專利名稱：用蠶表達丙肝抗原制備口服藥物的方法
技術領域：
本發明屬生物技術制藥工程中的基因工程生產多肽類藥物技術領域。
全世界約1％人口感染丙型肝炎病毒(HCV)，約50％以上的慢性肝炎是由HCV感染引起的，世界各地的流行病學研究表明，大約90％的輸血后肝炎均由HCV引起，HCV是一種十分嚴重的肝病，是誘發肝硬化、肝癌的重要因素。目前，我國丙肝感染者約有3000萬人，還有上升的趨勢。
70年代初期，美國首先發現輸血后肝炎病例，既非甲肝亦非乙肝，英國發生因注射血友病因子Ⅷ濃縮劑或血透后此類肝炎的持續暴發。1975年Feinsten等首先證實這種肝炎為非甲非乙型肝炎，即丙肝(HCV)的存在。1989年，Kuo和Choo等用酵母來表達HCV的cDNA片段，與HCV病人的血清進行反應來篩選HCV抗原，發現表達產物能與HCV抗體反應，從而捕獲到能表達HCV抗原的cDNA克隆，并與人體基因組和甲肝(HAV)和乙肝(HBV)沒有交叉雜交。Choo和Kuo等同年用隨機引物法建立了HCV的全cDNA文庫，用HCV血清來篩選抗原，獲得一個互補的DNA克隆，并能編碼HCV抗原，證明HCV基因組為一個RNA片段，大小約10000個堿基，為正鏈RNA。從此揭開了HCV分子生物學研究的序幕。因為HCV在血液中含量極少，而且無法通過細胞培養獲得，所以它是完全依賴于基因工程技術來研究的人類病毒之一，Reyes等1990年從慢性肝炎獼猴的血清中獲得一個長為7.5Kb RNA片段，經反轉錄合成cDNA，經氨基酸功能分析認為其功能RNA聚合酶，并確認其來源于HCV RNA。Takamigawa等1991年報道了日本的HCV基因全序列，長為9416bp，編碼一個為3010個氨基酸的大蛋白，5’端的調控序列為332個核苷酸，3’端調控序列為54個核苷酸，該HCV株與Choo報道的HCV株的核苷酸同源性為77％，并與黃病毒相似，大蛋白成熟后可形成C、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b和NS5a和NS5b等成份。其中C為外殼蛋白，E為囊膜蛋白，NS為非結構蛋白。HCV存在地區差異，并具有高度變異的特性，所以形成各個亞型。Simmonds等1993年和Mellor等1995年根據HCV基因型和NS5區的系統發生將HCV分成6個亞型。認為兩者之間核苷酸相差68-79％者為亞型標準。畢勝利等報道中國HCV河北株的全序列與日本相似。河北株和臺北株系，大小分別為9375bp和9425bp，屬于第Ⅱ亞型。
C蛋白為21kD,E1為31kD,E2為70kD,NS2為23kD,NS3為70kD,NS4a為8kD,NS4b為27kD,NS5a為58kD,NS5b為68kD,HCV抗血清中還存在E2-NS2聯合蛋白，分子量約在82至83kD。
綜上所述，由于HCV的多變性，因此預防HCV，研制HCV疫苗相當困難，至今還未能成功的實例。
本發明的目的是提供一種以家蠶為生物反應器，高效表達丙肝病毒的結構基因，制備口服疫苗的方法。
本發明所述的方法以家蠶作為生物反應器，通過家蠶核型多角體病毒表達系統重組帶有人的丙型肝炎病毒基因，獲得重組的帶丙型肝炎病結構基因的家蠶核型多角體病毒，接種家蠶幼蟲、蛹和蛾進行表達，經分離純化，冷凍干燥，以家蠶血液或蛹為填充料配制成口服防治丙肝肝炎的藥物。
PCR方法合成的丙肝基因片段為C+E1+E2，克隆進入pUC19的SmaⅠ位點，獲得重組克隆pUCVCE，基因長為2430bp，克隆進入到pUBM-4載體中，在BmNPV多角體啟動子的直接控制下，與野生病毒DNA進行共轉染，通過重組空斑挑選得重組家蠶核型多角體病毒，表達量為0.5mg/蠶，0.6mg/蛹。
接種重組病毒于家蠶幼蟲、蛹、蛾的高效表達丙型肝炎結構蛋白，經過分子篩和MonoQ純化的含量為80％，分子量分別為75kD和50kD。
下面結合實施例詳細描述本發明的內容用兩個特異性的引物，我們擴增了河北株HCV的C+E1+E2基因，大小約2430bp。并克隆到pUC19中，重組質粒稱為pUHCVCE。將重組質粒pUHCVCE進行亞克隆，并測定了全序列，序列與畢勝利報道的同源性為97％(PCR及測序技術方法詳見《分子克隆》，科學出版社，1995)。將所獲得的基因克隆到家蠶表達載體pUBM-4(申請人自行構建，病毒學報，1993)的EcoRⅤ和BglⅡ位點，與野生型病毒共轉染，在家蠶Bm-N細胞中進行重組(病毒重組技術按Summers等方法，Texas Agricultural Experimenl Station,USA1987)。
經過12輪重組篩選，ELISA鑒定證明純化的病毒已表達了C+E1+E2基因。PCR檢測的結果，說明重組病毒已帶有丙肝的C+E1+E2外源基因。該重組病毒稱之為BmNPV(C+E)。
