用于檢測鵝細小病毒的lamp引物與試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測鵝細小病毒的LAMP引物與試劑盒及其應用。本發明所提供的用于檢測鵝細小病毒的LAMP引物，為由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成的引物組A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成的引物組B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發明為鵝細小病毒的檢測提供了一個新的技術平臺，可用于畜牧業生產單位篩查和檢測鵝細小病毒，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
【專利說明】用于檢測鵝細小病毒的LAMP引物與試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】中病毒的分子生物學檢測方法，涉及一種用于檢測鵝細 小病毒的LAMP引物與試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 小鵝癌是由鵝細小病毒（Goose parvovirus GPV)引起的雛鵝的一種急性或亞急 性的敗血性傳染病，主要侵害4-20日齡的雛鵝，尤其對10日齡以內的雛鵝具有極強的致 死性。該病的主要特點是嚴重的腸炎、小腸粘膜脫落、壞死，形成特征性的腸內栓塞（急性 型）。由于該病具有傳播速度快、發病率和死亡率高的特點，因而給養殖鵝帶來了嚴重的危 害，多年來一直倍受關注。一般認為，小鵝瘟根據流行病學、臨床特征和剖檢特點，可以做 出初步診斷。但是，最急性型小鵝瘟、小鵝流感、鵝病毒性腸炎以及近年來新發現的鵝副粘 病毒病等疾病均具有相似的臨床和剖檢特征。為此，開展小鵝瘟的實驗室診斷研究具有重 要意義。目前用于小鵝瘟診斷的實驗室方法很多，如病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體技術、 ABC-ELISA試驗和瓊脂擴散試驗等，其中瓊脂擴散試驗簡便、快速，常用于小鵝瘟病毒或血 清的檢查，但是其敏感性較低，很難在臨床上推廣應用。為此，急需建立一種敏感、準確、快 速、簡便的小鵝瘟實驗室診斷方法。雖然基于PCR技術的檢測方法也已建立，但PCR需要昂 貴的儀器，而且操作繁瑣。
[0003] 環介導的等溫核酸擴增技術（LAMP)是由T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiHj et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000 ;28 (12) : 63.)發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴4條特異設計的引物和 一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。 近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Masaki Imai等人（Imai M，Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ;141 (2):173-80.)利用 LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；Nobuyuki Hayashi等人（Hayashi N, Arai R,Tada S,Taguchi H, Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ;24(7-8) :778-85.)針對四種香酒酵母的ITS序列設計了 LAMP特異性引 物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測其它與人類相關的病毒，如病毒性出血 性敗血病（VHS)、巨細胞病毒（CMV)、埃博拉病毒（EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒（EBV)、虹 彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒（IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黃化曲葉病 毒等。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測鵝細小病毒的LAMP專用引物與試劑盒問世。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供一種檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增引物組。
[0005] 本發明所提供的檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增引物組，具體可為引物組A或 引物組B ;
[0006] 所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組 B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；
[0007] 所述引物I (FIP)、所述引物2 (BIP)、所述引物3 (F3)、所述引物4(B3)、所述引物 5 (LF)和所述引物6 (BF)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序 列5和序列6。
[0008] 序列1由43個核苷酸組成，序列2由42個核苷酸組成，序列3由18個核苷酸組 成，序列4由19個核苷酸組成，序列5由20個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑。
[0010] 本發明所提供的檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合 酶、甜菜堿、dNTPs、Mg2+和所述引物組。
