山羊脂聯素基因真核表達載體的構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種山羊脂聯素蛋白真核表達載體的構建和應用。所述的山羊脂聯素基因編碼區的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。將山羊脂聯素基因的完整編碼區片段經過雙酶切，連接到同樣經過雙酶切pEGFP-N1載體中，這樣可以構建山羊脂聯素蛋白真核表達載體。該真核表達載體構建方法簡單可行，可以高效的增強山羊脂聯素蛋白的表達，并且都包含綠色熒光蛋白，可以檢測山羊脂聯素蛋白真核細胞中的表達和定位。本發明提供的真核表達載體也可以應用于研究脂聯素蛋白在山羊脂肪沉積過程中的作用。
【專利說明】山羊脂聯素基因真核表達載體的構建和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種山羊脂聯素基因真核表達載體的構建方法及其在山羊脂肪沉積方面的應用。
【背景技術】
[0002]動物體內脂肪組織既是重要的儲能器官，又是重要的內分泌器官。脂肪組織能分泌多種脂肪因子，如脂聯素(Adiponectin, AdipoQ)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosisfactor α , TNF α )、瘦素(Leptin, LEP)> 白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、抵抗素(Resistin,RETN)等。AdipoQ在血液中有很高的濃度(5?30 μ g/mL),達到血衆總蛋白的
0.01%?0.05%。AdipoQ在多中生理功能中都起著重要的作用，能增強II型糖尿病患者的胰島素敏感性，用于治療II型糖尿病；調控糖脂代謝，抑制糖原的水解，促進血液中游離脂肪酸的氧化及葡糖糖的吸收；抑制粒細胞、單核巨噬細胞集落形成及巨噬細胞的吞噬活力，起到抗炎癥作用；抑制血管內膜增厚及平滑肌細胞增殖，起到抗動脈粥樣化作用等。AdipoQ通過血液循環到達全身各個器官，以不同形式與相應的受體結合，在整個機體中都起著重要作用。
[0003]研究發現在動物模擬試驗中改變脂聯素的含量或者用重組脂聯素體外處理細胞和肌肉都能調控葡萄糖和脂肪酸的代謝，其通過促進葡萄糖運載體4 (GLUT4)向細胞膜轉移來增加葡萄糖的吸收，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)及過氧化物酶體增殖激活受體(PPARα )通路來增加脂肪酸的吸收和氧化,但這中作用可由Leptin引起的AdipoRl/2水平降低而減弱AdipoQ能改善高糖誘發的胰島素抵抗，并且降低血清中的甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平，抑制脂蛋白酯酶活性及胰島素調控的葡萄糖產生[2]，另外發現AdipoRl和AdipoR2的表達量與胰島素敏感性呈正相關[3]。高血糖癥個體骨骼肌中AdipoRl的表達量降低50%，從而抑制了 gAd調控的葡萄糖轉運體4 (GLUT4)轉位，降低對葡糖糖、脂肪酸的吸收及氧化；但增強了全長型AdipoQ的糖、脂代謝功能[4]。
[0004]Wu等[5]利用地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤和胰島素聯合誘導劑處理綿羊SMSCs，結果表明SMSCs能沉積脂肪并分化為類脂肪細胞。Teboul等[6]研究發現脂肪酸能使C2C12細胞沉積脂肪并分化為類脂肪細胞，同時檢測到相關脂肪酸合成基因的表達量顯著升高。研究還發現高濃度葡萄糖能通過SREBP-1c通路調控肌管中脂肪酸的從頭合成，并在mRNA和蛋白水平均檢測到SREBP-lc、ACC和FAS等脂肪酸合成基因表達量有顯著性升高并分化為脂肪細胞等，表明SMSCs是具有多分化潛能的肌源性干細胞m。AdipoQ作為一種重要的脂肪因子，在肌肉中的糖脂代謝調節等發面起著重要作用。因此可以通過AdipoQ來調控肌肉中脂肪酸的合成，增加肌內脂肪含量，從而改善山羊肌肉品質。
