別DNA的機制在于每個 重復序列的RVD可W特異識別DNA的1個堿基，皿特異識別C堿基，NI識別A堿基，順識 別G堿基，NG識別T堿基。另外，通過對天然TALEN的研究發現，TALEN蛋白框架固定識別 1個T堿基，所W TALEN的識別序列總是W T堿基開始。
[0007] 在真核細胞內，TALEN切割的雙鏈DNA，可奶敷活兩條保守的DNA修復通路。非同源 末端連接修復（non-homologous end joining，畑EJ),細胞基本上磨平斷裂DNA的兩端，再 將其彼此拉近，將斷裂的染色體重新連接，該個過程往往產生移碼，或者在斷裂位點引進小 片段插入或刪除，影響基因功能或產生基因敲除效應。同源指導修復化omology-directed repair，皿R)是指利用相似序列的DNA供體模板，代替斷裂點周圍的DNA序列，從而實現特 定突變或導入外源DM序列的目的。在本發明專利中，采用攜帶同源模板的PMD18載體共 同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用PMD18載體提供的 同源序列，高效精確地對基因組進行編輯。
[0008] TALEN技術可W廣泛的應用于基因組編輯的各個方面；細胞水平的基因敲除，定 點突變，結構域缺失，定點整合等等，在疾病治療領域具有廣泛的應用前景。目前TALEN技 術主要的缺陷是效率相對較低，一般在5%-20%，無法直接獲取100%編輯的細胞，只能通過 挑選陽性的單克隆細胞，擴增成為穩定株。
[0009] miRNAs是一類進化上高度保守的非編碼單鏈RNA，長度通常在22nt左右。自1993 年，Lee,Feinbaum和Ambros等在線蟲體內發現了第一個miRNA (lin-4) W來,miRNAs的數 據與日俱增，miRNAs相關預測軟件也日益成熟。miRNAs由基因組DNA編碼，在RNA聚合酶 II的作用下轉錄成為pri-microRNAs，通過化osha和Dicer等一系列酶切之后形成成熟的 miRNAs,最終與多種蛋白共同形成miRNAs誘導的沉默復合體（miRNA-in化ced silencing complex，miRICS)主要結合于祀mRNA的3' -UTR區域，阻遏翻譯甚至直接降解mRNA，抑制基 因表達。目前，已經有超過2500余種人類miRNAs被發現。miRNAs參與多種生物學功能， 如調節細胞發育、分化、增殖、調亡等。一些miRNAs在癌癥發生發展中發揮作用，其中一些 miRNAs 抑制腫瘤發生，稱為 tumor suppressor miRNAs (TSmiRs);另一些 miRNAs 促進腫瘤 發生，則稱為oncogenic miRNAs,即oncomiRs。目前，針對miRNAs的基因操作主要分為兩 種；1.化學合成的反義寡核巧酸，其序列與成熟miRNAs序列互補，通過抑制miRNAs而發揮 作用；2.與天然miRNAs序列相同的小分子，可增強miRNAs的作用，此方法的作用機制類似 于RNA干擾，不同的是，天然miRNAs因為其序列來源于細胞基因組，體內存在miRNAs表達 調控機制，故較RNAi脫祀效應小，免疫反應輕。但是，由于此兩種miRNAs的基因操作均不 能在基因組水平改造miRNAs,故其起效時間持續短、療效不穩定、效果不確定。2014年，美 國加利福尼亞州立大學的Claudia研究組針對人類miR-21基因在細胞系肥K-293中成功 實現了雙敲除。現階段，涉及人類miRNAs基因敲除的問題主要有；1. miRNAs編碼序列僅 300核巧酸左右，比較難找到高效的TALEN打祀序列；2. miRNAs的拷貝數可能不止一個，同 家族成員也為多個，故有效的雙敲除和多敲除是關鍵問題；3. miRNAs多協同發揮作用，敲 除單個miRNAs基因的治療作用有待考察。本發明對人類miRNAs ;miR-133b, miR-141和 miR-488基因進行敲除，采用新興的TALEN技術，針對位點為miR-133b, miR-141和miR-488 的種子序列，W達到有效去除miRNAs的作用。
【發明內容】
[0010] 針對現有技術的上述技術問題，本發明的目的是提供一種轉錄激活子樣效應因 子核酸酶及其編碼基因與應用。本發明提供了 3對短膚，利用該3對短膚構建獲得的轉錄 激活子樣效應因子，能夠分別特異識別人miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因種子 序列附近的二段相鄰核巧酸；利用該3對轉錄激活子樣效應因子構建獲得的轉錄激活子樣 效應因子核酸酶，能夠對人miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因進行準確、高效地 打祀。
[0011] 為達到上述目的，本發明是通過W下技術方案實現的： 一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶，包括3對短膚，所述的3對短膚分別為第一對短 膚、第二對短膚和第H對短膚，所述第一對短膚識別SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA 序列，所述第二對短膚識別SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第H對短膚識 別 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 的 DNA 序列。
[0012] 所述的短膚由分別識別人類miR-133b、miR-141和miR-488基因上核巧酸序列中 相應堿基的TALE化識別模塊依序連接而成；識別堿基A的TALE化識別模塊為NI,識別堿 基T的TALE化識別模塊為NG，識別堿基C的TALE化識別模塊為皿，識別堿基G的TALE化 識別模塊為NK (見表2)。