[0011] 當所述引物組為所述引物組A時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引 物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶和所述甜菜 喊在所述擴增試劑中的配比為 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :20pmol :20pmol :35nmol : 250nmol ：8U ：20 u mol〇
[0012] 當所述引物組為所述引物組B時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物 4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比 為 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :35nmol :250nmol :8U :20iimol〇
[0013] 在本發明中，所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合 酶大片段。
[0014] 在本發明的一個實施例中，所述檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑組成如 下：每23 iU所述試劑中含有各40pmol的所述引物1和所述引物2、各5pmol的所述引物 3和所述引物4、各20pmol的所述引物5和所述引物6、35nmol的dNTP、250nmol的MgS04、 8U 的 Bst DNA 聚合酶、20 ii mol 的甜菜堿、500nmol 的 Tris .HCl (pH 8. 8)、250nmol 的 KC1、 250nmol 的（NH4)2S04、0. 25iil 的 Tween20 ;余量為水。
[0015] 本發明的第三個目的是提供一種檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑盒。
[0016] 本發明所提供的檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑盒，含有所述的引物組或 所述試劑。
[0017] 所述試劑盒中還可含有熒光顯色劑。
[0018] 所述熒光顯色劑可為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液；所述熒光顯色劑中，所述鈣 黃綠素和所述MnCl2的配比為0. 5mmol : IOmmol。在本發明的一個實施例中，所述突光顯色 劑具體為含有〇. 5mmol/L的鈣黃綠素和lOmmol/L的MnCl2的水溶液。
[0019] 所述試劑盒中還可含有記載有檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒 的環介導等溫擴增方法的說明書；
[0020] 所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒的環介導等溫擴增方法，包 括如下（a)和（b)的步驟：
[0021] (a)以從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，用所述引物組進行環介導等溫擴 增；
[0022] (b)根據步驟（a)的擴增結果，按照如下（bl)或（b2)的方法確定所述待測樣品中 是否含有鵝細小病毒：
[0023] (bl)反應結束后，若所述待測樣品反應液出現白色沉淀物，則所述待測樣品中含 有或候選含有鵝細小病毒；反之，則所述待測樣品不含或候選不含有鵝細小病毒；
[0024] (b2)反應結束后，向所述待測樣品的反應液中加入所述熒光顯色劑，然后觀察所 述反應液的顏色變化；
[0025] 若所述待測樣品反應液為綠色，則所述待測樣品中含有或候選含有鵝細小病毒； 若所述待測樣品反應液為橙色，則所述待測樣品中不含有或候選不含有鵝細小病毒。
[0026] 在本發明中，所述環介導等溫擴增反應具體為63°C -65°C (如65°C )條件下的恒 溫反應60min。
[0027] 在本發明中，進行所述環介導等溫擴增時，所述引物1和所述引物2在反應體系中 的終濃度為I. 6 y M，所述引物3和所述引物4在反應體系中的終濃度為0. 2 y M，所述引物 5和所述引物6在反應體系中的終濃度為0. 8 ii M。所述反應體系具體可由2 ii 1所述基因 組DNA與23 iU所述試劑組成；在所述（b2)中，所述熒光顯色劑與所述待測樣品的反應液 的體積配比具體可為1:25。
[0028] 如下a)或b)的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0029] a)所述的引物組在制備所述試劑或所述試劑盒中的應用；
[0030] b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是 否含有鵝細小病毒的產品中的應用。
[0031] 所述待測樣品可為病毒樣品或鵝囊液等。
[0032] 在本發明中，所述鵝細小病毒具體為鵝細小病毒JLDA株。
[0033] 本發明具有以下優點：
[0034] 1)高特異性：6條引物對鵝細小病毒靶序列的8個特異區域的識別保證了 LAMP擴 增的高度特異性；
[0035] 2)高靈敏度：靈敏度比普通PCR高100倍；
[0036] 3)結果鑒定簡便：可通過肉眼觀察結果（鈣黃綠素顯色），也可以直接用濁度儀判 斷結果；
[0037] 4)操作簡單：只要將檢測樣品（靶核酸）和檢測試劑一起放入63_65°C恒溫水浴 鍋中60分鐘后就可以判斷結果；
[0038] 5)快速、高效擴增：整個LAMP擴增反應一小時內即可完成，能將目標片段擴增 IO8-IO9 倍。
[0039] 綜上所述，本發明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到鵝 細小病毒，不需要復雜儀器，為鵝細小病毒的檢測提供了一個新的技術平臺，可用于畜牧業 生產單位篩查和檢測鵝細小病毒，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范 圍推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040] 圖1為5套引物組合的LAMP擴增曲線。
[0041] 圖2為本發明鵝細小病毒LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0042] 圖3為本發明鵝細小病毒LAMP檢測方法特異性的鈣黃綠素指示劑染色檢測結果。
[0043] 圖4為本發明鵝細小病毒LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。