[0005][I]Yamauchi Tj Kamon Jj Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptorsthat mediate antidiabetic metabolic effects [J].Nature, 2003，423(6941):762-769. [2]CombsTPj Pajvani UBj Berg AHj et al.A transgenic mouse with adelet1n in the collagenous domain of adiponectin displays elevated circulatingadiponectin and improved insulin sensitivity[J].Endocrinology, 2004，145(1):367-383.[3]CivitareseAEj Ukropcova B，Carling S，et al.Role of adiponectin inhuman skeletal muscle b1energetics[J].Cell metabolism, 2006，4(1): 75-87.[4]Fang X， Palanivel R， Zhou X， et al.Hyperglycemia- andhyperinsulinemia-1nduced alterat1n of adiponectin receptor express1n andadiponectin effects in L6 myoblasts [J].J Mol Endocrinol, 2005， 35(3):465-476.[5]Wu Hj Ren Y，Li S，et al.1n vitro culture and induced differentiat1nof sheep skeletal muscle satellite cells[J].Cell B1l Intj 2012，36(6):579-587.[6]Teboul Lj Gaillard D， Staccini L， et al.Thiazolidined1nes and fattyacids convert myogenic cells into adipose-like cells [J].J B1l Chemj 1995，270(47): 28183-28187.[7]Guillet-Deniau I， Pichard A-Lj Kone A， et al.Glucose induces de novolipogenesis in rat muscle satellite cells through a sterol-regulatory-element-binding-protein-lc-dependent pathway[J].J Cell Scij 2004， 117(10): 1937-1944。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種山羊脂聯素基因真核表達載體的構建方法及其在山羊脂肪沉積方面的應用。
[0007]本發明通過以下技術實現:根據pEGFP-Nl載體的多克隆位點和山羊脂聯素基因的編碼區序列，設計帶有保護性堿基、末端分別帶有Hind III和BamH I限制性內切酶酶切位點的引物，擴增產物包含山羊脂聯素基因的編碼區序列。將其構建入pEGFP-Nl載體的Hind III和BamH I兩個酶切位點之間。得到山羊脂聯素基因不同綠色熒光蛋白融合表達載體 pEGFP-Nl-AD。
[0008]本發明的效果是:利用一對引物進行PCR擴增可以克隆山羊脂聯素基因的完整編碼區，該真核表達載體構建方法簡單可行，可以高效的增強山羊脂聯素蛋白的表達，并且都包含綠色熒光蛋白，是研究山羊脂聯素蛋白功能的重要技術。
[0009]更詳細的技術方案請參見《【具體實施方式】》中的實施例。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]序列表SEQ ID NO:1是本發明克隆的山羊脂聯素基因的核苷酸序列。
[0011]圖1是山羊脂聯素基因的綠色熒光蛋白融合的真核表達載體pEGFP-Nl-AD的結構圖。
[0012]圖2是山羊脂聯素蛋白的綠色熒光蛋白融合表達載體pEGFP-Nl-AD通過瞬時轉染導入山羊骨骼肌衛星細胞后脂肪酸合成及成脂分化相關基因AdipoRl、C/EBP a和PPAR γ )表達量的變化。
[0013]【具體實施方式】:
實施例1:(一)山羊脂聯素基因編碼區序列的克隆
1.總RNA的提取
(I)將適量液氮倒入研缽中預冷，待溫度降低后將組織放入研缽中，再加適當液氮并將組織樣研磨成粉末狀，然后取粉末樣品100 mg于1.5 mL的EP管中，加入I mL預冷的Trizol試劑，震蕩混勻，室溫靜置5 min。
[0014](2)加入氯仿200 μ L，旋渦儀上振蕩15 sec混勻，室溫靜置5 min，然后在4°C條件下 12，000X g 離心 15 min。