[0013] 作為優選的，所述蛋白質包括第一對蛋白質、第二對蛋白質和第H對蛋白質，所述 第一對蛋白質由第一對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端 和C端組成，所述第二對蛋白質由第二對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸 序列框架的N端和C端組成，所述第H對蛋白質由第H對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣 效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成；所述的轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框 架的N端和C端均為天然的或經過人工改造的序列。
[0014] 所述第一對蛋白質、第二對蛋白質和第H對蛋白質可W分別特異性識別人類 miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核巧酸序列，所述3對核巧酸序列分 別選自W下所示的核巧酸序列： (1) SEQ ID NO. 1序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 2序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列； (2) SEQ ID NO. 3序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 4序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列； (3) SEQ ID NO. 5序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 6序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列。
[0015] 作為優選的，所述融合蛋白包括第一對融合蛋白、第二對融合蛋白和第H對融合 蛋白，所述第一對融合蛋白由第一對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第 二對融合蛋白由第二對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第H對融合蛋白 由第H對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成；所述的DNA切割蛋白為天然的或經 過人工改造的化k I DNA內切酶。
[0016] 一種重組載體，所述重組載體的編碼包含一對短膚或蛋白質中的任意一條的載 體。
[0017] 作為優選的，將能夠特異性識別SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6堿基序列的多 核巧酸連接到載體祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (R)-pA或載體祀Fla-化S-TALEN bac化one-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，構建獲得包含編碼轉錄激活子樣效應因子核酸酶基 因的質粒載體，能表達轉錄激活子樣效應因子核酸酶。
[0018] 一種宿主細胞，所述宿主細胞為人離體細胞，所述的人離體細胞為人RWPE-I細 胞，且宿主細胞含有重組載體。
[0019] -種重組載體在對人miR-133b、miR-141和miR-488基因碑!向修飾中的應用。
[0020] -種人類miRNAs基因打祀的方法，將重組載體轉入人離體細胞，于37C擴增培養 1-4天，得到miRNAs基因被祀向修飾的細胞。
[0021] 作為優選的，所述人離體細胞中轉入有抗puro蛋白或能表達抗puro蛋白的質粒， 便于篩選。
[0022] 本發明分別針對人類miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因的3個位點設 計了H對轉錄激活子樣效應因子核酸酶，該3對TALE化分別由可W識別miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上3段核巧酸的DNA識別結構域與化k I DNA內切酶的兩個異源 亞基融合得到。將該3對轉錄激活子樣效應因子核酸酶成對轉入宿主細胞時，其能對宿主 細胞miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因的位點打祀，并使打祀位點發生基因突 變，包括堿基缺失、堿基插入等，從而實現對人類miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基 因的祀向修飾，具有特異性強、打祀效率高、準確度高等優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[002引 圖1為序列表； 圖2為人工設計的轉錄激活子樣效應因子核酸酶識別的DNA序列及位點； 圖 3 為載體祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl(R)-pA 示意圖； 圖 4 為載體祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (L)-IRES-PURO- pA 示意圖。