[0044] 圖5為本發明鵝細小病毒LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素指示劑染色檢測結果。
[0045] 圖6為本發明鵝細小病毒LAMP檢測方法靈敏度的PCR檢測結果。目標片段為 209bp，DNA Marker 為 D2000。
【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0048] 鵝細小病毒JLDA株：記載于"李琳，王楠，邵洪澤等.鵝細小病毒JLDA株主要 結構蛋白VP3基因的克隆及序列分析比較.上海畜牧獸醫通訊，2009年06期"一文，公眾 可從吉林省畜牧獸醫科學研究院獲得。
[0049] 實施例1、檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增引物的設計與合成
[0050] 從美國基因數據庫檢索獲得鵝細小病毒序列（GenBank Accession No. U25749), 通過BLAST軟件進行同源性分析，獲得鵝細小病毒的特異性保守靶序列，再根據該保守靶 DNA序列，用軟件Primer design V4設計用于對鵝細小病毒進行LAMP檢測的引物，設計出 5套引物（GV-0、GV-1、GV-4、GV-5、GV-6)，經過實驗對比，最終選取了由6條引物組成的引 物組合GV-1，引物序列如表1所示。
[0051] 表1檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增引物
【權利要求】
1. 檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增引物組，為引物組A或引物組B ;所述引物組A由 引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物 2、所述引物3和所述引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序 列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2. 檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dNTPs、 Mg2+和權利要求1或2所述的引物組。
3. 根據權利要求3所述的試劑，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述 引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶和所述甜 菜喊在所述擴增試劑中的配比為 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :20pmol :20pmol :35nmol : 250nmol :8U :20iimol ;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換 型DNA聚合酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol :40pmol :5pmol :5pmol : 35nmol :250nmol :8U:20umol〇
4. 根據權利要求3所述的試劑，其特征在于：所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚 合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
5. 檢測鵝細小病毒的環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有權利要求 1所述的引物組，或權利要求2-4中任一所述的試劑。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括熒光顯色劑。
7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和 MnCl2的水溶液； 所述突光顯色劑中，所述I丐黃綠素和所述MnCl2的配比為0. 5mmol :10mmol。
8. 根據權利要求5-7中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有記載有 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒的環介導等溫擴增方法的說明書； 所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒的環介導等溫擴增方法，包括如 下（a)和（b)的步驟： (a) 以從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，用權利要求1所述引物組進行環介導等 溫擴增； (b) 根據步驟（a)的擴增結果，按照如下（bl)或（b2)的方法確定所述待測樣品中是否 含有鵝細小病毒： (bl)反應結束后，若所述待測樣品反應液出現白色沉淀物，則所述待測樣品中含有或 候選含有鵝細小病毒；反之，則所述待測樣品不含或候選不含有鵝細小病毒； (b2)反應結束后，向所述待測樣品的反應液中加入權利要求7中所述的熒光顯色劑， 然后觀察所述反應液的顏色變化； 若所述待測樣品反應液為綠色，則所述待測樣品中含有或候選含有鵝細小病毒；若所 述待測樣品反應液為橙色，則所述待測樣品中不含有或候選不含有鵝細小病毒。
9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述錄環介導等溫擴增反應為63-65°C 條件下的恒溫反應60min。
10. 如下a)或b)的應用： a) 權利要求1所述的引物組在制備權利要求2-4中任一所述試劑或權利要求5-9中任 一所述試劑盒中的應用； b) 權利要求1所述的引物組，或權利要求2-4中任一所述的試劑，或權利要求5-9中任 一所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒的產品中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450965SQ201410736708
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】邵洪澤, 程榮華, 呼延含蓉, 李奉京 申請人:吉林省畜牧獸醫科學研究院, 北京藍譜生物技術開發有限公司