[0015](3)將上層水相約500 μ L轉移至另一新1.5 mL的EP管，加入等體積的預冷異丙醇，輕輕顛倒數次混勻，置于室溫靜置10 min，然后在4°C條件下12，OOOXg離心10 min。
[0016](4)移除上清，加入4°C預冷的75 % DEPC酒精I mL，冰上靜置5 min，然后4°C條件下7，500 X g離心5 min ；
(5)移除上清，用移液槍吸取多余的液體，室溫干燥沉淀。
[0017](6)根據RNA的沉淀的量加入適量的DEPC水溶解RNA，并保存于_80°C超低溫冰箱。
[0018]2.cDNA 的合成
利用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit進行cDNA第一條鏈的合成。第一步除去基因組 DNA:取上述提取的 RNA I μ g，5 XgDNA Eraser Buffer 2 μ L, gDNA Eraser Iμ Ld^WRnase Free dH20至10 μ L,輕輕混勻后瞬時離心,42°C條件下反應2 min。第二步為cDNA的合成:在原體系中加入5 XPrimerScript Buffer 2試劑4 μ L, PrimeScriptRT Enzyme Mix I I μ L, RT Primer Mix I μ L,補 RNase Free dH20 至 20 μ L,混勻后瞬時離心,37°C條件下反應15 min,然后升溫至85°C反應5 sec滅活合成酶。合成的cDNA于-20°C保存。
[0019]3.RT-PCR擴增山羊脂聯素基因
利用源自脂肪組織的cDNA為模板進行相關基因的克隆。反應體系為:cDNA模板2 μ L，上下游引物各 0.8 μ L (20 PM), 2 XMaster Mix Taq 酶 10 μ L，加滅菌 ddH20 至 20 μ L。
[0020]4.脂聯素基因的克隆
(I)根據PMD 19-Τ載體使用說明，向1.5 mL離心管加入0.5 μ? PMD 19-T Vector,4.5μ L的PCR回收產物，5 μ L Solut1n I，輕輕混勻，并置于16°C條件下水浴連接5 h。
[0021](2)將感受態細胞從超低溫冰箱中取出后置于冰上慢慢融化，吸取30 μ L感受態細胞與上述連接液混合，輕輕混勻，然后冰浴30 min。
[0022](3) 42°C條件下水浴熱激轉化45 sec，然后冰上放置I?2 min。
[0023](4)向上述混合液中加入37°C預熱的不含抗生素的LB液體培養基800 μ L，置于37°C恒溫搖床(200 r/min)上培養45 min，復蘇感受態細胞。
[0024](5)室溫下4，OOOXg離心10 min，移除650 μ L上清，將剩下的培養基與沉淀吹打混勻，均勻的涂布在含抗生素的LB固體培養基平板上。先正置于37°C培養箱中培養I h,待混合菌液被固體培養基吸收后倒置培養12?16 ho
[0025]脂聯素基因的鑒定及測序待菌落形成后，挑選單個菌落，接種于含有抗生素LB液體培養基中，置于37°C恒溫搖床(200 r/min)上培養6?8 h，待觀測到培養基中形成云霧狀后方可進行菌液檢測。將菌液混勻，吸取菌液I μ L作為DNA模板，并進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖檢測是否為目的條帶。檢測后將含目的條帶的菌液送至上海生工生物技術有限公司測序。
[0026]實施例2:(—)山羊脂聯素蛋白真核表達載體的構建 1.載體構建
(I)利用Primer Premier 5.0軟件分析山羊脂聯素基因⑶S區序列，找到不能酶切該基因CDS區的限制性內切酶，并根據pEGFP-Nl載體所含酶切位點信息確定限制性內切酶Hind III和BamH I。根據酶切位點序列和⑶S區序列信息設計引物擴增山羊脂聯素基因CDS 區，正向引物(Fl):5’ (5，-CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT-3’)和反向引物(Rl):3’(5’ -CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA-3’)。
[0027](2)根據操作說明，酶切pEGFP-Nl載體和山羊脂聯素基因PCR產物。膠回收酶切產物，利用T4 DNA連接酶過夜連接。
[0028](3)將載體轉化到感受態細胞中。
[0029](4)挑選單個菌落，液體培養基擴大繁殖，PCR檢測含目的基因條帶后，將菌液送至上海生工生物技術有限公司測序。