【具體實施方式】
[0024]為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述。該些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未 注明具體條件的實驗方法。通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第H版，J.薩姆布 魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。涉及的化學試劑盒、生物制品， 如未特殊說明，表明它們均為商品化產品。
[00巧]TALEN試劑盒購自上海斯丹賽生物技術有限公司。用于原代細胞/普通細胞/腫 瘤細胞基因打祀的專用TALEN載體包括10個，左右臂各5個，它們均含有CMV啟動子，化S， N端，C端，Fok I，嘿嶺霉素抗性基因(僅在左臂)等基本結構。載體間的不同之處在于TALEN 識別序列的最后一個堿基的不同，分為A/T/C/G四種，此外，包括一個帶有EGFP英光標記的 TALEN右臂。左右臂骨架的化k I序列不同，在TALEN作用時，化k I酶會形成一個異源二 聚體的結構，大大增加TALEN切割的效率。
[0026] 本發明的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，包括3對短膚，所述的3對短膚分別為第 一對短膚、第二對短膚和第H對短膚，所述第一對短膚識別SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 的DNA序列，所述第二對短膚識別SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第H對 短膚識別SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
[0027] 作為優選的，短膚由分別識別人類miR-133b、miR-141和miR-488基因上核巧酸 序列中相應堿基的TALE化識別模塊依序連接而成；識別堿基A的TALE化識別模塊為NI, 識別堿基T的TALE化識別模塊為NG，識別堿基C的TALE化識別模塊為皿，識別堿基G的 TALE化識別模塊為NK (見表2)。
[002引作為優選的，所述蛋白質包括第一對蛋白質、第二對蛋白質和第H對蛋白質，所述 第一對蛋白質由第一對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端 和C端組成，所述第二對蛋白質由第二對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸 序列框架的N端和C端組成，所述第H對蛋白質由第H對短膚兩端分別加上轉錄激活子樣 效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成；所述的轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框 架的N端和C端均為天然的或經過人工改造的序列。
[0029] 作為優選的，第一對蛋白質、第二對蛋白質和第H對蛋白質可W分別特異性識別 人類miRNAs ;miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核巧酸序列，所述3對核巧酸序 列分別選自W下所示的核巧酸序列： (1) SEQ ID NO. 1序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 2序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列； (2) SEQ ID NO. 3序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 4序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列； (3) SEQ ID NO. 5序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序 列；SEQ ID NO. 6序列或者該序列的一個或二個核巧酸經過取代所衍生的核巧酸序列。
[0030] 作為優選的，所述融合蛋白包括第一對融合蛋白、第二對融合蛋白和第H對融合 蛋白，所述第一對融合蛋白由第一對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第 二對融合蛋白由第二對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第H對融合蛋白 由第H對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成；所述的DNA切割蛋白為天然的或經 過人工改造的化k I DNA內切酶。
[0031] 本發明的重組載體的編碼包含一對短膚或蛋白質中的任意一條的載體。
[0032] 作為優選的，將能夠特異性識別SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6堿基序列的多 核巧酸連接到載體祀Fla-NLS-TALEN bac化one-Fokl (R)-pA或載體祀Fla-化S-TALEN bac化one-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，構建獲得包含編碼轉錄激活子樣效應因子核酸酶基 因的質粒載體，能表達轉錄激活子樣效應因子核酸酶。