以不同量的合成肽(22肽RRGPRLGVRAPRKTSERSQPRG)。確定能抑制≥50％0.D.值作相對比較，估算抗原表達量，結果表明蛹體在感染72h后有較高的表達量。隨著感染時間的延長，表達量平衡稍有降低。以72h樣品經1∶10稀釋后相當于肽20μg/ml抑制的O.D.值來計算，表達量為20-200μg/ml，則每蛹體表達量推算為60-600μg/ml。蠶的最高表達時間為4-5天，表達量為100-500μg/蠶。
用3萬頭五齡起蠶，每頭人工接種重組病毒使之發病，5天后收集蠶血清共20000ml，每瓶500ml貯存于-20℃。
蠶血清先經5000rpm離心1小時，取上清在25000rpm離心30分鐘，經硫酸銨沉淀后上Sephadex G100柱分離，每次收集樣品均經ELISA測活，確定其活性存在，并通過陰陽性血清分別測定，篩選活性峰。
將過Sephadex G100柱的活性部分混合后，上MonoQ柱(高25cmφ=1cm)，流速0.5ml/分鐘，5ml/管收集。先用20mM Tris-HCl,pH7.5緩沖液淋洗，當沒有蛋白被洗脫下來時，再用75ml pH7.5 20mM Tris-HCl緩沖液+75ml含1M NaCl的緩沖液進行線性梯度洗脫。據計算及ELISA結果產物的純度在80％左右。在蠶、蛹、蛾中表達的丙肝抗原，經過過濾(100KD超濾)，30000rpm離心后經冷凍干燥后，在無菌條件下裝入膠囊制成口服藥物。
采用本發明所述方法制備的丙肝抗原口服藥物(簡稱BHC)，其藥效如下將BHC(含量2ml)給藥8周齡SD大鼠，每只SD大鼠平均體重為200g，連續給藥4周，采血后用HCV抗體檢測試劑盒測抗體(檢測方法按上海復華公司試劑盒操作說明書進行)，檢測的結果如表1、表2所示。結果表明鼠體內產生了較強的抗體。
表1給藥BHC后4周SD大鼠血的HCV抗體水平檢測
表2給藥BHC后4周SD大鼠的HCV抗體水平檢測
將4周齡，平均體重16～18g的BalB/C小鼠，雌雄各半，每天給藥(含量500μl)連續4周，每天一次4周后采血，用HCV抗體檢測試劑盒檢測結果如表3所示(檢測方法按衛生部蘭州生物制品研究所生產的試劑盒說明書進行)，結果表明雌雄個體80％以上均產生了較強的抗體水平，相當于丙肝感染者的抗體水平，說明BHC口服劑型的HCV抗原可以通過腸道被老鼠吸收，并具有抗原活性，能在體內產生較強的抗體，產生了免疫應答。
表3
檢測條件酶標板為已包被好的標準丙肝測活板，一抗稀釋度為1∶100，二抗稀釋度為1∶3000，底物為鄰苯二胺，以稀釋液作對照、檢測時間96.10.7。機型5001型酶標儀本發明所述的丙肝口服藥物的方法與現有技術相比，原料易得，生產成本低，具有良好的預防丙型肝炎療效，具有十分重大的市場開發應用前景。
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1．一種用蠶表達丙肝病毒蛋白制備口服藥物的方法，其特征在于以家蠶幼蟲、蛹和蛾作為生物反應器，將人的丙型肝炎病毒基因重組進入家蠶核型多角體病毒表達系統，獲得重組的帶丙型肝炎病毒結構基因的家蠶核型多角體病毒，接種家蠶幼蟲、蛹和蛾進行表達，所獲得的表達產物經分離純化，冷凍干燥，以家蠶血液、蛹和蛾為填充料配制成口服防治丙型肝炎的藥物或純化產物制成注射藥物。
2．根據權利要求1，所述的方法，其特征在于將PCR方法合成的丙肝C+E1+E2基因片段，克隆進入pUC19的SmaⅠ位點，獲得重組克隆pUCVCE，基因長為2430bp，克隆進入到pUBM-4載體中，在BmNPV多角體啟動子的直接控制下，與野生病毒DNA進行共轉染，通過重組空斑挑選得重組家蠶核型多角體病毒。
3．根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于接種重組病毒于家蠶幼蟲、蛹、蛾的高效表達丙型肝炎病毒結構蛋白，經過分子篩和MonoQ純化的含量為80％，分子量分別為75kD和50kD。
4．根據權利要求1、2、3，表達所生產的丙型肝炎病毒蛋白，與家蠶血液、蛹和蛾的主要成分，經冷凍干燥后，制成膠囊或片劑經鈷60滅菌，成為防治丙型肝炎的藥物或疫苗。
5．根據權利要求1、2、3、4，本專利應包括任何其它途徑所獲得的丙肝抗原制成口服藥物或疫苗的途徑。
全文摘要
本發明屬于生物技術制藥工程中的基因工程生產多肽類藥物技術領域。以家蠶幼蟲、蛹和蛾作為生物反應器,通過家蠶核型多角體病毒表達系統重組帶有人的丙型肝炎病毒基因,將獲得的重組病毒,接種家蠶幼蟲、蛹和蛾進行表達,經分離純化,冷凍干燥,制成口服預防丙型肝炎的藥物,首次實現丙肝抗原口服藥物的發明。與現有技術相比,原料易得,生產成本低,預防效果良好,具有十分重大的市場開發應用前景。
文檔編號C12N15/51GK1218691SQ9812461
公開日1999年6月9日 申請日期1998年10月29日 優先權日1997年11月5日
發明者張耀洲, 吳祥甫, 杜廣希 申請人:浙江農業大學, 中國科學院上海生物化學研究所, 浙江海寧絲綢集團有限責任公司