[0030]利用含酶切位點的弓丨物進行PCR擴增山羊脂聯素基因⑶S序列，膠回收PCR產物。限制性內切酶Hind III和BamH I酶切PCR產物和pEGFP-Nl真核表達載體，酶切后凝膠電泳分離后膠回收產物，然后通過T4連接酶將山羊脂聯素基因⑶S區連入pEGFP-Nl載體，轉入感受態細胞中擴繁后測序，得到正確的重組載體，載體長度為5420 bp，結構如圖1。
[0031]實施例3:(—)脂聯素基因對山羊脂肪沉積的作用
1.細胞培養和瞬時轉染
(I)SMSCs以5 X 1VmL密度接種到六孔板中，生長培養基培養，置于37°C，5% CO2條件下培養。
[0032](2)待細胞增殖至貼滿平皿底部80%左右時，將培養基更換為無抗生素培養基1.5mL。
[0033](3)根據轉染試驗說明，分別將10 μ L脂質體和4 μ g質粒室溫孵育在250 μ L低血清、無抗生素培養基中5 min，然后將二者混合，室溫孵育20 min，加入到以上細胞培養基中，輕輕晃動混勻培養基。
[0034](4)轉染6 h后移除原培養基，利用PBS漂洗細胞3次，更換新鮮生長培養基，繼續培養24?36 ho
[0035](5)利用熒光顯微鏡檢測轉染后細胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達量及亞細胞定位結果表明:將SMSCs培養至鋪滿培養皿底80%?90%時進行瞬時轉染，轉染24 h后熒光顯微鏡檢測到綠色熒光，表明重組載體成功的在SMSCs中表達。AdipoQ轉染組與pEGFP-Nl空白對照組熒光比較發現，AdipoQ轉染組綠色熒光只在細胞質中表達，在細胞核中未檢測到。
[0036]2.AdipoQ對脂肪代謝相關基因的表達調控
收集對照組、轉染組細胞各3孔，提取總RNA，檢測合格后反轉錄合成cDNA。利用qPCR檢測AdipoRl、AdipoR2和脂肪酸合成及成脂分化相關基因ACT、FAS, C/EBP a、SREBP-1和PPARy的相對表達量，同樣利用2一的方法分析各個基因的相對表達量。
[0037]qPCR檢測SMSCs中過表達AdipoQ基因后脂肪酸合成及成脂分化相關基因表達量有顯著性變化(試驗樣品重復數為3)，AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因表達量顯著升高，分別升高1.85、4.55、4.88和4.25倍，如圖2 ;而AdipoRl、C/ΕΒΡ α和PPAR Y的表達量無明顯變化，表明AdipoQ基因能上調AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因的表達，如圖2。
【權利要求】
1.一種克隆山羊脂聯素基因編碼區序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所述。
2.山羊脂聯素基因真核重組質粒，其特征在于由序列表中SEQID NO:1所述的山羊脂聯素基因的核苷酸序列和pEGFP-Nl載體構建而成，其中利用帶有保護性堿基、末端分別帶有Hind III和BamH I限制性內切酶酶切位點的引物進行PCR擴增，PCR反應的正、反向引物DNA序列如下所示: 正向引物(Fl): 5- CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT -3 ； 反向引物(R1 ):5- CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA -3。
3.制備如權利要求2所述的真核重組質粒的方法，按照以下步驟: (1)以山羊脂肪組織的cDNA為模板，PCR擴增山羊脂聯素基因的編碼區； (2)用HindIII和BamH I限制性內切酶分別對純化后的山羊脂聯素基因的編碼區和pEGFP-Nl質粒進行雙酶切，用連接酶T4 DNA Ligase進行酶連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，涂布加有Kan抗生素的平板，篩選陽性克隆。
4.依據權利3所述方法獲得的山羊脂聯素基因真核表達載體，在山羊脂聯素蛋白亞細胞定位以及研究山羊脂肪沉積過程中作用的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK104388435SQ201410581934
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】王林杰, 張紅平, 薛科, 李利, 仲濤, 王艷 申請人:四川農業大學