[0033] 本發明的宿主細胞為人離體細胞，人離體細胞為人RW陽-1細胞，且宿主細胞含有 重組載體。
[0034] 本發明重組載體在對人miR-133b、miR-141和miR-488基因祀向修飾中的應用。
[0035] 本發明人類miRNAs基因打祀的方法，將重組載體轉入人離體細胞，于37C擴增培 養1-4天，得到miRNAs基因被祀向修飾的細胞。
[0036] 作為優選的，所述人離體細胞中轉入有抗puro蛋白或能表達抗puro蛋白的質粒， 便于篩選。
[0037] 實施例1 TALE化祀序列的設計 1. 從 miRBase 上下載人類 miRNAs ;miR-133b，miR-141 和 miR-488 基因 DNA 序列； 2. 設計TALE化識別序列卿序列）； 根據miRBase數據庫得到的序列，并依照W下原則確定TALE化識別序列： (1) 第0位堿基為T (識別序列第一位之前的堿基為第0位） (2) 最后一位堿基可W為AGCT，優選T (3) 識別序列長度在13-19之間 (4) 二個識別序列之間的間隔序列長度控制在14-21之間（12, 13也可，但效率可能較 低） 設計得到的祀序列位置如圖1所示，具體序列見表1。
[0038] 表 1
【權利要求】
1. 一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括3對短肽，所述的3對短肽分 別為第一對短肽、第二對短肽和第三對短肽，所述第一對短肽識別SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二對短肽識別SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述 第三對短肽識別SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
2. 如權利要求1所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分 別識別人類miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相應堿基的TALENs識別模 塊依序連接而成；識別堿基A的TALENs識別模塊為NI，識別堿基T的TALENs識別模塊為 NG，識別堿基C的TALENs識別模塊為HD，識別堿基G的TALENs識別模塊為NK。
3. 如權利要求1所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括第一對蛋白 質、第二對蛋白質和第三對蛋白質，所述第一對蛋白質由第一對短肽兩端分別加上轉錄激 活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第二對蛋白質由第二對短肽兩端 分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第三對蛋白質由 第三對短肽兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成；所述 的轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端均為天然的或經過人工改造的序 列。
4. 如權利要求3所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括第一對融合 蛋白、第二對融合蛋白和第三對融合蛋白，所述第一對融合蛋白由第一對蛋白質與DNA切 割蛋白的二個亞基融合而成，所述第二對融合蛋白由第二對蛋白質與DNA切割蛋白的二個 亞基融合而成，所述第三對融合蛋白由第三對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而 成；所述的DNA切割蛋白為天然的或經過人工改造的Fok I DNA內切酶。
5. -種如權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體的編碼包含一對短 肽或蛋白質中的任意一條的載體。
6. 如權利要求5所述的重組載體，其特征在于：將能夠特異性識別SEQ ID NO. 1-SEQ IDN0.6堿基序列的多核苷酸連接到載體pEFla-NLS-TALENbackbone-Fokl(R)-pA或載 體pEFla-NLS-TALEN backbone-Fokl (L) -IRES-PURO-pA上，構建獲得包含編碼轉錄激活子 樣效應因子核酸酶基因的質粒載體，能表達轉錄激活子樣效應因子核酸酶。
7. -種如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為人離體細胞，所述 的人離體細胞為人RWPE-1細胞，且宿主細胞含有重組載體。
8. -種如權利要求7所述的重組載體在對人miR-133b、miR-141和miR-488基因靶向 修飾中的應用。
9. 一種如權利要求8所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：將重組載體轉入 人離體細胞，于37°C擴增培養1-4天，得到miRNAs基因被靶向修飾的細胞。
10. 如權利要求9所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：所述人離體細胞中 轉入有抗puro蛋白或能表達抗puro蛋白的質粒，便于篩選。
【文檔編號】C12N15/85GK104357422SQ201410521124
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】宋春嬌, 茹國美, 張偉光, 楊萬雷 申請人:紹興市人民醫院